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中华临床免疫和变态反应杂志 2021年第6期15卷 604-607页

作者：赵慧敏张丹丹陈晴秦凌钰何韶衡沈阳医学院公共卫生学院卫生化学教研室沈阳110034

目的分离纯化出屋尘螨中主要过敏原蛋白der p1。方法使用pBS-T溶液对屋尘螨干粉中的过敏原蛋白进行粗提取,利用阳离子交换层析对经过透析后粗提取液中的der p1进行分离纯化,采用30%的NaCl溶液(1.0 mol/L)进行洗脱。然后通过十二烷基硫酸... 详细信息

目的分离纯化出屋尘螨中主要过敏原蛋白der p1。方法使用pBS-T溶液对屋尘螨干粉中的过敏原蛋白进行粗提取,利用阳离子交换层析对经过透析后粗提取液中的der p1进行分离纯化,采用30%的NaCl溶液(1.0 mol/L)进行洗脱。然后通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-pAGE)对透析后洗脱液中的蛋白质进行鉴定。结果屋尘螨中有多条蛋白区带,其中相对分子质量25000为主要过敏原蛋白,屋尘螨通过阳离子交换层析纯化出相对分子质量25000的蛋白组,主要集中在Ⅲ峰。结论初步分离纯化及鉴定了屋尘螨过敏原蛋白der p1,为临床过敏性疾病的诊断和治疗奠定了基础。

关键词：屋尘螨 der p1 阳离子交换层析

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华中地区过敏性鼻炎患者屋尘螨分子致敏模式及皮下免疫治疗依从性研究

华中地区过敏性鼻炎患者屋尘螨分子致敏模式及皮下免疫治疗依从性...

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作者：杨永仕华中科技大学

学位级别：硕士

第一部分华中地区过敏性鼻炎患者屋尘螨分子致敏模式研究目的:尘螨(HDM)是我国过敏性鼻炎(AR)伴或不伴哮喘患者的主要吸入性过敏原。然而,不同地区尘螨种类及其主要致敏组分之间存在一定的差异,其致敏模式也不尽相同。本研究旨在调查我... 详细信息

第一部分华中地区过敏性鼻炎患者屋尘螨分子致敏模式研究目的:尘螨(HDM)是我国过敏性鼻炎(AR)伴或不伴哮喘患者的主要吸入性过敏原。然而,不同地区尘螨种类及其主要致敏组分之间存在一定的差异,其致敏模式也不尽相同。本研究旨在调查我国华中地区AR患者的屋尘螨(der p)分子致敏特征。方法:研究纳入der p皮肤点刺试验(SpT)检测阳性的AR患者。收集患者临床资料,并采用免疫荧光法(phadia ImmunoCAp-250)测定所有患者血清中屋尘螨(der p),粉尘螨(der f),粗脚粉尘螨(Aca s),热带无爪螨(Blo t)和屋尘螨组分der p1,der p2和der p10的特异性IgE抗体(sIgE)浓度。结果:本研究共纳入130例AR患者,平均年龄26.3岁。其中女性57例,60例(46.2%)AR患者伴有支气管哮喘。血清sIgE阳性率屋尘螨为99.2%,粉尘螨为98.5%,粗脚粉尘螨为81.5%,热带无爪螨为83.1%,屋尘螨组分der p1为71.5%,组分der p2为64.6%,组分der p10为11.5%。尘螨致敏的AR伴哮喘患者血清中的der p、der f、组分der p1和der p2的sIgE浓度显著高于AR不伴哮喘的患者(pder p1和der p2均致敏(62.8%)的AR患者的哮喘发生率显著高于仅对其中1种屋尘螨过敏原组分致敏的AR患者(der p1 26.7%或der p2 16.7%;pder p1和der p2均未致敏的AR患者(19.4%;pder p1和der p2是诱导我国华中地区屋尘螨致敏AR患者的主要分子成分。对屋尘螨过敏原组分der p1和der p2均致敏可能是尘螨致敏AR患者发展为哮喘的危险因素。第二部分过敏性鼻炎患者皮下特异性免疫治疗依从性分析目的:过敏原特异性免疫治疗(AIT)是目前过敏性疾病唯一的对因治疗方法。然而,皮下免疫治疗(SCIT)的治疗方案比较耗时,患者依从性差是影响AIT治疗效果的重要因素。我们的研究旨在分析呼吸道过敏患者SCIT治疗脱失的原因和治疗依从性不佳的相关风险因素。方法:研究纳入从2012年1月至2014年1月入组接受标准化尘螨SCIT治疗的呼吸道过敏患者。对入组患者每3个月进行一次电话随访,并通过社交网络应用程序进行在线随访沟通,收集相关临床资料。当患者明确表示停止SCIT治疗时,记录导致患者停止治疗的原因。结果:本研究共纳入311名患者。标准化尘螨SCIT治疗3年的依从性为64.6%。SCIT治疗的第1年有59名(19.0%)患者脱失,治疗第2年有31名(10.0%)患者脱失,治疗第3年有20名(6.4%)患者脱失。儿童患者SCIT治疗的依从性高于成人患者(70.7%vs 55.0%)(ppp<0.05)。结论:在真实世界中,标准化尘螨SCIT治疗患者的依从性并不令人满意。儿童对SCIT治疗的依从性高于成人。SCIT治疗不方便、治疗效果不佳、症状改善和不良反应是导致患者脱失的主要原因。了解和处理这些影响因素有助于提高SCIT的依从性,从而使患者受益。医生和患者之间的密切沟通有助于提高临床实践中AIT治疗的依从性。

