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DiGeorge综合征的染色体变异机制研究

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DiGeorge综合征的染色体变异机制研究

作者：吴雪玲福州大学

学位级别：硕士

DiGeorge综合征是人类最常见的由拷贝数变异(Copy number variations,CNVs)引起的微缺失综合征,发病率极高。患者常伴随多种不同程度的症状,严重影响生活质量。目前,普遍认为DiGeorge综合征的发病机理与同源序列间非等位基因同源重组(No... 详细信息

DiGeorge综合征是人类最常见的由拷贝数变异(Copy number variations,CNVs)引起的微缺失综合征,发病率极高。患者常伴随多种不同程度的症状,严重影响生活质量。目前,普遍认为DiGeorge综合征的发病机理与同源序列间非等位基因同源重组(Non-allelic homologous recombination,NAHR)事件相关,但该理论未得到证实。而DNA双链断裂(Double-stranded breaks,dsbs)能激活DNA损伤修复,在修复过程中会导致基因重排,进而导致染色体缺失。基于此,我们提出一个解释DiGeorge综合征染色体变异的新机制,即22q11.2区域发生dsbs,随后的dsbs错误修复会引发相关区域缺失,最终形成DiGeorge综合征。为证实这一推测,我们利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,人为在Hues8干细胞的22q11.2区域制造dsbs,构建DiGeorge综合征相关基因缺失的研究模型,并研究由dsbs所引发的异常DNA修复。主要研究成果如下:(1)选取人类胚胎干细胞(Hues8细胞)为细胞系,设计四条sg RNA分别与PX458载体连接,成功构建携带绿色荧光指示蛋白和Cas9蛋白元件的sg RNA表达载体;并使用脂质体转染法将重组表达载体瞬转入Hues8细胞,利用流式细胞仪分选单细胞,获得2400个阳性单细胞;(2)利用PCR与Sanger测序相结合的方法,验证单细胞基因编辑情况,成功筛选出99个发生基因编辑的样本;对发生基因编辑的样本,在22q11.2区域内寻找SNP位点,使用相同的方法验证其基因频率的改变情况,成功筛选7个符合条件的样本,即22q11.2区域上的SNP位点基因频率发生改变的样本;(3)对符合条件的样本进行测序文库构建和高通量测序,分析和验证样本22q11.2区域拷贝数缺失情况,筛选出在22q11.2区域发生片段缺失的样本,分别为CR-6和2BB-69;(4)样本CR-6和2BB-69进行MLPA检测是否发生DiGeorge综合征。经检测发现,样本CR-6在22q11.2区域上存在大小约为3.5 Mb的杂合缺失,样本2BB-69在22q11.2区域存在大小约为5.4 Mb的杂合缺失,涉及多个与DiGeorge综合征表型相关的基因被删除。综上,本研究通过人为诱发dsbs成功构建DiGeorge综合征相关基因缺失的细胞模型,发现在22q11.2区域诱发dsbs能引起高达5.4 Mb的染色体缺失,远超过DiGeorge综合征典型缺失区域。初步证明了22q11.2区域发生dsbs会激活DNA修复,修复通路出错可能导致该区域发生大片段缺失,形成DiGeorge综合征。

关键词： DiGeorge综合征 22q11.2 dsbs 拷贝数变异 NAHR

SSB1沉默对大鼠颌下腺细胞放射后增殖修复的影响

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SSB1沉默对大鼠颌下腺细胞放射后增殖修复的影响

作者：陈龙广西医科大学

学位级别：硕士

目的:研究大鼠SMG细胞SSB1基因沉默后,放射损伤下细胞的增殖及修复情况,探讨SSB1与放射性dsbs修复的关系。方法:应用机械胰酶联合法进行大鼠SMG细胞原代培养及免疫组织化学法鉴定。实验分为3组:空白对照组(BC组)、阴性对照组(Ad-HK组)... 详细信息

