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Isolation and Identification of Virus dsrna from Strawberry Plants

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Agricultural Sciences in China 2007年第1期6卷 86-93页

作者： LI He DAI Hong-yan ZHANG Zhi-hong GAO Xiu-yan DU Guo-dong ZHANG Xin-yu College of Horticulture Shenyang Agricultural University Shenyang 110161 P.R.China

The analysis of virus genome is based on nucleic acid isolation. The aims of this study were to develop a method for isolation and identification of virus double-stranded ribonucleic acid （dsrna） and to elucidate the nucleotide sequences of strawberry virus. Using the modified method, virus dsrna was extracted from strawberry virus indicator plants and cultivated strawberry plants and detected using agarose gel electrophoresis with ethidium bromide staining and reverse transcription-polymerase chain reaction （RT-PCR）. The quantity of virus dsrna varied among strawberry cultivars. The quantity of dsrna from in vitro plantlets was higher than that from the young leaves of field plants. For the field-grown plants, there was more dsrna in the young leaves. Virus dsrna extracted from strawberry plants was resistant to deoxyribonuclease Ⅰ （DNase Ⅰ）, but evidently, it became resistant to ribonuclease A （RNase A） only in the presence of 0.5 M NaCl. Its bands in agarose gel could be readily recycled using an agarose gel DNA purification kit. With RT-PCR, the segments of both strawberry mottle virus and Strawberry mild yellow edge virus genomes were amplified by using the virus dsrna recycled from gel or treated with DNase Ⅰ /RNase A as templates. The system developed for dsrna isolation and identification in strawberry plants laid a sound foundation for the work on genome analysis of strawberry virus isolates in China.

关键词： dsrna virus strawberry isolation RT-PCR

dsrna对家蚕核多角体病毒(BmNPV)复制的抑制作用

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科学通报 2004年第11期49卷 1073-1078页

作者：徐颖朱成钢金勇丰张耀洲浙江大学生物化学研究所杭州310029 浙江理工大学生物化学研究所杭州310018

以BmNPV复制必需的DNA解旋酶基因和DNA聚合酶基因为靶序列，人工设计并合成了长度分别为435(Ap1)，300(Ap2)和399bp(AH)的dsrnas，利用TransMessenger^TM Transfection Reagent转染家蚕细胞，研究其对BmNPV复制的抑制效果．结果表明，... 详细信息

以BmNPV复制必需的DNA解旋酶基因和DNA聚合酶基因为靶序列，人工设计并合成了长度分别为435(Ap1)，300(Ap2)和399bp(AH)的dsrnas，利用TransMessenger^TM Transfection Reagent转染家蚕细胞，研究其对BmNPV复制的抑制效果．结果表明，在野生型病毒BmNPV感染家蚕细胞实验中，Ap2和AH这2个dsrna能够有效地抑制病毒DNA的复制，并且在转染dsrna后第4天抑制效果最佳，它们使病毒滴度(PFU／mL值)降低了10^3～10^4，而另外的dsrna(Ap1)没有明显的抑制效果．RT—PCR和DNA斑点杂交也证实了2种目的基因的表达水平和病毒DNA的量发生了明显的下调．此外，用荧光显微镜观察dsrna在细胞内的定位，发现在转染24h后dsrna开始在细胞核的周围呈不连续的聚集状态。

关键词： BmNPV RNAi dsrna 复制抑制家蚕核多角体病毒

RNA病毒阻断RIG-I样受体识别dsrna机制研究进展

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病毒学报 2014年第6期30卷 704-712页

作者：王国庆朱紫祥曹伟军刘磊郑海学中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室国家口蹄疫参考实验室兰州730046 甘肃农业大学动物医学院兰州730070

RIG-I样受体(RIG-I-like receptors,RLRs)是一类重要的模式识别受体,其在机体抵抗病毒感染过程中发挥着至关重要的作用。RLRs通过级联放大效应,诱导I型干扰素的表达,激活干扰素通路,最终发挥抗病毒效应。而病毒为了自身长期的生存和繁殖... 详细信息

