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dhav-3山东分离株P1基因序列分析及单克隆抗体的制备

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DHAV-3山东分离株P1基因序列分析及单克隆抗体的制备

作者：夏琳琳山东农业大学

学位级别：硕士

鸭肝炎病毒（Duck hepatitis virus,DHV）导致的鸭病毒性肝炎（Duck viral hepatitis,DVH）以侵害三周龄以内的雏鸭为主,是一种急性高度致死性传染病。近年来,由3型鸭甲肝病毒（Duck hepatitis A virus,dhav-3）引起的DVH广泛流行于中... 详细信息

鸭肝炎病毒（Duck hepatitis virus,DHV）导致的鸭病毒性肝炎（Duck viral hepatitis,DVH）以侵害三周龄以内的雏鸭为主,是一种急性高度致死性传染病。近年来,由3型鸭甲肝病毒（Duck hepatitis A virus,dhav-3）引起的DVH广泛流行于中国和韩国,致死率高达80%,严重危害养鸭业的发展。为进一步了解山东省dhav-3的流行近况、遗传变异规律和分子生物学特征,提高对该病的诊断速度和质量,加强对其的科学防控,本研究进行了以下两部分的研究:第一部分山东地区dhav-3的病毒分离及分离株P1基因的序列分析2012年7月至2014年7月,对山东省四个地区（济南市、潍坊市、烟台市、临沂市）dhav-3的流行情况进行了流行病学调查。共采集了18批167份疑似鸭病毒性肝炎致死的鸭肝组织等病料,经病料处理、鸭胚接种和雏鸭人工感染实验对病毒进行分离,用dhav-3特异性检测引物对分离病毒进行RT-PCR扩增检测,共分离鉴定出70株dhav-3野毒株。结果表明18批病料中均检出dhav-3,批次检出率为100%;167份病料中有70份样品为dhav-3阳性,个体阳性率为41.9%。从此次山东分离株中选取18株dhav-3代表株,对其P1基因进行克隆测序和序列分析。同源性分析显示,18株dhav-3分离株P1基因高度保守,其核苷酸和氨基酸序列同源性高达95.9%9.8%和97.4%00%。与27株dhav-3参考株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为91.9%9.0%和95.2%9.6%,属同一血清型。进化树分析显示,中国分离株（除B63株）均属于GⅠ型。本研究分离的18株dhav-3代表株均属于GⅠ型的S1亚型,其中济南、临沂、潍坊三地分离株遗传距离较近,位于同一小分支。越南分离株与中国B63株属于GⅡ型中的S3亚型,而所有韩国分离株组成GⅡ型中的S4亚型。dhav-3的基因分型呈现明显的地域特征。氨基酸比对结果显示不同分支彼此之间存在多个氨基酸变异位点,其中共有22个氨基酸稳定变异位点。P1基因第671～712位氨基酸处于高变区（HVR）,是病毒抗原变异的关键所在。在HVR内,所有的RGD序列变异为QSD序列。第二部分SD1101株单克隆抗体的制备为研制dhav-3单克隆抗体,用已完成全基因组测序的SD1101株dhav-3的全病毒免疫适龄BALB/c小鼠,取免疫效果最佳的小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,通过间接ELISA法对杂交瘤细胞进行筛选,经三次亚克隆后获得2株稳定分泌针对dhav-3的单克隆抗体4A2和4C3。对这2株单抗的腹水效价、亚类、染色体数、特异性和稳定性进行了鉴定,结果如下:用间接ELISA检测连续传代和冻存复苏的细胞上清,发现其分泌抗体的能力无显著差异,证明其稳定性好;染色体数目在100左右,呈现典型的杂交瘤细胞染色体特征;经亚类鉴定,2株单抗分泌的抗体类型均为Ig G1亚类、κ亚型;单抗腹水效价为1:10240;IFA结果显示,2株单抗与dhav-3和dhav-1均发生特异性反应,但与dhav-3的反应更强烈。

