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基于CRISPR/Cas系统的基因编辑工具及其改进策略

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中国生物工程杂志 2023年第8期43卷 72-85页

作者：辛圆田开仁乔建军财音青格乐天津大学化工学院天津300072 系统生物工程教育部重点实验室天津300072 天津大学浙江研究院(绍兴) 绍兴312300

CRISPR/Cas系统自发现以来持续推动着生命科学领域的进步。与此同时,CRISPR/Cas介导的基因编辑技术也在不断发展壮大。基于dsbs修复的CRISPR/Cas基因编辑技术、碱基编辑器和先导编辑器等新型基因编辑工具的开发为生物学基础研究铺平了... 详细信息

CRISPR/Cas系统自发现以来持续推动着生命科学领域的进步。与此同时,CRISPR/Cas介导的基因编辑技术也在不断发展壮大。基于dsbs修复的CRISPR/Cas基因编辑技术、碱基编辑器和先导编辑器等新型基因编辑工具的开发为生物学基础研究铺平了道路。虽然这些工具为生物技术带来了革命性变化,但基因编辑效率偏低、产物纯度不高、脱靶效应频繁等问题也随之而来。不断开发精确、高效和安全的CRISPR/Cas基因编辑工具仍是当前和未来的生命科学研究热点。概述了CRISPR/Cas基因编辑工具的发展、构成及原理,总结了CRISPR/Cas基因编辑系统提升编辑效率、扩展编辑范围和降低脱靶效应的通用策略及不同CRISPR/Cas基因编辑工具的改进方法,并就CRISPR/Cas基因编辑工具未来的研究方向进行展望。

关键词： CRISPR/Cas 基因编辑效率 dsbs 碱基编辑器先导编辑器

Study on DNA Damage Induced by Neon Beam Irradiation in Saccharomyces Cerevisiae

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Plasma Science and Technology 2010年第6期12卷 753-756页

作者：陆栋李文建吴鑫王菊芳马爽刘青芳何金玉荆西刚丁楠戴中颖周剑平 Department of Biophysics Institute of Modern PhysicsChinese Academy of Sciences Graduate School of Chinese Academy of Sciences Gansu Provincial Academy of Sciences

Yeast strain Saccharornyces cerevisiae was irradiated with different doses of 85 MeV/u 20 Ne 10＋ to investigate DNA damage induced by heavy ion beam in eukaryotic microorganism. The survival rate, DNA double strand breaks （dsbs） and DNA polymorphic were tested after irradiation. The results showed that there were substantial differences in DNA between the control and irradiated samples. At the dose of 40 Gy, the yeast cell survival rate approached 50%, DNA double-strand breaks were barely detectable, and significant DNA polymorphism was observed. The alcohol dehydrogenase II gene was amplified and sequenced. It was observed that base changes in the mutant were mainly transversions of T-G and T-C. It can be concluded that heavy ion beam irradiation can lead to change in single gene and may be an effective way to induce mutation.

关键词： neon ion beam irradiation yeast dsbs mutation

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脊髓性肌萎缩症的基因组不稳定性机制研究

脊髓性肌萎缩症的基因组不稳定性机制研究

作者：叶子凌福建医科大学

学位级别：硕士

背景与目的脊髓性肌萎缩症(Spinal muscular atrophy,SMA)是一种常染色体隐性遗传性神经退行性疾病。其病理特征为脊髓前角运动神经元变性,临床表现为进行性近端肌萎缩和肌无力。2007年,Russman等将5q型SMA分为5型,其中最严重的为SMA0型... 详细信息

