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海洋生物源dpp-ⅳ抑制肽的制备和构效关系的研究进展

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上海海洋大学学报 2022年第4期31卷 994-1004页

作者：吴燕燕霍玉梅胡晓中国水产科学研究院南海水产研究所农业农村部水产品加工重点实验室广东广州510300 上海海洋大学食品学院上海201306

糖尿病是一种血糖水平慢性增高的代谢性疾病,对人类的生命健康产生严重影响。长期的高血糖症会导致肥胖、高血压等并发症的发生。目前临床用于治疗糖尿病的药物如西他列汀、利格列汀等存在毒副作用较大等问题,开发高效、安全的天然降血... 详细信息

糖尿病是一种血糖水平慢性增高的代谢性疾病,对人类的生命健康产生严重影响。长期的高血糖症会导致肥胖、高血压等并发症的发生。目前临床用于治疗糖尿病的药物如西他列汀、利格列汀等存在毒副作用较大等问题,开发高效、安全的天然降血糖活性物质成为了当前的研究热点。二肽基肽酶-Ⅳ(dipeptidyl peptidase-Ⅳ,dpp-Ⅳ)抑制肽是一类通过抑制dpp-Ⅳ活性从而达到降血糖作用的生物活性肽。天然食物来源的dpp-ⅳ抑制肽具有安全性高、毒副作用小、可长期服用等优点,可应用于降血糖功能性食品。海洋生物资源丰富,是制备dpp-ⅳ抑制肽的重要来源。对国内外海洋生物蛋白源dpp-ⅳ抑制肽的来源、分离纯化、结构鉴定和功能活性评价进行综述,并对下一步研发应用提出建议,旨在为开发dpp-ⅳ抑制肽功能性食品提供参考。

关键词： dpp-ⅳ抑制肽制备分离纯化构效活性评价

dpp-ⅳ抑制肽联合运动对2型糖尿病的改善

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山西大同大学学报（自然科学版） 2023年第5期39卷 81-84页

作者：陈寅格林家仕集美大学体育学院福建厦门361021

糖尿病已成为严重的全球性公共卫生问题,目前临床应用的大多数降血糖药物,都伴有一定副作用,严重影响患者的生活质量。因此,迫切需要关注延缓糖尿病及其并发症的非药物干预策略,如营养摄入和运动干预。采用dpp-ⅳ抑制肽联合运动进行早... 详细信息

糖尿病已成为严重的全球性公共卫生问题,目前临床应用的大多数降血糖药物,都伴有一定副作用,严重影响患者的生活质量。因此,迫切需要关注延缓糖尿病及其并发症的非药物干预策略,如营养摄入和运动干预。采用dpp-ⅳ抑制肽联合运动进行早期干预,可以延长运动产生的内源性GLP-1活性,是预防糖尿病和改善其治疗的理想选择。综述dpp-ⅳ抑制肽、运动改善糖尿病机制,为评估联合治疗策略的基本机制提供依据。

关键词： dpp-ⅳ抑制肽 2型糖尿病中等强度运动联合干预策略

珍珠蚌dpp-ⅳ抑制肽联合中等强度运动对Ⅱ型糖尿病小鼠的影响

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珍珠蚌DPP-Ⅳ抑制肽联合中等强度运动对Ⅱ型糖尿病小鼠的影响

作者：陈寅格集美大学

学位级别：硕士

糖尿病（Diabetes mellitus,DM）已经成为严重的全球性公共卫生问题,而目前临床应用的大多数抗血糖药物,都伴有一定的副作用,严重影响患者的生活质量。因此,迫切需要关注延缓糖尿病及其并发症的其他治疗策略。运动干预能够转换肌纤维类... 详细信息