RIG-I样受体(RIG-I-like receptors,RLRs)是一类重要的模式识别受体,其在机体抵抗病毒感染过程中发挥着至关重要的作用。RLRs通过级联放大效应,诱导I型干扰素的表达,激活干扰素通路,最终发挥抗病毒效应。而病毒为了自身长期的生存和繁殖,在长期的进化和演化过程中,不断的与机体免疫系统进行着抗衡和斗争,由此演化出了一系列的拮抗策略。RLRs主要识别5′端带有三磷酸基团的RNA(包括单链和双链RNA)和双链RNA,其在启动免疫应答过程中可以通过与病毒RNA结合而得以激活,然后招募下游分子,激活整个通路的信号转导。病毒为了阻断RLRs对病毒RNA的识别,拮抗RLRs通路的激活,进化出了非常精细的对抗策略,主要分为:躲避、伪装和攻击三种策略。了解清楚病毒拮抗RLRs抗病毒的分子机制对于研制新的抗病毒药物及发展新的抗病毒策略具有深远意义。本文主要对RNA病毒阻断RLRs识别dsrna机制的研究进展进行综述。希望为研究不同RNA病毒拮抗RLRs分子机制提供一定的参考和依据。

关键词： RIG-I样受体 dsrna RNA病毒拮抗作用

我国苹果斑点落叶病菌携带dsrna分析及一种dsrna病毒的鉴定

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中国农业科学 2021年第22期54卷 4787-4799页

作者：曹钰晗李紫腾张静怡张静娜胡同乐王树桐王亚南曹克强河北农业大学植物保护学院

【目的】苹果斑点落叶病在我国各苹果主产区均有发生,给苹果产业造成了严重的经济损失。苹果斑点落叶病是由链格孢苹果专化型(Alternaria alternata f. sp. mali)侵染引起的一种气传病害。本研究旨在探明我国苹果斑点落叶病菌携带dsrna... 详细信息

【目的】苹果斑点落叶病在我国各苹果主产区均有发生,给苹果产业造成了严重的经济损失。苹果斑点落叶病是由链格孢苹果专化型(Alternaria alternata f. sp. mali)侵染引起的一种气传病害。本研究旨在探明我国苹果斑点落叶病菌携带dsrna的情况,为田间防治斑点落叶病提供新的生防资源,并为病毒的多样性以及进化研究提供新的认识。【方法】从全国8个省份采集有典型症状的组织样本,通过组织分离和单孢分离法获得纯培养;通过dsrna的提取及凝胶电泳明确我国苹果斑点落叶病菌携带dsrna的情况;通过菌株培养特性、菌丝生长速率、在果实及叶片上的致病力测定揭示携带dsrna病原菌的生物学性状;通过高通量测序技术、分子克隆技术对QY-2菌株携带的dsrna病毒进行全基因组序列、基因组结构和系统进化分析。【结果】自我国苹果产区获得102株苹果斑点落叶病菌菌株的纯培养,通过dsrna的提取及凝胶电泳明确了5个菌株带有明显的dsrna条带,携带的dsrna分为4种类型,类型Ⅰ(菌株YT-3-7)dsrna在8、2.5和1.5 kb左右;类型Ⅱ(菌株SJZ-4)dsrna在8 kb左右;类型Ⅲ(菌株QY-2)dsrna在3和0.8 kb左右;类型Ⅳ(菌株CL-2-6和SQ-1-1)dsrna在2.5和1.5 kb左右。含有dsrna的菌株培养性状多样,菌落特征、生长速率与dsrna携带与否及类型没有明显的关系,含有dsrna的菌株大多属于弱致病力菌株。QY-2在叶片和果实上的致病力均最弱,确定其携带的dsrna病毒基因组包括5个dsrna片段,分别为dsrna1—dsrna5,片段大小依次为3 665、3 054、2 824、2 819、831 nt,提交至GenBank,登录号分别为MK672910、MK672913、MK672912、MK672911、MK836314。编码蛋白的分子量依次为124、83、84、83、13 kD。经系统进化关系分析,与Alternaria alternata chrysovirus 1遗传关系最近,确定其为产黄青霉病毒科(Chrysoviridae)、β产黄青霉病毒属(Betachrysovirus)的Alternaria alternata chrysovirus,暂定命名为Alternaria alternata chrysovirus 2(AaCV2)。【结论】我国苹果斑点落叶病菌携带dsrna群体多样,dsrna的有无及类型与寄主病原菌培养性状没有明显相关性,携带dsrna的菌株多为弱致病力菌株,致病力最低的QY-2菌株携带AaCV2。该菌株的弱致病力可能具有潜在的应用价值,可为苹果斑点落叶病提供新的生防资源。

