DiGeorge综合征的染色体变异机制研究

作     者：吴雪玲 

作者单位：福州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：蔡伟文

授予年度：2021年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：DiGeorge综合征 22q11.2 DSBs 拷贝数变异 NAHR 

摘      要：DiGeorge综合征是人类最常见的由拷贝数变异(Copy number variations,CNVs)引起的微缺失综合征,发病率极高。患者常伴随多种不同程度的症状,严重影响生活质量。目前,普遍认为DiGeorge综合征的发病机理与同源序列间非等位基因同源重组(Non-allelic homologous recombination,NAHR)事件相关,但该理论未得到证实。而DNA双链断裂(Double-stranded breaks,DSBs)能激活DNA损伤修复,在修复过程中会导致基因重排,进而导致染色体缺失。基于此,我们提出一个解释DiGeorge综合征染色体变异的新机制,即22q11.2区域发生DSBs,随后的DSBs错误修复会引发相关区域缺失,最终形成DiGeorge综合征。为证实这一推测,我们利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,人为在Hues8干细胞的22q11.2区域制造DSBs,构建DiGeorge综合征相关基因缺失的研究模型,并研究由DSBs所引发的异常DNA修复。主要研究成果如下:(1)选取人类胚胎干细胞(Hues8细胞)为细胞系,设计四条sg RNA分别与PX458载体连接,成功构建携带绿色荧光指示蛋白和Cas9蛋白元件的sg RNA表达载体;并使用脂质体转染法将重组表达载体瞬转入Hues8细胞,利用流式细胞仪分选单细胞,获得2400个阳性单细胞;(2)利用PCR与Sanger测序相结合的方法,验证单细胞基因编辑情况,成功筛选出99个发生基因编辑的样本;对发生基因编辑的样本,在22q11.2区域内寻找SNP位点,使用相同的方法验证其基因频率的改变情况,成功筛选7个符合条件的样本,即22q11.2区域上的SNP位点基因频率发生改变的样本;(3)对符合条件的样本进行测序文库构建和高通量测序,分析和验证样本22q11.2区域拷贝数缺失情况,筛选出在22q11.2区域发生片段缺失的样本,分别为CR-6和2BB-69;(4)样本CR-6和2BB-69进行MLPA检测是否发生DiGeorge综合征。经检测发现,样本CR-6在22q11.2区域上存在大小约为3.5 Mb的杂合缺失,样本2BB-69在22q11.2区域存在大小约为5.4 Mb的杂合缺失,涉及多个与DiGeorge综合征表型相关的基因被删除。综上,本研究通过人为诱发DSBs成功构建DiGeorge综合征相关基因缺失的细胞模型,发现在22q11.2区域诱发DSBs能引起高达5.4 Mb的染色体缺失,远超过DiGeorge综合征典型缺失区域。初步证明了22q11.2区域发生DSBs会激活DNA修复,修复通路出错可能导致该区域发生大片段缺失,形成DiGeorge综合征。