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Effects of dhrs3 in C2C12 Myoblast Differentiation and Mouse Skeletal Muscle Injury

Journal of Northeast Agricultural University(English Edition) 2021年第3期28卷 38-47页

作者： Zhang Wen-yu Xu Jia-hui Zhang Chun-yu Tong Hui-li Li Shu-feng Yan Yun-qin College of Life Sciences and Technology Northeast Agricultural UniversityHarbin 150030China

Myoblast differentiation is an essential process during skeletal muscle development.C2C12 myoblast is a commonly used experimental model to study muscle cell differentiation in ***/reductase(SDR family)member 3(dhrs3)is a highly conserved member in short-chain alcohol dehydrogenase/reductase superfamily and has been shown to be involved in the metabolism of *** experimental results showed that the expression of dhrs3 increased significantly during the differentiation of myoblasts ***,the effect of dhrs3 on mouse muscle cell differentiation was *** objective of current study was to determine if dhrs3 affected muscle cell differentiation,and if dhrs3 was involved in muscle *** expression was determined by western blot and immunofluorescence *** activation and inhibition of dhrs3 increased and decreased C2C12 myoblast differentiation respectively,which indicated that dhrs3 could affect C2C12 myoblast ***3 expression was significantly changed during muscle regeneration,with the regeneration of muscle injury,the expression of dhrs3 tended to increase first and then *** suggested that dhrs3 might be involved in muscle *** summary,this study confirmed the involvement of dhrs3 in C2C12 myoblast differentiation and mouse skeletal muscle regeneration and provided a theoretical basis for further elucidating the molecular mechanism of muscle development.

关键词： dhrs3 C2C12 cell differentiation mouse skeletal muscle injury

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miRNA-nov-1/dhrs3介导mTOR信号通路调控锰诱导N27细胞凋亡的机制研究

miRNA-nov-1/Dhrs3介导mTOR信号通路调控锰诱导N27细胞凋亡的机制...

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作者：王丽娜遵义医科大学

学位级别：硕士

目的:以大鼠多巴胺能神经元细胞系(简称“N27”细胞)构建慢病毒细胞稳转株,探讨mi RNA-nov-1/dhrs3在锰致N27细胞凋亡中的调控机制,以及m TOR信号通路关键分子变化的特点,进一步阐明锰致神经毒性的分子机制。方法:1.N27细胞分为以下2组:... 详细信息

目的:以大鼠多巴胺能神经元细胞系(简称“N27”细胞)构建慢病毒细胞稳转株,探讨mi RNA-nov-1/dhrs3在锰致N27细胞凋亡中的调控机制,以及m TOR信号通路关键分子变化的特点,进一步阐明锰致神经毒性的分子机制。方法:1.N27细胞分为以下2组:Mn Cl0μmol/L(空白对照组,Control组)、300μmol/L(模型组,Model组)24h。CCK8检测细胞活力,Western blot检测dhrs3、凋亡相关蛋白(Caspase-3、Cleaved-caspase-3)和m TOR信号通路相关蛋白(m TOR、p-m TOR、p-S6K1、S6K1、p-4E-BP1、4E-BP1、p-Akt、Akt)的表达;RT-q PCR检测mi RNA-nov-1、dhrs3 m RNA的表达;核酸序列比对软件预测mi RNA-nov-1与dhrs3的结合位点。2.将N27细胞分为以下7组:空白对照组(Control组)、模型组(Model组)、锰+慢病毒空载组(NC组)、锰+mi RNA-nov-1过表达组(mi RNA-nov-1 up组)、锰+mi RNA-nov-1低表达组(mi RNA-nov-1 sponge组)、锰+沉默dhrs3组(sh-dhrs3组)、锰+mi RNA-nov-1低表达+dhrs3沉默组(mi RNA-nov-1sponge+sh-dhrs3组)。各组染锰剂量均为最佳染锰浓度(300μmol/L),染毒时间24h。用倒置显微镜观察各组的细胞形态;流式细胞仪检测细胞凋亡(Annexin V/PI双染色法);Hoechst 33324荧光染色法检测细胞凋亡率;Western blot检测dhrs3、Caspase-3和m TOR信号通路相关蛋白(m TOR、p-m TOR、p-S6K1、S6K1、p-4E-BP1、4E-BP1、p-Akt、Akt)的表达;RT-q PCR检测mi RNA-nov-1、m TOR、S6K1、4E-BP1、Akt m RNA的表达。结果:***8实验发现,锰对N27细胞活性的影响呈剂量效应关系,细胞的活性随剂量的增加而下降。Western blot结果显示,与Control组相比,Model组dhrs3表达下降(P3、Cleaved-caspase-3)和m TOR信号通路磷酸化蛋白(p-m TOR、p-S6K1、p-4E-BP1、p-Akt)的表达增加(P0.05)。RT-q PCR结果显示,与Control组相比,Model组的mi RNA-nov-1表达上调,dhrs3表达下调,差异具有统计学意义(Pdhrs3存在结合位点。*** blot结果显示,与Model组和NC组相比,mi RNA-nov-1 up组和sh-dhrs3组的Caspase-3、p-m TOR、p-Akt、p-S6K1、p-4E-BP1表达增加(P3以及p-m TOR、p-Akt、p-S6K1、p-4E-BP1表达降低(Pdhrs3组的Caspase-3以及p-m TOR、p-Akt、p-S6K1、p-4E-BP1表达量无明显差异(P>0.05)。与Model组和NC组相比,mi RNA-nov-1 up组和sh-dhrs3组的dhrs3表达下降(Pdhrs3组的dhrs3表达量无明显差异(P>0.05)。RT-q PCR结果显示,与Control组相比,其它6组mi RNA-nov-1的表达量均增加(Pdhrs3组mi RNA-nov-1的表达量增加(Pdhrs3组mi RNA-nov-1表达无显著差异(P>0.05)。与Control组相比,Model、NC、mi RNA-nov-1 sponge、sh-dhrs3、mi RNA-nov-1 sponge+sh-dhrs3组的m TOR、Akt、S6K1 m RNA表达无显著差异(P>0.05)。Annexin V/PI双染流式细胞术检测结果显示,与Control组比较,其它6组的凋亡率明显升高(Pdhrs3组N27细

