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Construction of a der p2-transgenic plant for the alleviation of airway inflammation

Cellular & Molecular Immunology 2011年第5期8卷 404-414页

作者： CC Lee H Ho KT Lee ST Jeng BL Chiang Department of Microbiology and Immunology School of MedicineChina Medical UniversityTaichungTaiwan Graduate Institute of Immunology College of MedicineTaipeiTaiwan Institute of Microbiology and Biochemistry TaipeiTaiwan Institute of plant Biology College of Life ScienceNational Taiwan UniversityTaipeiTaiwan Allergy Center TaipeiTaiwan Department of pediatrics National Taiwan University HospitalTaipeiTaiwan Graduate Institute of Clinical Medicine TaipeiTaiwan

In clinical therapy,the amount of antigen administered to achieve oral tolerance for allergic diseases is large,and the cost is a major *** this study,we used tobacco plants to develop a large-scale protein production system for allergen-specific immunotherapy,and we investigated the mechanisms of oral tolerance induced by a transgenic plant-derived *** used plants(tobacco leaves)transgenic for the dermatophagoides pteronyssinus 2(der p2)antigen to produce der *** received total protein extract from der p2 orally once per day over 6 days(days 0–2 and days 6–8).Mice were also sensitized and challenged with yeast-derived recombinant der p2(rder p2),after which the mice were examined for airway hyper-responsiveness and airway *** sensitization and challenge with rder p2,mice that were fed with total protein extracted from transgenic plants showed decreases in serum der p2-specific IgE and IgG1 titers,decreased IL-5 and eotaxin levels in bronchial alveolar lavage fluid,and eosinophil infiltration in the *** addition,hyper-responsiveness was also decreased in mice that were fed with total protein extracted from transgenic plants,and CD4^(+)CD25^(+)Foxp3^(+) regulatory T cells were significantly increased in mediastinal and mesenteric lymph ***,splenocytes isolated from transgenic plant protein-fed mice exhibited decreased proliferation and increased IL-10 secretion after stimulation with rder *** data here suggest that allergen-expressing transgenic plants could be used for therapeutic purposes for allergic diseases.

关键词： asthma der p2 IL-10 oral tolerance transgenic plant

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抗生素预处理后口服der p2重组耻垢分枝杆菌调节免疫应答的研究

抗生素预处理后口服Der p2重组耻垢分枝杆菌调节免疫应答的研究

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作者：侯美娜第四军医大学

学位级别：硕士

背景哮喘是一种全球范围内的发病率和死亡率逐渐上升的慢性疾病，严重威胁人类健康，降低患者生活质量，给病人及社会造成了巨大的经济负担。哮喘被认为是具有一定遗传学基础的个体，受环境中过敏原反复刺激导致体内免疫紊乱，以呼吸... 详细信息