目的:研究大鼠SMG细胞SSB1基因沉默后,放射损伤下细胞的增殖及修复情况,探讨SSB1与放射性dsbs修复的关系。方法:应用机械胰酶联合法进行大鼠SMG细胞原代培养及免疫组织化学法鉴定。实验分为3组:空白对照组(BC组)、阴性对照组(Ad-HK组)和实验组(Ad-SSB1-shRNA组)。重组腺病毒介导shRNA转染SMG细胞,荧光定量PCR及Western blot法检测SSB1表达沉默情况。CCK-8法检测未放射及放射后各组细胞活性。免疫荧光法检测实验组和阴性对照组放射后γ-H2AX焦点数动态变化。结果:细胞免疫组织化学法检测角蛋白和α-淀粉酶表达均呈阳性。转染72 h后转染效率接近90%,实验组SSB1表达较对照组明显降低(P0.05)。而后阴性对照组γH2AX焦点数急剧减少,但实验组γH2AX焦点数消退明显减缓。结论:SSB1基因沉默的大鼠SMG细胞对放射损伤更敏感。SSB1在大鼠SMG细胞放射性dsbs修复中有着重要作用。

关键词： SSB1 SMG细胞放射 dsbs

氧化应激中热休克蛋白90对MRN复合物相关的DNA双链断裂损伤修复通路的调控机制研究

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氧化应激中热休克蛋白90对MRN复合物相关的DNA双链断裂损伤修复通...

作者：柯湘宇南方医科大学

学位级别：硕士

研究背景多种环境刺激因素如电离辐射、高温、低氧、环境毒物、紫外线等均可诱导氧化应激。细胞通过激活复杂的DNA损伤修复反应以应对DNA双链断裂的损伤应激。DNA损伤反应包括DNA损伤的信号通路的识别,募集DNA修复因子,激活DNA的修复通... 详细信息

研究背景多种环境刺激因素如电离辐射、高温、低氧、环境毒物、紫外线等均可诱导氧化应激。细胞通过激活复杂的DNA损伤修复反应以应对DNA双链断裂的损伤应激。DNA损伤反应包括DNA损伤的信号通路的识别,募集DNA修复因子,激活DNA的修复通路,细胞周期阻滞和凋亡。DNA双链断裂主要通过同源重组(HR)和非同源末端连接(NHEJ)两条通路修复。DNA双链断裂损伤修复依赖于一系列关键蛋白分子识别损伤位点、结合、激活下游通路等级联反应。氧化应激在导致DNA损伤的同时必定会导致生物体内蛋白质失衡,使DNA修复的相关蛋白反应异常,从而导致DNA损伤修复异常,基因组不稳,疾病的发生。构象异常的蛋白质能否重新正确折叠或及时被识别降解,即蛋白质质量控制对维持氧化应激下细胞正常的功能和存活至关重要。在蛋白质质控系统中,分子伴侣Hsp90及其共伴侣分子在协助底物蛋白的重新折叠与降解的中发挥着重要的作用。同源重组(HR)和非同源末端连接(NHEJ)通过均MRN复合物识别DNA损伤部位,MRN蛋白复合物是DNA双链断裂损伤修复通路的始动因子。MRN蛋白复合物由MRE11,NBS1,RAD50三种蛋白组装而成。MRN复合物已确定是Hsp90的底物蛋白。当Hsp90分子伴侣功能缺陷时,会导致DNA损伤修复的相关底物蛋白不稳定,那么在氧化应激刺激下,Hsp90α是否通过调控MRN复合物的活性影响DNA双链损伤修复?目的1.建立H2O2诱导的氧化应激模型并评价Hsp90α敲除对氧化应激和DNA双链损伤的影响。2.探讨氧化应激下Hsp90α是否通过调控MRN复合物活性影响DNA双链损伤修复及其具体机制。方法***-8法检测细胞活力情况。2.流式细胞仪检测细胞周期。3.单细胞凝胶电泳检测DNA双链断裂情况。*** Blot 检测凋亡蛋白(Caspase-3、PARP)、γ-H2AX 和 MRN 复合物的表达。5.使用PCR检测MRN复合物的mRNA水平。6.使用免疫荧光检测γ-H2AX焦点以及MRN复合物与γ-H2AX形成的焦点。结果1.在H2O2诱导的氧化应激下使细胞发生DNA双链断裂损伤,而Hsp90α敲除的HepG2细胞DNA损伤更严重。2.在H2O2诱导的氧化应激下,HepG2细胞和HepG2Hsp90α敲除细胞在500nMH2O2处理下均出现明显的细胞增殖抑制,并且Hsp90α敲除细胞更为明显。3.在H2O2诱导的氧化应激下,HepG2细胞和HepG2 Hsp90α敲除细胞在500μMH2O2处理下出现明显的G2/M期阻滞,并且Hsp90α敲除细胞的G2/M期阻滞更加严重。4.在H2O2诱导的氧化应激下,可使HepG2细胞和HepG2 Hsp90α敲除细胞发生细胞凋亡,并且Hsp90α敲除的HepG2细胞更易发生凋亡。***复合物水平在高浓度H2O2处理下减少,低浓度H2O2处理影响不大。***90α干扰,敲除,突变株质粒的转入,抑制剂处理均可导致MRN复合物的减少,并伴随H2O2处理下DNA损伤增强及DNA修复减少。7.在500μMH2O2诱导的氧化应激下,干扰MRN复合物γ-H2AX变化不明显。8.在500μMH2O2诱导的氧化应激下,MRN复合物与γ-H2AX形成的DNA损伤修复灶点增多,但是Hsp90α敲除的HepG2细胞中MRN与γ-H2AX形成的DNA损伤修复灶点减少。结论1.H2O2诱导的氧化应激会使DNA双链发生断裂,而Hsp90α敲除的HepG2细胞DNA损伤更为严重。2.H2O2诱导的氧化应激会使细胞增殖抑制,细胞G2/M期阻滞和细胞凋亡,而Hsp90α敲除的HepG2细胞对于过氧化氢的处理更加敏感,细胞G2/M期阻滞更加严重,更容易发生细胞凋亡。***90α干扰,敲除,突变株质粒的转入,抑制剂均可导致MRN复合物的减少,并伴随H2O2处理下DNA损伤增强及DNA修复减少。4.在H2O2诱导的氧化应激下,MRN复合物水平在高浓度H2O2下减少,低浓度H2O2处理影响不大,提示着本底MRN复合物水平对DNA损伤修复更为重要。5.在500μMH2O2诱导的氧化应激下,干扰MRN复合物γ-H2AX变化不明显,提示着MRN复合物协同其他DNA损伤修复通路共同作用,单纯的MRN复合物干扰可能上调其他DNA损伤修复因子。6.在氧化应激下,Hsp90α敲除影响MRN复合物的功能,使得识别DNA双链断裂的能力下降,DNA双链损伤修复能力下降。