关键词： dhav-3 分离鉴定 P1基因序列分析单克隆抗体

dhav-3感染性克隆构建及其部分生物学活性研究

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DHAV-3感染性克隆构建及其部分生物学活性研究

作者：焦玉祥山东农业大学

学位级别：硕士

鸭病毒性肝炎（Duck viral hepatitis, DVH）是由鸭病毒性肝炎病毒（Duck hepatitisvirus, DHV）引起的一种急性、高致死性传染病;以肝炎为主要特征，主要发生在三周龄以内雏鸭。我国鸭病毒性肝炎主要是由dhav-1和dhav-3引起的，雏鸭感... 详细信息

鸭病毒性肝炎（Duck viral hepatitis, DVH）是由鸭病毒性肝炎病毒（Duck hepatitisvirus, DHV）引起的一种急性、高致死性传染病;以肝炎为主要特征，主要发生在三周龄以内雏鸭。我国鸭病毒性肝炎主要是由dhav-1和dhav-3引起的，雏鸭感染这两种病毒后的临床症状和病理变化极其相似，并且二者在临床上混合感染比较普遍，给该病的有效诊断和防治带来了极大困难。dhav-1和dhav-3共同流行是我国许多鸭场采取针对传统基因型主动或被动免疫仍发生鸭病毒性肝炎的主要原因。本研究成功构建了dhav-3SD1101株全长cDNA感染性克隆，并对其部分生物学活性进行了研究。1、dhav-3SD1101株感染性克隆的构建及病毒的拯救在本实验室已完成的SD1101株dhav-3全基因组测序基础上，根据载体pCDNA3.1+与病毒全基因组序列的酶切图谱，设计并合成四对特异引物，应用融合PCR技术分四段扩增dhav全基因组cDNA，分段克隆到载体pCDNA3.1+中，获得了dhav-3SD1101株基因组全长cDNA克隆pSDdhav。通过引物设计的方法，在cDNA的5’端添加上sp6RNA聚合酶启动子核心序列和3’端添加病毒基因组序列中不存在的单一酶切位点BssHⅡ。另外设计两对引物，用于突变一个EcoRⅠ酶切位点作为遗传标签，用以区分母本病毒和拯救病毒。将SD1101株全长cDNA按一定顺序拼接到pCDNA3.1+上，从而获得重组质粒pSDdhav，测序后发生突变的碱基共有6位，其中第7190位碱基为人工诱变，用于突变EcoRⅠ酶切位点作为遗传标签。碱基变异共造成第224和2397位氨基酸发生改变，其余均为无义突变。用BssHⅡ线性化重组质粒pSDdhav后体外转录，沉淀回收转录产物用于转染BHK-21细胞，并用母本病毒RNA作为阳性对照，用灭菌PBS作为阴性对照。转染BHK-21细胞盲传三代后收获细胞及上清液，用RT-PCR和IFA方法检测结果均为阳性。经过遗传标记的鉴定，表明成功获得了拯救病毒。2、拯救病毒的部分生物学活性研究取收获的细胞及上清液，反复冻融后接种8日龄鸭胚，传至第三代鸭胚开始出现死亡，取第五代尿囊液测定拯救病毒和母本病毒的DELD50。结果显示dhav-3rSD1101株第五代病毒尿囊液对8日龄鸭胚的DELD50为5-2.40/0.2mL;dhav-3SD1101株第五代病毒尿囊液对8日龄鸭胚的DELD50为5-2.50/0.2mL。为了探究拯救病毒的感染性，将30只1日龄的健康雏鸭随机分成三个组。其中1、2组分别肌肉注射0.5mL（2DELD50）的拯救病毒和0.5mL（2DELDD50）母本病毒，对照组肌肉注射相同剂量的无菌pH7.4的PBS。结果显示拯救病毒具有与母本病毒相似的感染性，接种雏鸭表现出明显鸭病毒性肝炎临床症状。本研究成功构建了具有感染性的dhav-3全长cDNA克隆，为进一步揭示dhav基因组结构与功能及致病机理等提供了良好的技术平台。

关键词： dhav-3 全长cDNA 拯救病毒感染性克隆生物学活性研究

高邮鸭OASL基因克隆、多态性分析及dhav-3对OASL表达影响的研究

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高邮鸭OASL基因克隆、多态性分析及DHAV-3对OASL表达影响的研究