背景与目的脊髓性肌萎缩症(Spinal muscular atrophy,SMA)是一种常染色体隐性遗传性神经退行性疾病。其病理特征为脊髓前角运动神经元变性,临床表现为进行性近端肌萎缩和肌无力。2007年,Russman等将5q型SMA分为5型,其中最严重的为SMA0型,患者多在生后6个月内死亡。SMA的致病基因为运动神经元生存1(survival motor neuron,SMN1)基因,其位于染色体5q13.2上。人体内还存在与SMN1高度同源的基因SMN2,其与SMN1主要的差异在于7号外显子中关键的碱基差异c.840C>T。该碱基的突变导致蛋白翻译提前终止,从而产生截短蛋白,大概只有10%-20%前体RNA可以翻译成全长蛋白。早期研究者认为编码的全长SMN蛋白是运动系统中的重要蛋白,敲除小鼠的SMN蛋白可导致胚胎致死,因此SMN蛋白被命名为“生存运动神经元”蛋白。但随后的研究表明SMN在不同组织细胞中均广泛表达,不仅仅表达于神经元中。大量实验证实SMN蛋白参与RNA剪接和剪接体组装,此外还发现SMN蛋白具有调节线粒体稳态功能,并与细胞内吞作用、细胞骨架、泛素化和自噬相关。神经元是高度特化的有丝分裂后细胞,因缺乏DNA复制,这使得它们依赖于有限的DNA修复机制来维持基因组的保真度。神经元每天修复大约104到105个DNA损伤。近年来,随着二代测序技术的发展,有学者发现DNA损伤累积在神经元全基因组的分布并不是随机发生的,具有基因组区域保守性和特异性等特点,并有研究发现基因组不稳定性是神经元变性的直接诱因。那么在SMA疾病模型中,不同的神经元亚群对于基因组不稳定是否存在不同的易感性?此外基因组不稳定是如何参与脊髓性肌萎缩症运动神经元的选择性变性?针对以上科学问题,本研究利用SMA患者来源的诱导性多能干细胞(Induced Pluripotent Stem Cells,i PSC)分化为运动神经元和非运动神经元模型,探究SMA患者存在基因组不稳定性的机制,以及基因组不稳定性在SMA运动神经元选择性变性中起到的作用。方法1.通过免疫荧光技术对由i PSCs诱导的神经干细胞、运动神经元与非运动神经元进行标志物表达验证。2.通过Western blot和彗星实验观察神经干细胞和运动神经元γH2AX的表达水平及DNA双链断裂(Double-strand Break,dsbs)累积情况;通过免疫荧光技术和DRIP-seq检测了正常人和SMA患者来源的运动神经元R-Loop分布水平;通过生信分析方法分析了DRIPseq二代测序的结果,观察中基因组种R-Loop的分布特征;应用了Western blot检测了正常人和SMA患者来源的神经干细胞和运动神经元DNA修复通路的重要蛋白,主要包括:ATM、ATR以及DNA-PKcs,验证R-loop是否影响DNA修复;通过Western blot对比了运动神经元和非运动神经元γH2AX蛋白表达水平,探究其在SMA运动神经元选择性变性的作用。结果1.免疫荧光结果显示i PSCs诱导分化的神经干细胞可表达标志物Nestin、SOX2、SOX1和PAX6,诱导分化的运动神经元可表达标志物HB9和MAP2,诱导分化的非运动神经元可表达标志物Nestin、OTX2、CTIP2和FOXG1。*** blot和彗星实验结果显示SMA神经干细胞无明显DNA损伤,相反在运动神经元中发现dsbs累积,并在内源性SMN蛋白的补给组别可见DNA损伤趋向正常水平;免疫荧光结果显示在SMA的神经干细胞和运动神经元中均发现R-Loop的累积,同样在补给SMN蛋白后,可以观察到R-Loop恢复到正常水平。*** blot结果显示DNA修复通路蛋白激酶ATM和ATR磷酸化水平未发现明显的改变,而DNA-PKcs蛋白磷酸化水平在神经干细胞未见改变,而运动神经元可见明显降低;DRIPseq结果显示SMA患者R-Loop峰信号增高,基因组分布特征无明显变化,同时KEGG显示R-Loop累积分布的基因与神经退行性疾病相关。为了探究基因组不稳定性在SMA中特异性运动神经元亚群中起到重要作用,实验发现SMA运动神经元存在明显的DNA损伤现象而非运动神经元正常对照没有明显差异。结论1.成功构建了由i PSCs诱导分化运动神经元和非运动神经元细胞模型,可应用于后续机制研究。***蛋白的缺失导致SMA患者来源的运动神经元基因组不稳定,一定程度影响基因起始转录。3.运动神经元中DNA-PKcs蛋白磷酸化水平的降低和R-Loop的水平增高是影响基因组不稳定性的重要原因。***蛋白水平下降可引起不同神经亚群对基因组不稳定性易感性增加,且基因组不稳定性在SMA运动神经元亚群的特异性变性中起关键作用。