糖尿病（Diabetes mellitus,DM）已经成为严重的全球性公共卫生问题,而目前临床应用的大多数抗血糖药物,都伴有一定的副作用,严重影响患者的生活质量。因此,迫切需要关注延缓糖尿病及其并发症的其他治疗策略。运动干预能够转换肌纤维类型,激活肌源性细胞因子白介素-6（Interleukin-6,IL-6）,增加内源性胰高血糖素样肽-1（Glucagon-like peptide-1,GLP-1）水平,改善胰岛素抵抗。但GLP-1会被二肽基肽酶-4（Dipeptidyl peptidase-Ⅳ,dpp-Ⅳ）迅速降解而失活,失去降糖效果。采用dpp-ⅳ抑制肽联合中等强度运动干预治疗,可以保护运动产生的内源性GLP-1不被降解,并延长其活性。天然食物衍生的肽疗法联合运动不仅能避免副作用,还可以对糖尿病患者进行早期干预,是预防糖尿病和改善其治疗的理想选择。本研究以珍珠蚌（Hyriopsis cumingii）肉为原料制备并纯化dpp-ⅳ抑制肽,分析其基本性质及作用机理,在糖尿病模型小鼠中评价抑制肽和运动介导的dpp-Ⅳ-GLP-1-胰岛素控制血糖调节功能,探究dpp-ⅳ抑制肽联合中等强度运动对Ⅱ型糖尿病小鼠的降血糖作用及其可能机制。利用两步酶解法并优化酶解条件,分离珍珠蚌dpp-ⅳ抑制肽。首先用1%中性蛋白酶酶解120 min,再用0.6%碱性蛋白酶酶解90 min,酶解产物显示出较好的体外dpp-Ⅳ抑制活性,抑制率为84.7%。利用3 k Da超滤膜、Superdex peptide 10/300 GL凝胶柱层析和RP-HPLC对酶解液进行分离纯化。对肽段质谱鉴定后进行序列比对,筛选出6个未报道的肽段,FNAPAM、FIPNY、IYNPPTPF、LAMPYP、FFVVMP、LAGMP。分子对接结果显示,这6个肽含有高占比疏水性氨基酸残基,结合能均小于-7 kcal/mol,抑制效果较强。它们均可能与dpp-Ⅳ的S1、S2活性位点氨基酸残基Tyr666、Arg125、Ser630等形成氢键,表现出竞争性抑制。探究珍珠蚌dpp-ⅳ抑制肽联合中等强度运动对Ⅱ型糖尿病模型小鼠的影响。6周龄雄性C57BL/6J小鼠随机分为正常饮食组（n=4）、高脂高糖饮食组（n=4）、高脂高糖+dpp-ⅳ抑制肽组（n=4）、高脂高糖+运动组（n=4）、高脂高糖+dpp-ⅳ抑制肽+运动组（n=4）。饲喂6周后,按照40 mg/kg体重腹腔注射链脲佐菌素（Streptozocin,STZ）造模,随后干预8周,对dpp-ⅳ抑制肽干预组灌胃100μL珍珠蚌肽粉,运动组灌胃等体积灭菌水,利用跑台进行中等强度有氧运动,高脂高糖组作为实验对照组灌胃等体积灭菌水。每周进行空腹血糖（Fasting blood glucose,FBG）测定。干预结束后,检测小鼠口服葡萄糖耐量（Oral glucose tolerance test,OGTT）、脂肪组织重量,测定小鼠血清胰岛素、糖化血红蛋白（Glycated hemoglobin,Hb A1c）、血脂四项、dpp-Ⅳ活性、GLP-1活性,对小鼠肝脏、小肠、胰腺以及比目鱼肌取样进行组织学分析。结果显示,珍珠蚌dpp-ⅳ抑制肽与运动干预组显著改善小鼠2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus,T2DM）水平,并能够延缓细胞及器官的病变程度。（1）dpp-ⅳ抑制肽和运动干预均能显著改善Ⅱ型糖尿病模型小鼠呈现的糖尿病病症,二者联合干预效果优于单一干预手段。在血清dpp-Ⅳ的抑制与GLP-1水平的升高方面,dpp-ⅳ抑制肽干预组明显优于运动组;（2）Ⅱ型糖尿病模型小鼠肝细胞呈现脂肪沉积,小肠绒毛出现细胞脱落。脂肪储存过饱和,致腺泡细胞肥大,β细胞萎缩和损伤。联合干预手段显著改善Ⅱ型糖尿病模型组织学水平上的器官损伤,延缓器官病变,逆转糖尿病病程;（3）运动干预组小鼠比目鱼肌整体肌纤维粗大,连接紧密,空隙小,边缘清晰,出现肌纤维类型转换,慢肌面积增大,有氧运动能力提升。本研究以珍珠蚌为蛋白来源制备dpp-ⅳ抑制肽,在Ⅱ型糖尿病小鼠模型中进行抑制肽和中等强度有氧运动干预并取得良好结果,为珍珠蚌功能性食品开发和高值化利用以及T2DM的治疗改善提供了理论基础。

关键词： dpp-ⅳ抑制肽珍珠蚌 Ⅱ型糖尿病中等强度运动

坛紫菜dpp-ⅳ抑制肽及运动对高脂高糖饮食小鼠GLP-1基因表达的影响

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坛紫菜DPP-Ⅳ抑制肽及运动对高脂高糖饮食小鼠GLP-1基因表达的影响

作者：赵嘉妮集美大学

学位级别：硕士

Ⅱ-型糖尿病(Type two diabetes mellitus,T2DM)的发病率逐年上升,已经严重危害人体健康。研究表明,食物蛋白肽与运动均在T2DM的预防与治疗中发挥着重要作用。此外,胰高血糖素样肽-1(Glucagon like peptide-1,GLP-1)能调节胰岛素和胰高... 详细信息