作者：魏瑞扬州大学

学位级别：硕士

寡腺苷酸合成酶样蛋白（Oligoadenylate synthase-like protein synthetase,OASL）基因是干扰素刺激基因之一,其蛋白家族包含OAS1、OAS2、OAS3和OASL共四种蛋白。目前,在禽类体内只发现了 OASL一种蛋白。本文以OASL基因为研究对象,克隆... 详细信息

寡腺苷酸合成酶样蛋白（Oligoadenylate synthase-like protein synthetase,OASL）基因是干扰素刺激基因之一,其蛋白家族包含OAS1、OAS2、OAS3和OASL共四种蛋白。目前,在禽类体内只发现了 OASL一种蛋白。本文以OASL基因为研究对象,克隆了高邮鸭OASL基因全序列并进行了生物信息学分析,接着对北京鸭、高邮鸭、蒲田黑鸭和绍鸭4个不同种群鸭OASL基因的部分序列进行PCR扩增,分析不同种群鸭之间OASL基因的多态性,并通过人工构建雏鸭肝炎模型来比较OASL基因在健康雏鸭和感染雏鸭体内各组织的分布以及表达量的变化。以期为OASL分子进化及抗病毒免疫机制的研究提供相关基础。1高邮鸭OASL基因的克隆及生物信息学分析本实验以高邮鸭为研究对象,以樱桃谷鸭、凤头潜鸭、鸡、鹅的OASL基因保守序列为模板,设计5对针对不同区域的引物,经PCR扩增和序列拼接共得到共4321bp的碱基序列,编码443个氨基酸。经生物学软件预测得出:其二级结构由α螺旋、延伸链和无规则卷曲组成,典型的结构域为N端的寡腺苷酸合成酶样结构域和C端两个串联的泛素样结构域。该蛋白属于亲水性蛋白,无信号肽位点和跨膜结构,糖基化位点预测发现3个潜在的N-糖基化位点和13个O-糖基化位点。进化树结果显示,禽类中鸭和原鸡聚为同一分支,同源性高达100%,哺乳类处除小鼠外,其他物种均同属于一个分支,亲缘关系较近。通过生物信息学方面的预测分析和进化树的构建,为深入了解OASL分子的遗传变异和发挥抗病毒功能的分子机制提供基础,从而将研究成果运用到家禽的抗病育种实践。2 OASL基因多态性比较本实验以北京鸭、高邮鸭、蒲田黑鸭和绍鸭为实验对象,扩增OASL基因5’调控区部分序列并进行多态性分析,共发现5个单核苷酸多态性（SNP）位点（g.73C＞T、g.95G＞A、g.196T＞C、g.280C＞G、g.619C＞G）。通过 Popgene32 软件计算各等位基因的多态信息值,结果显示:5个多态性位点中,除北京鸭之外,g.73和g.95处杂合度较高,绍鸭和高邮鸭群在g.196处和g.619处杂合度为0。多态信息含量结果显示:蒲田黑鸭五个位点均为中度多态（0.25＜PIC＜0.5）,高邮鸭和绍鸭群除g.196和g.619外,其他位点均为中度多态,北京鸭各位点均为低度多态（PIC＜0.25）。连锁不平衡分析结果显示:四个种群鸭总体而言,在g.73与g.95、g.73与g.280、g.95与g.196、g.95与g.280、g.95与g.619位点之间呈强连锁不平衡状态（0.33＜r2＜1）,g.196与g.619位点之间呈完全连锁不平衡状态（r2=1）。通过分析不同群体鸭OASL基因的多态性,可了解家鸭免疫相关基因的分子变化,为OASL基因多态性与抗病力相关性的研究提供依据。3 OASL基因在健康鸭和攻毒鸭各组织内的分布及表达差异本实验以健康雏鸭为实验对象,在自然条件下用鸭甲肝病毒（Duck hepatitis A virus,dhav）dhav-3毒株感染两日龄雏鸭,采集心脏、肝脏、肺脏、小肠以及胰腺并提取各组织中的总RNA,运用RT-PCR和实时荧光定量PCR方法检测OASL基因在各组织的表达量,结果显示:在对照组雏鸭体内,各组织的ΔCt分别为心脏（9.90±0.48）＞肺脏（9.41±0.34）＞肝脏（8.53±0.34）＞胰腺（5.7±0.62）＞小肠（5.4±0.27）,即小肠的基因表达量最高,其次为胰腺、肝脏和肺脏,心脏相对表达量最低。而在攻毒组雏鸭体内,各组织的ACt分别为胰腺（3.67±0.11）＞肺脏（3.63±0.41）＞心脏（3.36±0.43）＞小肠（3.31±0.63）＞肝脏（3.24±0.33）,即肝脏的基因表达量最高,其次为小肠、心脏和肺脏,胰腺相对表达量最低。经2-ΔΔCt法计算得出:攻毒后OASL基因在各个组织内的表达量均显著升高,肝脏、心脏、肺脏、小肠和胰腺的基因表达量分别是对照组雏鸭基因表达量的39.21、92.86、54.58、4.18、4.02倍,在所检测的5个组织中,心脏的上调倍数最高。提示心脏可能是抗病毒基因表达的重要组织。结论:（1）高邮鸭OASL基因由4321bp的碱基序列组成,编码443个氨基酸,经预测无信号肽和跨膜结构,有3个潜在的N-糖基化位点和13个O-糖基化位点,为亲水性蛋白。（2）比较OASL基因多态性,总体而言,g.73与g.95、g.73与g.280、g.95与g.196、g.95与g.280、g.95与g.619位点之间呈强连锁不平衡状态,g.196与g.619之间呈完全连锁不平衡状态,蒲田黑鸭相对北京鸭、高邮鸭和绍鸭具有较高的杂合度。（3）OASL基因在感染dhav-3鸭