背景哮喘是一种全球范围内的发病率和死亡率逐渐上升的慢性疾病，严重威胁人类健康，降低患者生活质量，给病人及社会造成了巨大的经济负担。哮喘被认为是具有一定遗传学基础的个体，受环境中过敏原反复刺激导致体内免疫紊乱，以呼吸道慢性炎症和一系列临床症状为表现的一种病理状态。Th2优势的Th1/Th2平衡紊乱是过敏性哮喘的免疫学本质。而许多研究证明分枝杆菌采用多种免疫途径均可调节Th1/Th2平衡。本研究小组前期构建了derp2-rBCG，经口服接种免疫小鼠可诱导derp2特异性的Th1优势免疫应答。因分枝杆菌不是肠道固有菌，很难在肠道粘附定植，免疫效果不佳，而加大剂量则会引起肠道菌群失调和口咽部感染。研究发现肠道正常菌群能够竞争性抑制并排斥外来细菌的粘附和定植，起到一种生物屏障的作用。因此我们设想利用抗生素破坏这种生物屏障，从而提高分枝杆菌与肠道黏膜的亲和力进而增强其免疫调节作用。目的 1.利用电穿孔技术，构建以胞壁形式表达屋尘螨抗原derp2的重组耻垢分枝杆菌疫苗pCW-derp2-rMS。 2.给小鼠饮用低浓度抗生素溶液，观察其对肠道细菌数的影响，探索使用抗生素减少肠道菌群又不引起肠道菌群失调的最佳用药时间。 3.小鼠饮用抗生素溶液处理后，分别给予灌胃口服MS和pCW-derp2-rMS免疫，比较两者对Th细胞免疫应答的调节。实验方法和结果 ***2-rMS的构建及鉴定采用电穿孔技术，将鉴定好的derp2质粒转化到耻垢分枝杆菌(MS)，经潮霉素抗性筛选rMS阳性克隆，通过pCR特异性扩增目的基因片段，鉴定目的基因在rMS中的表达，证实derp2质粒成功转化入MS，构建了以胞壁形式表达外源蛋白的重组耻垢分枝杆菌（pCW-derp2-rMS）。 2.口服抗生素对肠道菌群的影响小鼠在SpF级别饲养环境下，分别给予10％蔗糖(Suc)溶液、终浓度2mg/ml替硝唑(Tin)溶液、终浓度5mg/ml氨苄青霉素(Amp)溶液饮用，连续7天。分别在第3、5、7天处死部分小鼠，无菌状态下取小鼠回盲部肠内容物，匀浆稀释后涂LB琼脂培养基和BHI琼脂培养基平板(简易厌氧环境中)，培养并计数生长的菌落数目（CFU）。结果显示：Amp组小鼠肠内容物中需氧菌数目随着饮用氨苄青霉素溶液时间的增长而逐渐减少（CFU3d>CFU5d>CFU7d），Amp组小鼠肠内容物中需氧菌数量与同时间点Suc组、Tin组相比均有统计学差异（p﹤0.05）。Tin组小鼠肠内容物中厌氧菌数目也随着饮用替硝唑溶液时间的增长而逐渐减少（CFU3d>CFU5d>CFU7d），Tin组小鼠肠内容物中厌氧菌数量与同时间点Suc组、Amp组相比均有统计学差异（p﹤0.05）。饮用抗生素溶液7天后小鼠粪便变软变稀增多，肠道菌群失调症状明显，故考虑连续饮用抗生素溶液5天为宜。 3.抗生素预处理后口服MS/pCW-derp2-rMS调节BALB/c小鼠Th细胞免疫应答的研究抗生素如前预处理小鼠后，每组分为3组，分别给予100μlMS、pCW-derp2-rMS(1×1010CFU/ml)和甘油灌胃免疫小鼠。于末次免疫后4周、8周分别收集外周血血清和脾脏淋巴细胞培养上清，用相应ELISA试剂盒检测其中IFN-γ、IL-2、IL-4水平。于8周时收集外周血和脾脏淋巴细胞，用流式细胞术检测其中Th1/Th2的分布。结果表明：氨苄青霉素或替硝唑处理后可使Th1型细胞因子IFN-γ、IL-2水平下降，Th2型细胞因子IL-4水平轻微升高，使外周血和脾脏淋巴细胞中Th1型细胞所占比例下降，即可致Th1型免疫反应呈下降趋势。口服MS或pCW-derp2-rMS可使Th1型细胞因子IFN-γ、IL-2水平升高（p﹤0.05），Th2型细胞因子IL-4水平轻微下降，使外周血和脾脏淋巴细胞中Th1型细胞所占比例升高，Th2型细胞所占比例下降，产生Th1优势的免疫应答，且这种应答是derp2特异性的。抗生素预处理后接种pCW-derp2-rMS与接种MS相比可使Th1型细胞因子IFN-γ、IL-2水平上升，外周血和脾脏淋巴细胞中Th1型细胞所占比例升高，即可使Th1型免疫反应呈升高趋势，且这种趋势是derp2特异性的。结论： 1.小鼠饮用低浓度抗生素溶液，连续饮用5天为减少肠道菌群又不引起肠道菌群失调的最佳时间。 2.经饮用抗生素溶液预处理的BALB/c小鼠分别给予MS和rMS口服免疫，观察其对小鼠免疫应答的影响。结果显示氨苄青霉素和替硝唑可使Th1型免疫反应呈下降趋势;抗生素预处理后口服pCW-derp2-rMS与口服MS相比可使Th1型免疫应答呈上升趋势，且这种趋势是derp2特异性的。

关键词：抗生素肠道菌群 der p2 重组耻垢分枝杆菌

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华中地区过敏性鼻炎患者屋尘螨分子致敏模式及皮下免疫治疗依从性研究

华中地区过敏性鼻炎患者屋尘螨分子致敏模式及皮下免疫治疗依从性...