Ⅱ-型糖尿病(Type two diabetes mellitus,T2DM)的发病率逐年上升,已经严重危害人体健康。研究表明,食物蛋白肽与运动均在T2DM的预防与治疗中发挥着重要作用。此外,胰高血糖素样肽-1(Glucagon like peptide-1,GLP-1)能调节胰岛素和胰高血糖素的分泌,但它极易被二肽基肽酶-Ⅳ(Dipeptidyl peptidase-Ⅳ,dpp-Ⅳ)降解失去活性,故有效抑制dpp-Ⅳ,提高GLP-1的水平是预防和治疗T2DM的重要手段。本论文旨在基于动物水平评价坛紫菜dpp-ⅳ抑制肽和运动介导GLP-1的血糖调节功能。本研究从牛肾皮质中分离纯化dpp-Ⅳ,并以dpp-Ⅳ作为工具酶,以坛紫菜为原料制备dpp-ⅳ抑制肽,之后探究坛紫菜dpp-ⅳ抑制肽和(或)运动对高脂高糖饮食小鼠的影响。通过酸沉淀、硫酸铵盐析和凝胶过滤层析纯化得到高纯度dpp-Ⅳ,结果显示,还原条件下,纯化蛋白的分子量为106 k Da,纯化倍数为169.9,得率为9.5%。对该蛋白进行质谱鉴定发现其与牛dpp-Ⅳ氨基酸序列的匹配度为100%。对其性质研究发现,dpp-Ⅳ为糖蛋白且以二聚体形式(210 k Da)存在,等电点为5.8。圆二色谱结果表明,dpp-Ⅳ二级结构具有典型的β-折叠构象,热变性温度为72.7±0.3℃。dpp-Ⅳ具有较好的热稳定性与p H稳定性,金属离子Zn、Fe及Fe对dpp-Ⅳ的酶活力有明显的抑制作用,其中1 mmol/L的Zn对dpp-Ⅳ的酶活力抑制率高达98%。以dpp-Ⅳ作为工具酶,以坛紫菜为原料制备dpp-ⅳ抑制肽。首先进行粗蛋白的提取,之后选用消化酶分两步进行酶解条件的优化。结果显示,在胃蛋白酶加酶量为0.1%,酶解时间为30 min,胰蛋白酶+胰凝乳蛋白酶的加酶量为0.6%,酶解时间为15 min时,酶解产物显示出最高的dpp-Ⅳ抑制率,为82.2%。酶解产物对dpp-Ⅳ的IC值为0.16 mg/m L,显示出较好的体外dpp-Ⅳ抑制活性。进一步探究坛紫菜dpp-ⅳ抑制肽及运动对高脂高糖饮食小鼠的影响。6周龄的C57BL/6J小鼠随机分为正常饮食组(CON组)、高脂高糖饮食组(HSHF组)、高脂高糖饮食+dpp-ⅳ抑制肽组(HSHF+P组)、高脂高糖饮食+运动组(HSHF+E组)、高脂高糖饮食+dpp-ⅳ抑制肽+运动组(HSHF+P+E组)。普通饮食组小鼠给予标准饲料,高脂高糖饮食小鼠给予高脂高糖饲料。干预8周,在此期间,紫菜dpp-ⅳ抑制肽干预组进行肽粉的灌胃,运动组进行中等强度有氧运动,CON组作为正常对照组不做处理,HSHF组作为实验对照组灌胃等体积灭菌水。每周进行体重、摄食量和空腹血糖(Fasting blood glucose,FBG)的测定。干预结束后,检测小鼠的体重、FBG、口服葡萄糖耐量(Oral glucose tolerance test,OGTT)、脂肪组织重量,收集血液,进行血清胰岛素、血清糖化血红蛋白(Glycated hemoglobin,Hb A1c)、血脂四项、血清dpp-Ⅳ活性的检测,q-PCR检测dpp-Ⅳ(小肠、肝脏)和GLP-1(小肠)的m RNA表达变化。结果显示,(1)高脂高糖饮食会导致小鼠体重和FBG升高、糖耐量受损、Hb A1c水平显著升高、白色脂肪增多、高密度脂蛋白(High density lipoprotein,HDL-C)水平显著降低,dpp-ⅳ抑制肽和运动均能显著改善以上指标,且能降低甘油三酯(Triglyceride,TG)、总胆固醇(Total cholesterol,TC)、低密度脂蛋白(Low density lipoprotein,LDL-C)的水平,运动及两种方式联合的效果相较于dpp-ⅳ抑制肽更好;(2)高脂高糖饮食会导致小鼠血清dpp-Ⅳ活性升高、小肠和肝脏dpp-Ⅳ基因表达量显著升高、小肠GLP-1的基因表达量显著降低,dpp-ⅳ抑制肽和(或)运动均可以显著抑制高脂高糖饮食小鼠的血清dpp-Ⅳ活性、降低dpp-Ⅳ基因表达量、增强GLP-1的基因表达量。其中,运动干预能更大程度上抑制dpp-Ⅳ的活性,dpp-ⅳ抑制肽对于dpp-Ⅳ基因表达的抑制效果相较于运动更好,对于GLP-1基因表达的增强作用,两种干预方式结合似乎是一种更好的手段。