关键词：苹果斑点落叶病链格孢苹果专化型 dsrna 生物学性状致病力生物防治

dsrna对X射线照射小鼠脾细胞增殖反应和UDS的影响

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中华放射医学与防护杂志 1996年第4期16卷 246-250页

作者：田生礼丛宪玲王献理白求恩医科大学预防医学院

本文报道了不同浓度ｄｓＲＮＡ对１．５ＧｙＸ射线照射后小鼠脾细胞对ＣｏｎＡ和ＬＰＳ诱导增殖反应和ＵＤＳ的影响。结果表明，当受照小鼠皮下注射ＲＮＡ浓度大于６．２５ｍｇ／ｋｇ体重时与单纯照射组相比脾细胞对ＣｏｎＡ和ＬＰＳ诱... 详细信息

本文报道了不同浓度ｄｓＲＮＡ对１．５ＧｙＸ射线照射后小鼠脾细胞对ＣｏｎＡ和ＬＰＳ诱导增殖反应和ＵＤＳ的影响。结果表明，当受照小鼠皮下注射ＲＮＡ浓度大于６．２５ｍｇ／ｋｇ体重时与单纯照射组相比脾细胞对ＣｏｎＡ和ＬＰＳ诱导的增殖反应明显增强（Ｐ＜０．０５），ＵＤＳ亦明显的增加（Ｐ＜０．０５）。提示，ｄｓＲＮＡ可以增强受照细胞对ＣｏｎＡ和ＬＰＳ诱导的增殖反应能力，并能抑制Ｘ射线诱发程序外ＤＮＡ合成的下降。

关键词： dsrna X线脾细胞增殖 UDS

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细菌表达dsrna抗马铃薯甲虫

植物保护学报 2019年第6期46卷 1379-1380页

作者：何弯弯许文博徐世静卢欢张江湖北大学生命科学学院

马铃箸甲虫Leptinotarsa decemlineata是国际上公认的一种马铃薯毁灭性检疫害虫,起源于墨西哥,寄主主要包括马铃薯、刺萼龙葵、茄子等茄科植物。20世纪90年代传人我国并被列为重要外来入侵物种之一,在生物防治研究领域引起了极大的关注。

关键词：生物防治研究刺萼龙葵茄科植物马铃薯甲虫外来入侵物种检疫害虫细菌表达 dsrna

白蜡虫ws基因RNAi载体构建及原核表达dsrna

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林业科学研究 2018年第4期31卷 70-74页

作者：王雪庆赵遵岭孙涛陈晓鸣杨璞中国林业科学研究院资源昆虫研究所国家林业局资源昆虫培育与利用重点实验室云南昆明650224

[目的]构建白蜡虫(Ericerus pela)蜡酯合酶(wax synthase,WS)基因干扰载体并建立其体外dsrna(doublestranded RNA,dsrna)原核表达体系,低成本大量制备白蜡虫ws基因的dsrna。[方法]克隆白蜡虫蜡酯合酶基因ws片段,连入L4440载体,将重组质... 详细信息

[目的]构建白蜡虫(Ericerus pela)蜡酯合酶(wax synthase,WS)基因干扰载体并建立其体外dsrna(doublestranded RNA,dsrna)原核表达体系,低成本大量制备白蜡虫ws基因的dsrna。[方法]克隆白蜡虫蜡酯合酶基因ws片段,连入L4440载体,将重组质粒转入大肠杆菌HT115感受态细胞,经IPTG诱导获得与目的片段相对应的dsrna。[结果]白蜡虫ws基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)载体成功构建,重组质粒转入HT115感受态细胞经IPTG诱导后菌体成功表达dsrna,dsrna的平均获得量1 705 ng·m L^(-1)。[结论]该研究通过原核表达白蜡虫ws基因的dsrna,为后续利用RNAi实验研究白蜡虫ws基因功能及作用机理奠定基础。

关键词：白蜡虫 WS L4440 原核表达 dsrna

高效靶向降解烟草花叶病毒核酸的dsrna筛选与大量制备

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中国农业科学 2021年第6期54卷 1143-1153页

作者：徐翔解屹宋丽云申莉莉李莹王勇刘明宏刘东阳王小彦赵存孝王凤龙杨金广中国农业科学院烟草研究所四川省烟草公司凉山州公司贵州省烟草公司遵义市公司甘肃省烟草公司庆阳市公司