关键词：过敏性鼻炎哮喘屋尘螨粉尘螨 der p1 der p2 分子致敏依从性真实世界皮下免疫治疗

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屋尘螨Ⅰ、Ⅱ类变应原T细胞表位融合肽疫苗的初步研究

屋尘螨Ⅰ、Ⅱ类变应原T细胞表位融合肽疫苗的初步研究

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作者：徐朋飞安徽理工大学

学位级别：硕士

目的构建编码屋尘螨变应原derp1和derp2的T细胞表位融合肽嵌合基因的原核表达载体pET-28a(+)-T1-8并进行大规模的诱导表达和纯化,并对纯化产物的特异性免疫治疗效果进行分析。方法1)将der p1和der p2的8个T细胞表位用“GpGpG"序列间隔... 详细信息

目的构建编码屋尘螨变应原derp1和derp2的T细胞表位融合肽嵌合基因的原核表达载体pET-28a(+)-T1-8并进行大规模的诱导表达和纯化,并对纯化产物的特异性免疫治疗效果进行分析。方法1)将der p1和der p2的8个T细胞表位用“GpGpG"序列间隔串联为T1-8融合肽,利用DNA重组技术合成T1-8融合肽基因并插入质粒pET-28a(+),构建pET-28a(+)-T1-8载体,限制性内切酶双酶切验证并测序。2)将重组表达载体pET-28a(+)-T1-8转化到大肠埃希菌*** BL21(DE3)感受态中,菌落pCR筛选阳性克隆菌。3)用IpTG小剂量诱导表达,优化条件后进行大剂量诱导表达并纯化,SDS-pAGE和Western blot (WB)验证表达和纯化产物。4)将40只BALB/c雌性小鼠随机分为4组,分别为阴性对照组(pBS组)、阳性对照组(Asthma组)变应原rder p1和rder p2混悬液治疗组(rder p1/rder p2组)以及T1-8融合肽治疗组(T1-8组)。用屋尘螨粗提取液(HDM)致敏小鼠建立哮喘模型,pBS组均以pBS缓冲液代替;两组治疗组分别于小鼠致敏第25天至27天雾化致敏前30min行背部皮下注射相应治疗蛋白;最后一次雾化激发24h后,收集各组小鼠血清、支气管肺泡灌洗液(BALF)以及脾细胞培养上清(SSCC)。ELISA法检测BALF和SSCC中特异性细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-17以及血清中变应原特异性IgE、IgG、IgG2。抗体水平,并行肺组织切片HE染色。结果1)BamHI/NotI双酶切结果以及测序结果显示成功构建pET-28a(+)-T1-8载体。2)菌落pCR结果显示成功转化至*** BL21(DE3)感受态中。3)SDS-pAGE以及WB验证表明该质粒在大肠埃希菌BL21中成功表达。4)ELISA法检测结果显示,T1-8组和rder p1/rder p2组与Asthma组相比,BALF和SSCC中IL-4、IL-17均降低,IFN-γ、IL-10均升高,血清中特异性IgE、IgG1降低,IgG2a升高,差异均有统计学意义(pder p1/rder p2组相比,BALF和SSCC中IL-4、IL-17降低,IFN-γ、IL-10升高,血清中特异性IgE、IgG1降低,IgG2a升高,均有统计学意义(pder p1/rderp2组肺部炎症较Asthma组明显减轻,且炎性细胞浸润显著减少,气道上皮结构重塑;T1-8组与rder p1/rder p2组相比,气道上皮结构与pBS组更为相近。结论成功构建了原核表达载体pET-28a(+)-T1-8并进行了大规模表达和纯化;表达的T1-8融合肽对哮喘小鼠进行特异性免疫治疗后可有效改善小鼠变态反应性气道及肺部炎症,可作为屋尘螨哮喘患者特异性免疫治疗的候选疫苗,以待进一步的研究。

关键词：屋尘螨 der p1 der p2 T细胞表位特异性免疫治疗

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