关键词： dpp-ⅳ抑制肽运动 GLP-1基因表达高脂高糖饮食小鼠

新型dpp-ⅳ抑制肽的设计、活性验证及分子作用机制研究

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新型DPP-Ⅳ抑制肽的设计、活性验证及分子作用机制研究

作者：梁振广东药科大学

学位级别：硕士

糖尿病是目前危害人类健康的重大慢性病之一。dpp-Ⅳ酶是治疗糖尿病的有效靶点,抑制dpp-Ⅳ酶能降低患者血糖。目前上市的dpp-Ⅳ抑制剂几乎都是化学合成药物,对人体有很多的副作用。dpp-ⅳ抑制肽（dpp-Ⅳ inhibitory peptide）来源广泛,... 详细信息

糖尿病是目前危害人类健康的重大慢性病之一。dpp-Ⅳ酶是治疗糖尿病的有效靶点,抑制dpp-Ⅳ酶能降低患者血糖。目前上市的dpp-Ⅳ抑制剂几乎都是化学合成药物,对人体有很多的副作用。dpp-ⅳ抑制肽（dpp-Ⅳ inhibitory peptide）来源广泛,口服易吸收,副作用小,对预防和治疗糖尿病都有不错的效果,具有很好的应用前景。已发现的dpp-ⅳ抑制肽总量还非常少,用传统方法从动植物和微生物中提取dpp-ⅳ抑制肽会耗费大量人力物力,并且这种方法目的性不强,效率较为低下。基于以上问题,本论文采用计算机辅助药物设计方法,建立精确的dpp-ⅳ抑制肽模型并设计出新型高活性dpp-ⅳ抑制肽,同时采用体外活性实验来验证设计出的高活性肽。dpp-Ⅳ抑制剂的分子作用机制不仅能揭示糖尿病的本质,并且能大大提高设计新型抑制剂的成功率。目前,dpp-Ⅳ抑制剂的作用机制分为竞争性抑制与非竞争性抑制,其中,非竞争性机制尚不明确。基于此,我们采用分子对接和分子动力学模拟对高活性新型dpp-ⅳ抑制肽作用机制进行深入研究,对竞争性和非竞争性抑制肽的结果进行对比来研究它们具体抑制机制的不同,得出了富有创新性的结论。本论文建立精确的dpp-ⅳ抑制肽三维定量构效关系（3D-QSAR）模型;运用模型预测抑制肽的活性,并根据模型预测结果筛选出了六种高活性的dpp-ⅳ抑制肽;六种新型肽的活性进一步被体外活性实验验证。同时对dpp-ⅳ抑制肽的竞争性和非竞争性抑制作用机制进行了多维度的深入研究。本文主要分成三个部分。第一部分,根据50个dpp-Ⅳ抑制二、三肽数据库进行3D-QSAR研究,建立了Co MFA模型（Q=0.837,R=0.991）和Co MSIA模型（Q=0.726,R=0.990）。并采用模型设计并筛选出了六种高活性的dpp-ⅳ抑制肽。结果显示,建立的Co MFA模型和Co MSIA模型有很好的预测能力,并且非常稳定。第二部分,采用体外活性实验验证六种新型肽的活性。实验结果显示,三肽LPI、MPL、LPT、LPE、WPV和CPW的IC分别为7.51μM、20.73μM、22.88μM、31.27μM、30.31μM和27.29μM。它们的活性比大多数已报道的dpp-ⅳ抑制肽活性更高,而且与模型预测的活性几乎一致。这也验证了模型的稳定性和高预测能力。第三部分,运用分子对接和分子动力学模拟对六种肽的分子作用机制进行探究。着重对比研究了竞争性抑制肽与非竞争性抑制肽的不同作用机制。根据分子对接和分子动力学模拟结果得出Glu-205,Glu-206两个残基是抑制剂抑制dpp-Ⅳ活性的关键残基。竞争性抑制肽与底物结合方式相同,它们可以与底物竞争结合位点来抑制dpp-Ⅳ活性。而非竞争性抑制肽发挥抑制作用有两种,一种是非竞争性抑制肽与dpp-Ⅳ结合后,破坏了活性口袋的结构。另一种是肽与dpp-Ⅳ结合后使dpp-Ⅳ侧面通向活性口袋的入口变小了,阻碍了底物进入,从而发挥抑制作用。本论文中,我们建立了一套设计新型dpp-ⅳ抑制肽、验证活性、揭示分子作用机制的研究方法,理论与实验相结合,为dpp-ⅳ抑制肽发展提供了新方法。