关键词：脊髓性肌萎缩症基因组不稳定性诱导多能干细胞 dsbs R-Loop

基于γ-H2AX生物标志物DNA遗传毒性检测方法的研究进展

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中国新药杂志 2016年第4期25卷 418-424页

作者：黄鹏程周长慧常艳国家上海新药安全评价研究中心上海201210

DNA双链断裂(DNA double strand breaks,dsbs)是细胞DNA损伤类型中最严重的一种。dsbs可以激活细胞的DNA损伤应答(DNA damage response,DDR)机制,从而使组蛋白H2AX迅速磷酸化(磷酸化的H2AX组蛋白被称为γ-H2AX)。随后,γ-H2AX聚集在双... 详细信息

DNA双链断裂(DNA double strand breaks,dsbs)是细胞DNA损伤类型中最严重的一种。dsbs可以激活细胞的DNA损伤应答(DNA damage response,DDR)机制,从而使组蛋白H2AX迅速磷酸化(磷酸化的H2AX组蛋白被称为γ-H2AX)。随后,γ-H2AX聚集在双链断裂处,形成由大量γ-H2AX聚集成的灶点(foci)。检测细胞中的γ-H2AX灶点数目就可以用于评价DNA双链断裂情况,进而可以用来评价遗传毒性因子的致突变能力。目前,国内外有多种对γ-H2AX灶点的检测方法,包括蛋白质印迹法(Western blotting)、免疫荧光染色显微镜检测法、全细胞酶联免疫反应(Whole-cell ELISA)检测法和流式细胞术检测法等,每种方法各有优缺点。本文将重点阐述近几年国内外γ-H2AX检测方法的新进展,并总结对比不同方法之间的操作步骤、统计参数及优缺点,分析γ-H2AX检测方法在遗传毒理方面的应用前景。

关键词： γ-H2AX dsbs 生物标志物遗传毒理

XLF in the repair of replication-dependent DNA double-strand-breaks and senescence

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XLF in the repair of replication-dependent DNA double-strand...

同源重组修复蛋白RAD54B在肿瘤中的研究进展

“细胞活动生命活力”——中国细胞生物学学会全体会员代表大会暨第十二次学术大会

作者： Dongyun Liu~1,Lin Chen~1,Xiaoli Deng~2,Yusheng Cong~2,Xingzhi Xu~1 1.Laboratory of Cancer Biology,College of Life Sciences,Capital Normal University 2.College of Life Science,Beijing Normal University

DNA double-strand-breaks(dsbs) are the most serious DNA damage,which can be repaired mainly by two pathways,namely homologous recombination repair(HR) and non-homologous-end-joining(NHEJ).Failure to repair dsbs can lead to genome instability which is fundamentally important in senescence in all *** (XRCC4-like factor) is a newly identified NHEJ protein,whose loss-of-function mutations result in human immunodeficiency with *** has been reported that XLF facilitates repair of replication-independent dsbs induced by ironing *** this report,we found that depletion of XLF expression by siRNA impaired the repair capacity of dsbs induced by CPT(a topoisomerase I inhibitor), sensitized cells to DNA replication inhibitors,and increased *** also found that XLF is a positive regulator of its *** together,these results indicate that XLF may play a role in the repair of replication-dependent dsbs and senescence.

关键词： XLF HR dsbs Senescence

来源： cnki会议评论

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临床与实验病理学杂志 2020年第9期36卷 1070-1072页

作者：邱世岳广东省惠州市惠东县人民医院病理科惠州516300

同源重组修复(homologous recombination repair,HRR)是哺乳动物细胞中最为精确的DNA损伤修复方式。其中,RAD54B蛋白参与DNA损伤后的细胞周期调节和HRR的关键阶段,现已发现RAD54B基因缺陷与多种肿瘤的发生和预后相关。为更全面了解RAD5... 详细信息

同源重组修复(homologous recombination repair,HRR)是哺乳动物细胞中最为精确的DNA损伤修复方式。其中,RAD54B蛋白参与DNA损伤后的细胞周期调节和HRR的关键阶段,现已发现RAD54B基因缺陷与多种肿瘤的发生和预后相关。为更全面了解RAD54B,该文就其蛋白结构、参与HRR途径中的功能以及其与肿瘤的相关进展作一综述。