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作者：杨永仕华中科技大学

学位级别：硕士

第一部分华中地区过敏性鼻炎患者屋尘螨分子致敏模式研究目的:尘螨(HDM)是我国过敏性鼻炎(AR)伴或不伴哮喘患者的主要吸入性过敏原。然而,不同地区尘螨种类及其主要致敏组分之间存在一定的差异,其致敏模式也不尽相同。本研究旨在调查我... 详细信息

第一部分华中地区过敏性鼻炎患者屋尘螨分子致敏模式研究目的:尘螨(HDM)是我国过敏性鼻炎(AR)伴或不伴哮喘患者的主要吸入性过敏原。然而,不同地区尘螨种类及其主要致敏组分之间存在一定的差异,其致敏模式也不尽相同。本研究旨在调查我国华中地区AR患者的屋尘螨(der p)分子致敏特征。方法:研究纳入der p皮肤点刺试验(SpT)检测阳性的AR患者。收集患者临床资料,并采用免疫荧光法(phadia ImmunoCAp-250)测定所有患者血清中屋尘螨(der p),粉尘螨(der f),粗脚粉尘螨(Aca s),热带无爪螨(Blo t)和屋尘螨组分der p1,der p2和der p10的特异性IgE抗体(sIgE)浓度。结果:本研究共纳入130例AR患者,平均年龄26.3岁。其中女性57例,60例(46.2%)AR患者伴有支气管哮喘。血清sIgE阳性率屋尘螨为99.2%,粉尘螨为98.5%,粗脚粉尘螨为81.5%,热带无爪螨为83.1%,屋尘螨组分der p1为71.5%,组分der p2为64.6%,组分der p10为11.5%。尘螨致敏的AR伴哮喘患者血清中的der p、der f、组分der p1和der p2的sIgE浓度显著高于AR不伴哮喘的患者(pder p1和der p2均致敏(62.8%)的AR患者的哮喘发生率显著高于仅对其中1种屋尘螨过敏原组分致敏的AR患者(der p1 26.7%或der p2 16.7%;pder p1和der p2均未致敏的AR患者(19.4%;pder p1和der p2是诱导我国华中地区屋尘螨致敏AR患者的主要分子成分。对屋尘螨过敏原组分der p1和der p2均致敏可能是尘螨致敏AR患者发展为哮喘的危险因素。第二部分过敏性鼻炎患者皮下特异性免疫治疗依从性分析目的:过敏原特异性免疫治疗(AIT)是目前过敏性疾病唯一的对因治疗方法。然而,皮下免疫治疗(SCIT)的治疗方案比较耗时,患者依从性差是影响AIT治疗效果的重要因素。我们的研究旨在分析呼吸道过敏患者SCIT治疗脱失的原因和治疗依从性不佳的相关风险因素。方法:研究纳入从2012年1月至2014年1月入组接受标准化尘螨SCIT治疗的呼吸道过敏患者。对入组患者每3个月进行一次电话随访,并通过社交网络应用程序进行在线随访沟通,收集相关临床资料。当患者明确表示停止SCIT治疗时,记录导致患者停止治疗的原因。结果:本研究共纳入311名患者。标准化尘螨SCIT治疗3年的依从性为64.6%。SCIT治疗的第1年有59名(19.0%)患者脱失,治疗第2年有31名(10.0%)患者脱失,治疗第3年有20名(6.4%)患者脱失。儿童患者SCIT治疗的依从性高于成人患者(70.7%vs 55.0%)(ppp<0.05)。结论:在真实世界中,标准化尘螨SCIT治疗患者的依从性并不令人满意。儿童对SCIT治疗的依从性高于成人。SCIT治疗不方便、治疗效果不佳、症状改善和不良反应是导致患者脱失的主要原因。了解和处理这些影响因素有助于提高SCIT的依从性,从而使患者受益。医生和患者之间的密切沟通有助于提高临床实践中AIT治疗的依从性。