关键词：氧化应激 dsbs Hsp90α MRE11 NBS1 RAD50 γ-H2AX

高、低剂量率γ线照射对哺乳类细胞生长存活及DNA损伤修复的影响

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高、低剂量率γ线照射对哺乳类细胞生长存活及DNA损伤修复的影响

作者：曹丽丽苏州大学

学位级别：硕士

目的: 通过高剂量率（high-dose-rate,or acute ,1.0Gy/min）、低剂量率（low-dose rate,or chronic, 0.347mGy/min）γ线对哺乳类细胞的照射,研究照射后哺乳类细胞的生长存活情况,探讨γ线引起的细胞损伤修复机制。方法: （... 详细信息

目的: 通过高剂量率（high-dose-rate,or acute ,1.0Gy/min）、低剂量率（low-dose rate,or chronic, 0.347mGy/min）γ线对哺乳类细胞的照射,研究照射后哺乳类细胞的生长存活情况,探讨γ线引起的细胞损伤修复机制。方法: （1）采用Western Blot方法从蛋白水平检测DNA损伤调控因子P53、P21、磷酸化共济失调-毛细血管扩张症致病基因（Ataxia-Telangiectasia mutated,ATM）在本研究所用细胞中的表达,为下一步研究提供可行性。（2）血细胞计数板计数法测定低剂量率照射对细胞生长曲线的影响;克隆形成率测定指数增长期及密集抑制期细胞高、低剂量率照射下的存活率。（3）采用免疫荧光染色法检测有无ATM抑制剂及DNA依赖性蛋白激（DNA-dependent protein kinase, catalytic subunit, DNA-PKcs ）抑制剂作用于密集抑制的稳相细胞照射后DNA双链断裂（DNA double-strand breaks,dsbs）的生物标记物γ-H2AX的免疫荧光表达。结果: 1、Western Blot结果显示:高剂量率（1.0Gy/min）5.0Gy照射后,三种哺乳类细胞中,磷酸化ATM均有表达,磷酸化P53、P21也有一定程度的诱导表达。 2、低剂量率照射组的HE-4细胞及MRC5-hTERT细胞相比较与未照射组生长速度减慢,而C3H 10T1/2细胞没有明显变化;3、指数增长期期细胞及密集抑制状态下高剂量率（1.0Gy/min）照射的细胞存活率均低于低剂量率（0.347mGy/min）照射。 4、高剂量率（1.0Gy/min）γ线照射密集抑制的稳相细胞后,随着培养时间的延长,细胞的存活率增高。 5、γ-H2AX免疫荧光染色提示ATM抑制剂及DNA-PKcs抑制剂处理后的密集抑制状态的细胞在高、低剂量率照射下的dsbs均高于对照组。结论: 1、磷酸化ATM、磷酸化P53、P21在照射后的细胞中均有表达。 2、高剂量率与低剂量率γ线对指数增长期及密集抑制状态下的细胞照射后,均存在明显的剂量依存关系;相同剂量照射,低剂量率照射下的细胞存活率显著高于高剂量率照射组。 3、低剂量率γ线照射下细胞的生长速度减慢,以人纤维细胞最为明显。 4、密集抑制的稳相细胞高剂量率γ线照射后存在潜在致死性损伤修复。 5、ATM在高、低剂量率γ线照射诱导的dsbs修复中均发挥重要作用。