【目的】筛选高效靶向降解烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,TMV)的dsrna,实现其大量制备,并探究其作用机制。【方法】以TMV编码的CP、MP、RdRP功能基因为靶序列,体外转录合成相应的dsrna,浸润本氏烟(Nicotiana benthamiana),24 h后接... 详细信息

【目的】筛选高效靶向降解烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,TMV)的dsrna,实现其大量制备,并探究其作用机制。【方法】以TMV编码的CP、MP、RdRP功能基因为靶序列,体外转录合成相应的dsrna,浸润本氏烟(Nicotiana benthamiana),24 h后接种TMV,于接毒后2、3 d取样提取总RNA和蛋白质,以CP基因mRNA水平和蛋白水平为指标,结合TMV病毒生物学症状,综合评价各dsrna对TMV的抑制效果。同时结合侵染性克隆TMV-30B在本氏烟烟株上的荧光表达现象和TMV在三生烟(Nicotiana tabacum var. Samsun NN)上的过敏性坏死反应(hypersensitive necrosis reaction),通过比较TMV基因组上6个靶序列相对应的dsrna,筛选出高效抑制TMV的dsrna片段。为了获取大量的dsrna,将dsrna对应的基因片段插入到原核表达载体L4440的双T7启动子之间,转化至RNase III缺陷型大肠杆菌(Escherichia coli)HT115(DE3)中,并对原核表达制备的dsrna喷施烟草后生成的siRNA进行深度测序,比较外源施用dsrna后,对TMV侵染的small RNA表达特征和富集带的影响。【结果】筛选出高效影响TMV CP基因表达的dsrna RdRP1461-1774,并构建了可诱导形成目的 dsrna的原核表达载体L4440-dsRdRP1461-1774,可在DE3中大量制备RdRP1461-1774的dsrna,菌液中提取的dsrna喷施于烟草上对TMV的防治效果显著。TMV-30B侵染本氏烟时荧光数量减少,并能够延长叶片萎蔫时间,在三生烟上施用时叶片枯斑数量明显减少。小RNA测序结果显示TMV侵染引起的RNAi过程中正义链和反义链以大致相等的频率产生siRNA,而外源性dsrna的浸润会引起靶向区域siRNA的富集,siRNA反义链累积量骤增,对应的正义链累积量骤减,外源dsrna的施用能够引起siRNA表达丰度的变化。【结论】通过比较dsrna介导植物靶向抗TMV侵染的效果来筛选抗烟草花叶病毒的dsrna序列,最终选定TMV RdRP基因上一段长313 bp的高效作用片段,该片段dsrna能够高效与靶基因结合,降低染病植株烟草花叶病毒的表达量。同时构建了RdRP1461-1774基因的dsrna原核表达系统,实现其低成本的高效量产,为后续dsrna在植物病毒方面的防治应用打下了基础。

关键词：烟草花叶病毒 RNA干扰 dsrna small RNA测序原核表达

dsrna阻断大鼠骨髓源性神经干细胞Hes5表达的实验研究

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第一军医大学学报 2004年第1期24卷 35-38,41页

作者：王海燕徐如祥姜晓丹罗深秋第一军医大学珠江医院全军神经医学研究所广东广州510282 第一军医大学细胞生物学教研室学广东广州510515

目的观察外源性短双链RNA(dsrna)在转录后水平即mRNA水平降低基因表达的效率，并对其影响因素进行初步探讨。方法将体外分离培养的大鼠骨髓基质细胞，通过由本实验室配制的特殊培养基诱导成神经干细胞，应用人工合成的dsrna于不同浓... 详细信息

目的观察外源性短双链RNA(dsrna)在转录后水平即mRNA水平降低基因表达的效率，并对其影响因素进行初步探讨。方法将体外分离培养的大鼠骨髓基质细胞，通过由本实验室配制的特殊培养基诱导成神经干细胞，应用人工合成的dsrna于不同浓度转染神经干细胞，Western bloting检测dsrna是否能阻断转录因子Hes5的表达，0．5％锥虫蓝法测定各浓度组中培养细胞活力。结果 200、300nmol／L浓度的dsrna能特异有效地阻断Hes5的表达，而50～200nmol／L浓度的dsrna有利于干细胞存活。结论 dsrna能在神经干细胞内启动RNA干扰作用，适宜浓度的dsrna能在特异有效地阻断内源性基因的表达的同时，最大限度地保持细胞活力。

关键词： dsrna 大鼠骨髓源性神经干细胞 Hes5 实验外源性短双链RNA 基因表达