关键词：锰 miRNA-nov-1 dhrs3 细胞凋亡 mTOR信号通路

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维生素A1通过dhrs3形成维甲酸的途径促进小鼠C2C12成肌细胞分化

维生素A1通过DHRS3形成维甲酸的途径促进小鼠C2C12成肌细胞分化

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作者：张闻宇东北农业大学

学位级别：硕士

骨骼肌的发育是一个重要的过程,这些过程受到多种肌肉分化相关基因的调控。研究表明,外源性的营养物质也可以促进肌肉细胞分化,例如维生素、脂肪酸和氨基酸等。维生素A有维生素A1(Vitamin A1,VA1)和维生素A2两种形式,其中VA1主要存在于... 详细信息

骨骼肌的发育是一个重要的过程,这些过程受到多种肌肉分化相关基因的调控。研究表明,外源性的营养物质也可以促进肌肉细胞分化,例如维生素、脂肪酸和氨基酸等。维生素A有维生素A1(Vitamin A1,VA1)和维生素A2两种形式,其中VA1主要存在于动物肝脏,血液和眼球的视网膜中,又称为视黄醇。VA1是一种脂溶性的醇类营养物质,对于维持骨骼正常生长发育具有重要作用。有文献报道VA1可能参与牛肌肉细胞分化。然而,关于VA1能否调控小鼠肌肉细胞分化及其分子机制尚不清楚。在此,我们主要探究VA1对小鼠C2C12成肌细胞分化的影响以及其影响骨骼肌发育的分子机制。VA1通过两个连续的氧化反应产生维甲酸,维甲酸又名视黄酸(Retinoic acid,RA):首先,VA1在脱氢酶/还原酶(SDR)家族成员3(dhrs3)等酶的作用下可逆性地氧化成视黄醛(Retinaldehyde,RAL);然后RAL不可逆性地氧化成RA。dhrs3作为一种短链醇脱氢酶/还原酶超家族中高度保守的成员,是一种可逆性的酶,在VA1的代谢过程中扮演了重要的角色。然而,关于dhrs3在小鼠肌肉细胞中的表达和功能的研究报道却很罕见。本研究的主要目的:探究外源性的VA1、RAL和RA对C2C12成肌细胞分化的影响;探究dhrs3在C2C12成肌细胞分化过程中的表达规律,以及小鼠体内肌肉细胞分化过程中的表达规律;探究dhrs3的表达变化对C2C12成肌细胞分化的影响;探究VA1促进C2C12成肌细胞分化的机制与dhrs3的关系。主要研究结果如下:1.通过在小鼠C2C12成肌细胞的分化培养液中外源添加VA1、RAL和RA,并应用Western blotting和免疫荧光技术,研究外源添加VA1、RAL和RA对小鼠C2C12成肌细胞分化的影响。结果表明,相比于各自对照,肌肉分化标志分子Myo G的表达量都明显升高,肌管融合率也明显增加,外源添加VA1、RAL和RA可在分化不同天数不同程度地影响小鼠C2C12成肌细胞分化。2.诱导小鼠C2C12成肌细胞分化,应用Western blotting和免疫荧光技术,研究dhrs3在小鼠C2C12成肌细胞分化过程中的表达规律。Western blotting结果显示,dhrs3的表达量随着C2C12成肌细胞分化天数的增加而增加。免疫荧光结果显示,dhrs3在分化的肌管中高表达,与Western blotting结果一致。3.为了进一步探究dhrs3在体内肌肉分化过程中的作用,我们构建了小鼠的肌肉损伤修复模型,应用Western blotting和免疫组化技术,研究dhrs3在体内肌肉分化过程中的表达规律。结果表明,在肌肉损伤修复的过程中,dhrs3基因的表达量在损伤的前3天逐步升高,其中第三天表达量最高,第5天后逐步下降。总之,dhrs3基因的表达随着肌肉分化的增加而增加。4.