关键词：肿瘤 RAD54B dsbs HRR 文献综述

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APOBEC3A的功能研究新进展

中国艾滋病性病 2016年第6期22卷 481-484页

作者：吴小霞琼台师范高等专科学校数理系海口571100

APOBEC3家族的脱氨酶功能导致ssDNA上的dC→dU,使DNA突变,从而引起基因组的不稳定性和癌症,因此APOBEC3家族成为人体内抑制反转录病毒及反转录元件等的重要因子。APOBEC3A只有一个锌离子结合域,是应答α干扰素时,在巨噬细胞和单核细胞... 详细信息

APOBEC3家族的脱氨酶功能导致ssDNA上的dC→dU,使DNA突变,从而引起基因组的不稳定性和癌症,因此APOBEC3家族成为人体内抑制反转录病毒及反转录元件等的重要因子。APOBEC3A只有一个锌离子结合域,是应答α干扰素时,在巨噬细胞和单核细胞大量表达的唯一APOBEC3成员。APOBEC3A在病毒抑制、DNA分解及细胞周期中的作用,使其成为该家族研究中的热点。若深入了解APOBEC3A的功能与作用机制,可能为基因治疗、疫苗研究、癌症治疗等带来新的机遇和希望。

关键词： APOBEC3A 脱氨基超突变癌症 dsbs

壮药狗肝菜多糖对放射后大鼠颌下腺细胞生长活性及增殖修复的影响

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壮药狗肝菜多糖对放射后大鼠颌下腺细胞生长活性及增殖修复的影响

作者：朱燕春广西医科大学

学位级别：硕士

目的研究狗肝菜多糖预处理大鼠SMG细胞后,放射损伤模型下SMG细胞的生长增殖能力及DNA断裂修复能力。探讨狗肝菜多糖是否可增强辐射性SMG细胞的dsbs修复情况,为开发新的抗辐射药物提供实验依据。方法采取水提醇沉法从狗肝菜干燥全草中获... 详细信息

目的研究狗肝菜多糖预处理大鼠SMG细胞后,放射损伤模型下SMG细胞的生长增殖能力及DNA断裂修复能力。探讨狗肝菜多糖是否可增强辐射性SMG细胞的dsbs修复情况,为开发新的抗辐射药物提供实验依据。方法采取水提醇沉法从狗肝菜干燥全草中获取狗肝菜粗多糖,蛋白酶解法脱去蛋白质,HO氧化法脱去色素,透析法去除小分子物质,并用苯酚-硫酸法测定狗肝菜粗多糖中的糖含量。DEAE-52纤维素层析柱对除杂后的狗肝菜粗多糖进一步纯化,获取均一多糖组分狗肝菜精多糖。应用机械胰酶联合法进行体外大鼠SMG细胞原代培养。用Coγ射线放射SMG细胞0、5、8、10Gy,建立辐射损伤模型。用不同浓度狗肝菜多糖进行干预。实验分为五组:空白对照组(不做任何处理);辐射损伤组(放射8Gy);狗肝菜多糖低剂量组(浓度为40μg/ml+放射8Gy);狗肝菜多糖中剂量组(浓度为60μg/ml+放射8Gy);狗肝菜多糖高剂量组(浓度为80μg/ml+放射8Gy)。CCK-8法检测各组SMG细胞生长抑制率。流式细胞仪(Flow Cytometry,FCM)检测细胞周期及细胞凋亡百分率。蛋白质印迹法(Western blot,WB)检测MRN复合体(Mre11/Rad50/Nbs1)的表达情况。结果本次实验所提取的狗肝菜多糖中,多糖含量为90.5%。体外培养的大鼠SMG细胞大部分呈多边形或三角形、少数为长梭形,组织块周边会有散在少量成纤维样梭形细胞。每7-10天传代,第一代细胞形态较好,增殖能力较强,可传代至第三代细胞,第三代细胞生长活力明显下降,凋亡的细胞变多,镜下可观察到较多的漂浮细胞碎片。CCK-8结果显示,放射后SMG细胞存活率随放射剂量增大而降低,随放射后时间增长先下降后逐渐回升。狗肝菜多糖能提高放射后SMG细胞的增殖能力,且细胞生长活力与狗肝菜多糖浓度呈正相关。流式细胞仪检测SMG细胞凋亡结果提示狗肝菜多糖能明显降低放射后细胞总凋亡率,特别是早期凋亡率;细胞周期结果显示狗肝菜多糖能有效的减少放射后S、G2期细胞数,缓解S、G2期阻滞。Western Blot结果显示:辐射损伤组细胞内Mre11、Rad50、Nbs1表达降低,狗肝菜多糖不同浓度处理组Mre11、Rad50、Nbs1表达则是随着药物浓度增加而升高。结论电离辐射诱导SMG细胞双链DNA损伤,S、G2细胞周期阻滞,抑制细胞生长。狗肝菜多糖可通过降低放射后SMG细胞凋亡比例和缓解SMG细胞S、G2期阻滞来发挥辐射防护作用。狗肝菜多糖也可通过上调MRN复合体三个亚基表达量,从而促进dsbs修复功能,以减轻电离辐射所致的损伤。狗肝菜多糖初步具有促进电离辐射导致的细胞损伤修复的功能。发掘狗肝菜提取物狗肝菜多糖成为抗辐射药物的可能具有研究价值。