关键词： dpp-ⅳ抑制肽三维定量构效关系分子对接分子动力学模拟

牡蛎dpp-ⅳ抑制肽的分离纯化及其作用机理研究

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牡蛎DPP-Ⅳ抑制肽的分离纯化及其作用机理研究

作者：陈宏集美大学

学位级别：硕士

II型糖尿病(Type II diabetes mellitus,T2DM)是一种由于胰岛素抵抗导致的慢性代谢疾病,其发病率逐年上升。研究表明,胰高血糖素样肽-1(Glucagon-like peptide-1,GLP-1)和葡萄糖依赖性促胰岛素激素(Glucose-dependent insulinotropic polypeptide,GIP)在调节胰岛素和胰高血糖素分泌中起到重要作用。GLP-1和GIP会被二肽基肽酶-IV(Dipeptidyl peptidase-IV,dpp-IV,EC 3.***.14.5)降解为无活性功能的片段,影响血糖调节。有效抑制dpp-IV酶活力是治疗II型糖尿病的重要手段之一。本研究从猪肾脏中分离纯化dpp-IV,并以dpp-IV作为工具酶,从牡蛎酶解产物中分离纯化dpp-IV抑制肽,分析抑制肽与dpp-IV之间的作用机理。首先利用酸沉淀、硫酸铵盐析和凝胶过滤层析相结合的方法,从猪肾脏中分离纯化得到dpp-IV。结果显示,纯化的dpp-IV是分子量约为110 kDa的糖蛋白,2D-PAGE显示该酶的等电点约为6.1。肽质量指纹图谱表明获得20个肽段,共296个氨基酸残基,与Sus scrofa的氨基酸序列同源性为100%。dpp-IV二级结构中α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲的占比分别为6.8%、52.5%、16.6%和29%。在60°C以下的温度范围内,dpp-IV的二级结构稳定,随着温度的升高,α-螺旋、β-折叠和β-转角的百分比含量均增加,无规则卷曲的百分比含量减少,表明dpp-IV的二级结构发生改变。dpp-IV在60°C以下,pH 4.00.0范围均能保持高酶活力,具有良好的热稳定性和pH稳定性。dpp-IV的热变性温度(Denaturation temperature,T)为72.8±0.2°C。dpp-IV内源荧光光谱在60°C以下不发生改变,在70°C时内源荧光增强。在pH 5.0.0的范围内,内源荧光较为稳定,而在pH4.0以下和高于pH 10.0时的荧光强度降低,发生荧光猝灭。Zn和Ca对dpp-IV有抑制作用,IC值分别为126.47±1.80μmol/L和48.08±0.23 mmol/L,且不改变dpp-IV二级结构。随着Zn和Ca浓度的增加,dpp-IV内源荧光强度先增加后降低。以dpp-IV作为目标酶,太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)为原料,优化酶解条件制备抑制肽。采用胰酶在pH 8.0、加酶量为0.8%和酶解时间为90 min酶解牡蛎肉制备的酶解液对dpp-IV的抑制活性最高。利用3 kDa超滤膜、Sephadex G-15凝胶层析和RP-HPLC对酶解液进行分离,经质谱鉴定和BIOPEP-UWM模拟胃肠液消化,得到APSTM和ILAPPER两个肽段。dpp-IV抑制活性的体外分析结果显示,APSTM和ILAPPER的IC值分别为354.81±20.00μmol/L和16.98±1.29μmol/L。经体外模拟胃肠液消化,APSTM和ILAPPER具有良好的消化稳定性。体外抑制dpp-IV实验表明,APSTM会被dpp-IV降解,而ILAPPER不会被dpp-IV降解。进一步探究dpp-IV抑制肽的作用机制。抑制动力学结果表明APSTM和ILAPPER的抑制类型为竞争/非竞争混合型抑制和竞争性抑制。差示扫描荧光(Differential scanning fluorometry,DSF)结果表明APSTM和ILAPPER这两个抑制肽提高dpp-IV的熔解温度(Melting temperature,T),分别提高了1.83°C和7.62°C。分子对接结果显示,这两种抑制肽与dpp-IV的S1和S2口袋的Arg125,Glu205,Glu206、Tyr662等关键氨基酸形成氢键,ILAPPER与催化中心Ser630、His740形成氢键,因而具有更好的抑制效果。本研究简化了从猪肾脏中制备dpp-IV的步骤,可快速为探究dpp-IV抑制肽提供目标酶。酶法制备牡蛎dpp-IV抑制肽及其作用机制的研究,为以牡蛎为原料的海洋功能性食品的开发利用提供了理论基础。

关键词： Ⅱ型糖尿病 dpp-Ⅳ 太平洋牡蛎 dpp-ⅳ抑制肽分离纯化作用机理

乳酸菌与酵母菌共发酵驼乳中ACE和dpp-ⅳ抑制肽的研究

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乳酸菌与酵母菌共发酵驼乳中ACE和DPP-Ⅳ抑制肽的研究

作者：唐蓉昆明理工大学

学位级别：硕士

食源性活性肽由于来源广泛、无毒副作用和成本低廉而成为慢性疾病防治领域的研究热点。有研究证明酸驼乳具有调节血压、降血糖等多种生活性。近年来,有关鲜驼乳和发酵驼乳在辅助治疗糖尿病和高血压方面的研究逐渐增多,但是研究发酵乳的... 详细信息