关键词：低剂量率高剂量率剂量依存关系 PLD dsbs

体外多生物标志物遗传毒性检测方法的建立和验证

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体外多生物标志物遗传毒性检测方法的建立和验证

HDAC4 与肿瘤放射敏感性及其放疗增敏靶点治疗的研究

2017年（第七届）药物毒理学年会

作者：黄鹏程周长慧李若婉常艳国家上海新药安全评价研究中心

目的:γ-H2AX作为目前研究较为热门的检测DNA双链断裂的生物标志物,其检测方法近年来得到广泛的发展。本课题选择γ-H2AX、p53蛋白、组蛋白H3磷酸化以及Cleaved-PARP 4个生物标志物,将其整合到γ-H2AX试验中,旨在建立一项操作简单、快... 详细信息

目的:γ-H2AX作为目前研究较为热门的检测DNA双链断裂的生物标志物,其检测方法近年来得到广泛的发展。本课题选择γ-H2AX、p53蛋白、组蛋白H3磷酸化以及Cleaved-PARP 4个生物标志物,将其整合到γ-H2AX试验中,旨在建立一项操作简单、快速、准确的体外多终点遗传毒性检测方法。方法:本研究首先以DNA断裂剂依托泊苷、环磷酰胺（+S9）和非整倍体诱导剂秋水仙素为阳性对照品,建立多终点流式细胞术遗传毒性分析方法。其次选择4种不同作用机制的断裂剂丝裂霉素C（MMC）、苯并芘（B[a]P）、甲基磺酸甲酯（MMS）、顺铂（cDDP）和2种非整倍体诱导剂长春新碱（VCR）、紫杉醇（PT）以及3种非遗传毒性化合物氯化钠（NaCL）、氨苄青霉素钠（Amp G）和普萘洛尔（Prop）,以ETO、COL（24h,-S9）和CP（4h,+S9）为阳性对照品,作用于TK6细胞,验证该方法检测化合物遗传毒性的灵敏度和特异性,并探讨细胞凋亡对该方法的影响。结果:在体外多终点流式细胞术遗传毒性检测方法的建立中,24h-S9处理条件下的ETO和4h+S9处理条件下的CP处理TK6细胞,得到γ-H2AX和p53蛋白荧光强度相对于溶剂对照组呈现剂量依赖性增加最高超过2倍;H3组蛋白磷酸化的细胞比例与溶剂对照相比无显著升高。24h-S9处理条件下的COL诱导TK6细胞的γ-H2AX荧光强度和p53蛋白荧光强度随着浓度的升高无明显的变化;H3组蛋白的磷酸化比例随着浓度的增加而显著升高,呈现明显的浓度-效应关系。结果符合ETO和CP为断裂剂,COL为非整倍体诱导剂的报道。在体外多终点流式细胞术遗传毒性检测方法的验证中,在+/-S9处理条件下处理条件下,MMS、MMC和cDDP诱导TK6细胞的γ-H2AX和p53蛋白荧光强度随着浓度的升高而显著增加,H3磷酸化细胞比例无显著升高,试验结果提示上述三种物质为DNA断裂剂;B[a]P仅在4h+S9处理条件下最高浓度诱导γ-H2AX和p53蛋白荧光强度升高超过2倍,结果为DNA断裂剂,但需后续试验进行补充验证。PT和VCR在+/-S9处理条件下,诱导TK6细胞γ-H2AX荧光强度与溶剂对照组相比无明显变化,VCR诱导p53蛋白荧光强度无显著变化而紫杉醇诱导p53蛋白荧光强度呈现浓度依赖性增加,两者诱导H3磷酸化细胞比例显著增加,呈现浓度-效应关系,提示VCR和PT为非整倍体诱导剂。NaCL、Amp G和Prop三种化合物在+/-S9处理条件下,诱导TK6细胞γ-H2AX的荧光强度和p53蛋白荧光强度与溶剂对照组相比无明显变化,H3磷酸化细胞无剂量依赖性升高。试验提示NaCL、Amp G和Prop为非遗传毒性物质。讨论:本研究建立了基于TK6细胞的体外多终点流式细胞术遗传毒性检测方法。经多种不同作用机制的化合物验证得到的灵敏度和特异性均较高。该方法具有简便、快速和高内涵的特点,具有应用于药物早期遗传毒性筛选和遗传毒性评价的潜力。