关键词：鸭 OASL基因克隆单核苷酸多态性 dhav-3

鸭Mx蛋白单克隆抗体的制备及dhav-3感染鸭胚Mx蛋白表达模式的分析

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鸭Mx蛋白单克隆抗体的制备及DHAV-3感染鸭胚Mx蛋白表达模式的分析

作者：郝春雪东北农业大学

学位级别：硕士

Mx蛋白是具有抗病毒活性的蛋白,在机体内由干扰素诱导产生,但目前鸭Mx蛋白抗病毒的具体机制尚未确定,制备可用于检测鸭Mx蛋白的单克隆抗体,有助于阐明鸭Mx蛋白的结构及其在抗病毒感染中的作用,为深入研究水禽Mx蛋白功能提供必要的物质... 详细信息

Mx蛋白是具有抗病毒活性的蛋白,在机体内由干扰素诱导产生,但目前鸭Mx蛋白抗病毒的具体机制尚未确定,制备可用于检测鸭Mx蛋白的单克隆抗体,有助于阐明鸭Mx蛋白的结构及其在抗病毒感染中的作用,为深入研究水禽Mx蛋白功能提供必要的物质基础。在分析本实验室已克隆的鸭Mx基因编码氨基酸的同源性及其抗原性的基础上,以实验室保存的重组质粒pMD19-T Simple Mx为模板,通过PCR扩增得到鸭Mx-A(1-300 bp)、Mx-B(1798-2163 bp)、Mx-C(418-939 bp)、Mx-CDS目的基因,并将鸭Mx的三段截短基因同时亚克隆至pET-30a(+)和pET-32a(+)原核表达载体中,构建原核重组表达载体,经重组蛋白的诱导表达,获得重组鸭Mx截短蛋白rDupET-30a-Mx-A、rDupET-30a-Mx-B、rDupET-30a-Mx-C、rDupET-32a-Mx-A、rDupET-32a-Mx-B、rDupET-32a-Mx-C。与此同时构建鸭Mx基因的真核表达质粒pcDNA3.1-Mx-CDS。以rDupET-30a-Mx-A、rDupET-30a-Mx-B、rDupET-30a-Mx-C作为免疫原,rDupET-32aMx-A、rDupET-32a-Mx-B、rDupET-32a-Mx-C作为检测原,进行了单克隆抗体的制备。经3次亚克隆获得了9株分泌抗鸭Mx蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别是2B6、4B6、2D10、3G5、5D5、1C4、3C2、3H4、4F7。分泌的单抗均可以和检测原产生特异性反应,其中6株可以与转染pcDNA3.1-Mx-CDS的DF-1细胞表达的鸭Mx蛋白产生特异性的反应,这6株杂交瘤细胞分别是针对Mx-A蛋白的2B6、4B6,针对Mx-B蛋白的2D10、3G5、5D5,针对Mx-C蛋白的1C4。单抗亚类鉴定的结果显示2B6、4B6、3G5、5D5、3H4株为IgG1亚类,1C4株为IgG2a亚类,2D10、3C2、4F7株为IgG2b亚类,根据9株单抗特异性的鉴定结果以及亚类的确定,从中挑选3株杂交瘤细胞(4B6、3G5、1C4)制备单抗腹水并测效价。应用4B6株单抗检测dhav-3病毒感染15日龄SPF鸭胚后心脏、肝脏、脑组织、肌肉、肌胃组织、肠组织6个组织的Mx蛋白表达情况,Mx蛋白在不同组织中的表达存在差异且表达量随时间而变化。