关键词：过敏性鼻炎哮喘屋尘螨粉尘螨 der p1 der p2 分子致敏依从性真实世界皮下免疫治疗

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屋尘螨Ⅰ、Ⅱ类变应原T细胞表位融合肽疫苗的初步研究

屋尘螨Ⅰ、Ⅱ类变应原T细胞表位融合肽疫苗的初步研究

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作者：徐朋飞安徽理工大学

学位级别：硕士

目的构建编码屋尘螨变应原derp1和derp2的T细胞表位融合肽嵌合基因的原核表达载体pET-28a(+)-T1-8并进行大规模的诱导表达和纯化,并对纯化产物的特异性免疫治疗效果进行分析。方法1)将der p1和der p2的8个T细胞表位用“GpGpG"序列间隔... 详细信息

目的构建编码屋尘螨变应原derp1和derp2的T细胞表位融合肽嵌合基因的原核表达载体pET-28a(+)-T1-8并进行大规模的诱导表达和纯化,并对纯化产物的特异性免疫治疗效果进行分析。方法1)将der p1和der p2的8个T细胞表位用“GpGpG"序列间隔串联为T1-8融合肽,利用DNA重组技术合成T1-8融合肽基因并插入质粒pET-28a(+),构建pET-28a(+)-T1-8载体,限制性内切酶双酶切验证并测序。2)将重组表达载体pET-28a(+)-T1-8转化到大肠埃希菌*** BL21(DE3)感受态中,菌落pCR筛选阳性克隆菌。3)用IpTG小剂量诱导表达,优化条件后进行大剂量诱导表达并纯化,SDS-pAGE和Western blot (WB)验证表达和纯化产物。4)将40只BALB/c雌性小鼠随机分为4组,分别为阴性对照组(pBS组)、阳性对照组(Asthma组)变应原rder p1和rder p2混悬液治疗组(rder p1/rder p2组)以及T1-8融合肽治疗组(T1-8组)。用屋尘螨粗提取液(HDM)致敏小鼠建立哮喘模型,pBS组均以pBS缓冲液代替;两组治疗组分别于小鼠致敏第25天至27天雾化致敏前30min行背部皮下注射相应治疗蛋白;最后一次雾化激发24h后,收集各组小鼠血清、支气管肺泡灌洗液(BALF)以及脾细胞培养上清(SSCC)。ELISA法检测BALF和SSCC中特异性细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-17以及血清中变应原特异性IgE、IgG、IgG2。抗体水平,并行肺组织切片HE染色。结果1)BamHI/NotI双酶切结果以及测序结果显示成功构建pET-28a(+)-T1-8载体。2)菌落pCR结果显示成功转化至*** BL21(DE3)感受态中。3)SDS-pAGE以及WB验证表明该质粒在大肠埃希菌BL21中成功表达。4)ELISA法检测结果显示,T1-8组和rder p1/rder p2组与Asthma组相比,BALF和SSCC中IL-4、IL-17均降低,IFN-γ、IL-10均升高,血清中特异性IgE、IgG1降低,IgG2a升高,差异均有统计学意义(pder p1/rder p2组相比,BALF和SSCC中IL-4、IL-17降低,IFN-γ、IL-10升高,血清中特异性IgE、IgG1降低,IgG2a升高,均有统计学意义(pder p1/rderp2组肺部炎症较Asthma组明显减轻,且炎性细胞浸润显著减少,气道上皮结构重塑;T1-8组与rder p1/rder p2组相比,气道上皮结构与pBS组更为相近。结论成功构建了原核表达载体pET-28a(+)-T1-8并进行了大规模表达和纯化;表达的T1-8融合肽对哮喘小鼠进行特异性免疫治疗后可有效改善小鼠变态反应性气道及肺部炎症,可作为屋尘螨哮喘患者特异性免疫治疗的候选疫苗,以待进一步的研究。

关键词：屋尘螨 der p1 der p2 T细胞表位特异性免疫治疗

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