通过构建激活抑制载体、过表达载体和干扰载体,应用Western blotting和免疫荧光技术,研究dhrs3的表达变化对小鼠C2C12成肌细胞分化的影响。结果显示,激活或过表达dhrs3使肌分化标志分子Myo G的表达量明显升高,并且使细胞的肌管融合率显著增加;抑制或干扰dhrs3的表达使Myo G的表达量明显降低,并且使细胞的肌管融合率显著降低。5.通过在小鼠C2C12成肌细胞的分化培养液中外源添加VA1、RAL和RA,同时,用si RNA干扰dhrs3的表达,采用Western blotting和免疫荧光技术,研究对小鼠C2C12成肌细胞分化的作用与dhrs3表达量的关系。结果表明,当dhrs3的表达被干扰时,VA1处理组的Myo G的表达量明显降低,并且使细胞的肌管融合率明显下降。RAL和RA处理组无明显变化。我们通过进一步外源添加VA1,同时通过高效液相色谱测定RA含量,研究VA1影响小鼠C2C12成肌细胞分化的机制。结果表明,添加VA1同时干扰dhrs3的表达可抑制VA1诱导的分化,降低RA的含量。以上研究结果表明,外源添加VA1、RAL和RA对C2C12成肌细胞的分化有不同程度的促进作用。dhrs3表达增加或降低分别促进或抑制C2C12成肌细胞分化,提示了dhrs3能影响C2C12成肌细胞分化。添加VA1同时干扰dhrs3的表达可抑制VA1诱导的分化,降低RA的含量,这些数据表明VA1很可能通过dhrs3催化形成RA的途径促进C2C12成肌细胞的分化。我们的研究成果为进一步分析肌肉发育的分子机制提供了理论基础。

关键词：维生素A1 维甲酸 dhrs3 C2C12 细胞分化

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胃癌相关甲基化基因的筛选与鉴定

胃癌相关甲基化基因的筛选与鉴定

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作者：徐斌第四军医大学

学位级别：硕士

实验目的: 人类基因的异常改变是癌症发生发展的重要生物学标志之一。近年来研究发现在胃癌组织中常会出现某些特定基因的启动子区的甲基化水平异常。在前期工作中我们发现了在胃癌中可能存在启动子区CpG岛甲基化水平异常改变的10个候... 详细信息

实验目的: 人类基因的异常改变是癌症发生发展的重要生物学标志之一。近年来研究发现在胃癌组织中常会出现某些特定基因的启动子区的甲基化水平异常。在前期工作中我们发现了在胃癌中可能存在启动子区CpG岛甲基化水平异常改变的10个候选基因,本实验利用基于飞行质谱的高通量CpG位点甲基化程度检测的方法(Mass-Array)和结合亚硫酸盐的测序技术(BSP)的检测方法对候选基因进行了筛选、鉴定和并对其相关功能进行研究。实验设计: 通过BSP和Mass-Array方法定性和定量的检测候选基因启动子区CpG岛的甲基化情况。通过实时荧光定量PCR的方法来检测该基因在组织和细胞中的表达水平。最后结合样本的临床资料进行临床相关性分析研究。实验结果: 通过研究发现基因dhrs3,短链脱氢酶家族中的一员,在胃癌中作为表观遗传学修饰的目标基因,参与胃癌的发生发展。该基因启动子区的CpG岛在胃癌组织中呈高甲基化改变。BSP和Mass-Array所检测的120例样本中,癌组织与正常组织相比该基因在癌组织中表现出明显的高甲基化改变pdhrs3启动子区CpG岛呈显著的高甲基化改变,且mRNA表达显著降低,提示该基因在胃癌发生发展中可能起到抑癌基因的作用。该基因启动子区CpG岛甲基化程度的异常有可能在胃癌的早期诊断和预后判断中起到预警分子的作用。

关键词：胃癌早期预警 DNA甲基化 dhrs3 Mass-Array

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