食源性活性肽由于来源广泛、无毒副作用和成本低廉而成为慢性疾病防治领域的研究热点。有研究证明酸驼乳具有调节血压、降血糖等多种生活性。近年来,有关鲜驼乳和发酵驼乳在辅助治疗糖尿病和高血压方面的研究逐渐增多,但是研究发酵乳的生物活性与发酵菌种之间关系的报道却较少。本研究利用来自传统发酵乳的乳酸菌和酵母菌发酵驼乳,筛选出高产血管紧张素转化酶(ACE)和二肽基肽酶Ⅳ(dpp-Ⅳ)抑制肽的菌株,分离、鉴定和合成了具有活性的小分子肽,并对其抑制机制进行了初步探索,为发酵驼乳降血糖和降血压机制的研究提供重要数据。获得研究结果如下:1.活性乳酸菌与酵母菌的筛选及鉴定根据菌株在驼乳中的生长情况对来自内蒙古传统发酵乳的173株乳酸菌和70株酵母菌进行筛选,得到能在驼乳中生长发酵的141株乳酸菌和62株酵母菌,并测定了发酵驼乳的抗氧化活性、α-葡萄糖苷酶、ACE和dpp-Ⅳ抑制活性。初筛到ACE抑制活性较高的5株乳酸菌和4株酵母菌,dpp-Ⅳ抑制活性较高的5株乳酸菌和3株酵母菌。以ACE和dpp-Ⅳ抑制率为指标,将初筛的菌株进行组合发酵得到ACE和dpp-Ⅳ抑制率较高的发酵组合,乳酸菌L108菌株和酵母菌Y15。测序后的序列比对和系统发育分析可得L108为乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)和Y15为解脂耶氏酵母(Kluyveromyces marxianus)。2.乳酸菌和酵母菌共发酵驼乳产ACE和dpp-ⅳ抑制肽的条件优化通过单因素和响应面试验,确定了L108和Y15共发酵的最优条件为温度30℃、发酵时间87 h、转速153 rpm。最优条件下发酵驼乳的ACE抑制率比L108单独发酵提高了35.44%,比Y15单独发酵提高了20.12%;dpp-Ⅳ抑制率比L108单独发酵提高了30.55%,比Y15单独发酵提高了17.24%。在驼乳的共发酵体系中,Y15的活菌数比单菌发酵增加了1.8%,L108的生长代谢对Y15起到促进作用。共发酵驼乳进行体外模拟胃肠消化后活性显著提高,ACE的半抑制浓度由15.349 mg/m L降至2.825 mg/m L;dpp-Ⅳ半抑制浓度由30.12 mg/m L降至6.82mg/m L。***与dpp-ⅳ抑制肽的分离、鉴定及合成(1)用截留超滤、葡聚糖凝胶色谱和RP-HPLC分离纯化发酵驼乳产生的ACE和dpp-ⅳ抑制肽。截留超滤膜分离到的dpp-Ⅳ抑制率均最高;选取抑制率最高的3号峰和dpp-Ⅳ抑制率最高1号峰;分别选取两个组分用半制备RP-HPLC进一步分离纯化,最终分离到ACE抑制率最高的单峰5-2和dpp-Ⅳ抑制率最高的单峰D3-2。(2)对分离到的单峰序列进行鉴定,并通过BIOPEP及BIOWARE预测了肽序列的ACE和dpp-Ⅳ抑制活性,选择评分较高的ACE抑制肽VFGK、VYPYYG和dpp-ⅳ抑制肽PHPALLAP、FGGY进行合成。体外测定ACE抑制肽VFGK和VYPYYG的半抑制浓度分别为1067±0.45μmol/L和484±0.98μmol/L,均为竞争性抑制;dpp-ⅳ抑制肽PHPALLAP和FGGY的半抑制浓度分别为920±0.49μmol/L和1946±0.58μmol/L,也均为竞争性抑制。(3)采用分子对接技术分析了合成肽VFGK、VYPYYG与ACE之间的相互作用位点与作用力;合成肽PHPALLAP、FGGY与dpp-Ⅳ之间的相互作用位点与作用力,结果表明氢键是抑制肽与两种酶结合的主要驱动因素。其中,VFGK与ACE酶的His344、Glu372和His348相结合形成了3个氢键,且与ACE酶活性位点Zn结合也形成了氢键;VYPYYG与ACE酶的His314和Met184相结合形成了2个氢键,且与ACE酶的Pro368、Arg479共同结合形成了氢键。FGGY与dpp-Ⅳ酶的Ser1318、Glu893、Glu894和Tyr1350相结合形成了5个氢键;PHPALLAP与dpp-Ⅳ酶的Arg1248相结合形成了氢键,且与dpp-Ⅳ酶活性位距离较近可能存在范德华力。

关键词：乳酸菌-酵母菌共发酵 ACE抑制肽 dpp-ⅳ抑制肽分离纯化分子对接

中国毛虾dpp-ⅳ抑制肽的制备及作用效果研究

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中国毛虾DPP-Ⅳ抑制肽的制备及作用效果研究

作者：孙洁上海海洋大学

学位级别：硕士

近年来,二肽基肽酶-Ⅳ（dipeptidyl peptidase-Ⅳ,dpp-Ⅳ）抑制剂作为抗糖尿病新型药物受到越来越多的关注,食源性dpp-ⅳ抑制肽因来源于自然界中的蛋白质,具有安全性高、有利于人体吸收和选择性降血糖等诸多优点,被作为潜在的功能性食... 详细信息