关键词：狗肝菜多糖 SMG细胞放射 dsbs 细胞周期

锌指核酸酶介导的基因打靶阳性细胞脱靶位点分析

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锌指核酸酶介导的基因打靶阳性细胞脱靶位点分析

作者：郭文江西北农林科技大学

学位级别：硕士

ZFN通过在基因组特异位点介导双链断裂DNA (dsbs)从而在活细胞中产生基因编辑。然而可以证明ZFN的全基因组特异性的方法仍然较少。本文将在DNA双链断裂处通过非同源末端连接捕获整合酶缺失慢病毒载体以标记这些瞬时事件，对全基因组整... 详细信息

ZFN通过在基因组特异位点介导双链断裂DNA (dsbs)从而在活细胞中产生基因编辑。然而可以证明ZFN的全基因组特异性的方法仍然较少。本文将在DNA双链断裂处通过非同源末端连接捕获整合酶缺失慢病毒载体以标记这些瞬时事件，对全基因组整合位点分析细胞内打靶CSN2的ZFN对的切割活力。 dsbs通过NHEJ修复，这将经常在封口断裂位点引入插入或者缺失突变;或者通过HDR修复，忠诚的通过从姐妹染色体拷贝来修补最初的序列。dsbs在活细胞中能够迅速的完美的解决，不留下任何痕迹和突变来指示暂时的DSB的存在。在这里我们解决这个挑战通过运用整合酶缺失慢病毒载体IDLVs。我们假定线性双股IDLVs在转导细胞核中能够通过NHEJ连接到DSB末端，这样暂时性的难以监测到的dsbs得以稳定的捕获。这样只需要监测IDLV的整合状况，就能够反映ZFN是否对基因组特异性位点切割。木实验主要实验内容和结果有： 1构建通过NHEJ修复DSB的具有neo (新霉素）抗性的整合酶缺失慢病毒载体。 2用构建的慢病毒载体扩增出能够用于侵染牛胎儿成纤维的病毒，电转ZFN，同时孵育病毒，让ZFN和IDLV同时作用于细胞，另一个对照只用IDLV孵育，一份筛选单克隆，一份稳定转染后过流式，流式结果显示，当ZFN同IDLV同时作用于细胞时，其转染效率3倍于IDLV单独作用，说明正是ZFN介导产生的DSB被IDLV捕获了。 3单克隆细胞提取基因组进行脱靶位点分析。木实验通过LAMPCR方法共检测到60个脱靶位点，其中8个位点成簇出现，被定义为脱靶热点。 4对打靶的阳性细胞克隆进行脱靶位点分析。我们对适合做核移植的16个打靶阳性细胞克隆分别提基因组，针对8个脱靶热点设计引物，通过PCR方法扩增脱靶热点的基因序列。结果显示，只有一个细胞克隆发生随机整合插入，其他细胞克隆均无随机整合或点突变，适合做核移植生产转基因动物。

关键词： ZFN dsbs IDLV NHEJ LAMPCR 脱靶位点分析