关键词： γ-H2AX H3 p53基因流式细胞术 dsbs 遗传毒性

来源： cnki会议评论

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中文科技期刊数据库（引文版）医药卫生 2021年第10期 4-6页

作者：骆婉婷乐珍周妍广东省妇幼保健院广东广州511400

组蛋白去乙酰基酶 4(histone deacetylase4,HDAC4)属于Ⅱa 类组蛋白去乙酰基酶,是 DNA 损伤修复的关键辅助因子。研究发现当肿瘤细胞受到放射后,HDAC4 在核内的 DNA 双链断裂(DNAdouble-strand breaks,dsbs)处集聚形成 foci,促进辐射后 ... 详细信息

组蛋白去乙酰基酶 4(histone deacetylase4,HDAC4)属于Ⅱa 类组蛋白去乙酰基酶,是 DNA 损伤修复的关键辅助因子。研究发现当肿瘤细胞受到放射后,HDAC4 在核内的 DNA 双链断裂(DNAdouble-strand breaks,dsbs)处集聚形成 foci,促进辐射后 dsbs 修复,降低肿瘤放射的敏感性。在 dsbs 修复中,HDAC4 与转录因子-肌细胞增强因(myocyte enhancer factor2,MEF2)-2 相互作用调节促进 p53 结合蛋白 1(p53 binding protein 1,53BP1)在 dsbs 位点聚集形成 foci, 53BP1 为 dsbs 的主要修复蛋白之一,进而参与辐射后 DNA 损伤的修复。本文综述 HDAC4 与 IR 后 dsbs 修复的相关机制,以及该靶点在肿瘤放射治疗中的研究进展。

关键词： HDAC4 MEF2 53BP1 dsbs 修复放射增敏

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卵母细胞和胚胎发育中的DNA双键断裂损伤

实用妇科内分泌电子杂志 2016年第20期3卷 194-195页

作者：孙绪磊冷义福胡淑敏张学奎徐嘉君沈阳九州家圆医院辽宁沈阳110000

在体细胞中,DNA双键断裂(DNA doubled-strand breaks,dsbs)是目前已知DNA损伤中最为严重的一种。进一步的研究发现,dsbs能够引起哺乳动物卵母细胞凋亡,导致生殖能力下降。针对dsbs后机体进行的DNA损伤应答通路的研究在生殖领域也成为热... 详细信息

在体细胞中,DNA双键断裂(DNA doubled-strand breaks,dsbs)是目前已知DNA损伤中最为严重的一种。进一步的研究发现,dsbs能够引起哺乳动物卵母细胞凋亡,导致生殖能力下降。针对dsbs后机体进行的DNA损伤应答通路的研究在生殖领域也成为热点。但是卵子发生和后期胚胎发育过程中,参与dsbs损伤修复机制的基因,是怎样突破染色体精确结构,最终完成DNA修复,维持基因组稳定或启动细胞凋亡过程的,这一复杂调控机制尚不十分明确,亟需进一步研究。

关键词： dsbs DNA损伤修复卵母细胞胚胎发育