近年来,二肽基肽酶-Ⅳ（dipeptidyl peptidase-Ⅳ,dpp-Ⅳ）抑制剂作为抗糖尿病新型药物受到越来越多的关注,食源性dpp-ⅳ抑制肽因来源于自然界中的蛋白质,具有安全性高、有利于人体吸收和选择性降血糖等诸多优点,被作为潜在的功能性食品原料而备受关注。中国毛虾是一种高蛋白、低脂肪且符富含矿物元素的优质水产原料,毛虾蛋白质中氨基酸种类齐全且疏水性氨基酸含量丰富,是制备生物活性肽的良好来源。本文以中国毛虾为原料,首先优化酶解毛虾的工艺参数,从毛虾酶解产物中分离纯化得到dpp-ⅳ抑制肽,探究dpp-ⅳ抑制肽的降血糖作用机理,最后分析中国毛虾多肽在模拟消化中的稳定性。（1）以水解度、氮回收率和分子量分布为评价指标,通过最适蛋白酶的选择、单因素试验及响应面设计,最终确定酶解毛虾的参数为:酶解时间5.1 h、料液比（W/V）1:10.5 g/mL、加酶量5100 U/g。此时酶解液中的水解度最高,实际值为45.71±1.04%,与预测值相近。在最佳条件下制备中国毛虾酶解液在20mg/mL浓度时的dpp-Ⅳ抑制率为44.32±2.78%,证明本实验响应面优化可以提高中国毛虾酶解液的水解度,同时获得具有dpp-Ⅳ抑制活性的酶解产物。（2）中国毛虾酶解液经膜分离、凝胶色谱Sephadex G-15及RP-HPLC三步分离纯化后得到了活性较高的F2-3组分,使用LC-MS/MS技术对该组分进行结构鉴定,经数据库检索和结构特征对比最后筛选出YGGQFPTRPD、PALPSIPH、IFTAPQVP、PAFPHPLP 和 LGDAPGEVP 五条 dpp-ⅳ抑制肽。（3）使用固相合成法合成dpp-ⅳ抑制肽并通过活性验证可知,五条多肽中PALPSIPH和PAFPHPLP的dpp-Ⅳ抑制活性较高,IC50值分别达到2.68±0.06 mmol/mL和1.61±0.06 mmol/mL。随后探究dpp-ⅳ抑制肽的抑制作用机理。酶抑制动力学结果表明,PALPSIPH和PAFPHPLP与dpp-Ⅳ的抑制作用类型分别为竞争性抑制和竞争/非竞争混合型抑制。分子对接结果表明,PAFPHPLP与dpp-Ⅳ中的Gln553残基结合形成氢键,结合能更小,表明多肽与dpp-Ⅳ的对接效果更好,对dpp-Ⅳ的抑制能力更大;PALPSIPH的对接效果次之,该多肽分别与dpp-Ⅳ的活性中心的Arg358、Try547和Ser209之间通过氢键结合。（4）使用体外模拟胃肠消化模型探究中国毛虾多肽结构和活性的稳定性。总的来说,模拟肠消化阶段对多肽结构和活性的影响均大于胃消化阶段。中国毛虾多肽在胃消化阶段的消化率小于肠消化率,说明胃部抗消化能力较好。分子量分布和紫外扫描结果也显示肠消化阶段多肽的结构改变较大。中国毛虾多肽在模拟胃消化之后其dpp-Ⅳ抑制活性和抗氧化活性均有不同程度的提高,而在肠消化阶段两种活性被大大削弱,这也印证了体外模拟肠消化过程对中国毛虾多肽的影响较大。为保护中国毛虾多肽在胃肠环境下不被改变,使用β-环糊精微胶囊和肠溶胶囊分别保护多肽,活性结果表明在本实验中使用的肠溶胶囊对中国毛虾多肽dpp-Ⅳ抑制活性和抗氧化活性的保护效果优于微胶囊。

关键词：中国毛虾 dpp-ⅳ抑制肽分离纯化分子对接体外模拟消化

脱脂南极磷虾粉源dpp-ⅳ抑制肽和抗氧化肽的研究及中试规模制备

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脱脂南极磷虾粉源DPP-Ⅳ抑制肽和抗氧化肽的研究及中试规模制备

作者：赵侠上海海洋大学

学位级别：硕士

糖尿病是以高血糖为特征的一种代谢性疾病。糖尿病可能会引起一系列并发症。抗氧化剂能够通过清除体内自由基来减少氧化损伤,从而达到预防糖尿病及其并发症的目的。dpp-Ⅳ(二肽基肽酶4)是人体内参与血糖调节的酶,其抑制剂目前普遍用于... 详细信息

糖尿病是以高血糖为特征的一种代谢性疾病。糖尿病可能会引起一系列并发症。抗氧化剂能够通过清除体内自由基来减少氧化损伤,从而达到预防糖尿病及其并发症的目的。dpp-Ⅳ(二肽基肽酶4)是人体内参与血糖调节的酶,其抑制剂目前普遍用于临床降血糖治疗。常用的抑制剂有西格列丁、沙格列丁等,但是长期服用会引起一系列的副作用。活性肽具有无毒、温和、易吸收的特点,一些抗氧化肽除了具有抗氧化功能活性,还可通过抑制dpp-Ⅳ的活性来延迟人体对葡萄糖的吸收来达到降血糖的目的。这使得从天然蛋白质中提取食品源dpp-ⅳ抑制肽和抗氧化肽成为研究热点。脱脂南极磷虾粉是南极磷虾(Euphausia superba)虾油加工的副产物,具有蛋白质含量高,脂肪含量低的特点,是提取生物活性肽的优质原料。因此,本研究以脱脂南极磷虾粉为原料,通过酶解法提取生物活性肽,以原料利用率为指标进行单因素和响应面工艺优化。以ABTS和dppH自由基清除能力以及dpp-Ⅳ抑制能力为标准,采用超滤和凝胶层析技术进行纯化。最后对活性肽进行结构鉴定,并通过分子对接研究dpp-ⅳ抑制肽的抑制机理和MPO(髓过氧化物酶)潜在抑制活性。最后进行中试规模制备。以期为脱脂南极磷粉的高值化利用和降血糖、抗氧化药物的开发提供理论依据。具体研究内容如下:1.本文以脱脂南极磷虾粉为原料,原料利用率为优化指标,通过单因素实验和响应面实验对酶解工艺进行优化。得到脱脂南极磷虾粉最适酶解条件为:酶解时间为4h19min,料液比1:7.78,酶添加量为1.66%。在此酶解工艺下原料利用率为80.68%±0.32%,所得水解液冻干粉相对分子量小于3000 Da的组分占比高达98%,dpp-Ⅳ抑制率为80.06±6.6%,dppH自由基清除率43.50±1.2%,ABTS自由基清除率为34.35±1.3%,具有良好的生物活性。2.通过探究不同酶解时间对酶解液的水解度、dpp-Ⅳ抑制活性、dppH自由基清除率、ABTS自由基清除率和分子量分布的影响,发现随着酶解时间的增加,水解度逐渐上升,并且在4 h时趋于平缓,此时ABTS自由基清除率为34.35±1.3%,dppH自由基清除率为43.50±1.2%,dpp-Ⅳ抑制活性为78.06±3.6%。酶解时间越长水解液小分子量的占比就越小,肽的疏水性氨基酸含量占总氨基酸含量的44.16%,这是影响生物活性的的重要因素。然后将酶解液进行超滤,得到4个组分,≥10 ku,10 ku>MW≥5 ku,5 ku>MW≥3 ku和dpp-Ⅳ抑制率83.12±0.77%,dppH自由基清除率55.40±0.45%,ABTS自由基清除率40.25±1.11%。将超滤组分中dppH自由基清除活性为77.99±1.22%,ABTS自由基清除活性为84.60±0.20%,dpp-Ⅳ抑制活性为57.23%±0.48%(5 mg/m L)。将M3组分通过质谱进行肽序列的分析,共鉴定出128条肽,结合质谱得分,Peptide Ranker得分,i dppⅣ-SCM得分和抗氧化评分,筛选出具有潜在高抗氧化和降血糖活性的六条肽:WPPLSPFRCPR,NRPIPPWI,IPDWFLNRQ,PFGLYVHHSWF,FLWLKK TPLPL,DTVPWFPR。3.对六种肽进行固相合成后验证其活性,六种肽都具有较好的抗氧化活性,其中四种肽具有较好的dpp-Ⅳ抑制活性:WPPLSPFRCPR,IC=2.121±0.31 mmol/L;IPDWFLNRQ,IC=0.6163±0.097 mmol/L;FLWLKKTPLPL,IC=1.158±0.71mmol/L;DTVPWFPR,IC=4.923±2.0 mmol/L。分子对接结果表明,这四种肽与dpp-Ⅳ分子对接于活性口袋。这六条肽与MPO(髓过氧化物酶)均表现出较低的对接分数,进一步说明了其作为抗氧化肽的可能。通过使用体外模拟的胃肠消化模型,研究了脱脂南极磷虾粉多肽的活性稳定性。结果表明,经过模拟胃肠消化抗氧化活性降低,dpp-Ⅳ抑制活性略有增加,但仍然保持在相对较高的水平,说明其脱脂南极磷虾粉活性肽在体内也可保持较好的活性。4.通过将脱脂南极磷虾粉活性肽的制备工艺扩大至100L中试规模制备,得到的肽粉分子量肽含量为82%,总氮为14.1。肽粉浓度为10mg/ml时,羟基自由基清除率63.11%,总还原力22.51%,超氧阴离子自由基清除率30.86%,α-淀粉酶抑制活性54.21%,α-葡萄糖苷酶抑制活性65.10%,表现出良好的降

关键词：脱脂南极磷虾粉 dpp-ⅳ抑制肽抗氧化肽分离纯化分子对接中试生产