关键词：鸭 Mx蛋白单克隆抗体 dhav-3

基于VP2和VP4 dhav-3间接ELISA检测方法的建立

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基于VP2和VP4 DHAV-3间接ELISA检测方法的建立

作者：何玲四川农业大学

学位级别：硕士

鸭甲型肝炎病毒(Duck hepatitis A ***)是一种无囊膜包裹的单股正链RNA病毒,其基因组仅一个开放阅读框(Open reoding frame,ORF),共编码3种结构蛋白和9种非结构蛋白,主要有3个基因型(dhav-1、dhav-2、dhav-3),其中dhav-2主要在台湾等地... 详细信息

鸭甲型肝炎病毒(Duck hepatitis A ***)是一种无囊膜包裹的单股正链RNA病毒,其基因组仅一个开放阅读框(Open reoding frame,ORF),共编码3种结构蛋白和9种非结构蛋白,主要有3个基因型(dhav-1、dhav-2、dhav-3),其中dhav-2主要在台湾等地区流行,我国大陆地区未见报道,而dhav-1和dhav-3在我国普遍流行,且存在混合感染的情况,为该病的诊断治疗增加了难度,为建立简便、快速、应用范围广的dhav-3抗体检测方法,本研究主要针对dhav-3 VP2和VP4基因进行原核表达,并基于VP2和VP4融合蛋白建立了 dhav-3间接ELISA检测方法,所获得的主要结果如下:***-3VP2和VP4基因的原核表达、优化、纯化。本试验以dhav-3尿囊液中抽提的RNA为模板,通过RT-PCR技术得到与预期结果一致的VP2和VP4目的基因片段,分别克隆至pET30a-(+)、pET32a-(+)原核表达载体,分别转化至宿主表达菌BL21(DE3),经过温度、IPTG浓度优化,SDS-PAGE结果分析表明,融合蛋白VP2主要以包涵体的形式表达,在37℃,0.8 mmol/LIPTG条件下诱导表达量最大,经切胶纯化可得到较高纯度的融合蛋白VP2;融合蛋白VP4主要以可溶性表达的形式存在,在37℃,0.4 mmol/L IPTG条件下诱导表达量最大,经Ni2+柱亲和层析的方法可得到较高纯度的融合蛋白VP4。Western blot分析结果表明融合蛋白VP2和VP4能特异性结合兔抗dhav-3血清,说明它们具有良好的反应原性。2.基于纯化的VP2和VP4蛋白建立间接ELISA检测方法分别以纯化后的重组蛋白VP2和VP4为包被抗原,经过抗原包被浓度、酶标二抗稀释度、包被条件、封闭条件、血清孵育时间、酶标二抗时间、显色时间等进行一系列优化,分别建立基于VP2和VP4蛋白的dhav-3间接ELISA检测方法。试验结果表明,基于VP2蛋白的ELISA检测方法最佳包被浓度为2.23μg/mL,37℃孵育1h后4℃包被过夜,1%脱脂牛奶封闭1 h,血清1:160稀释后孵育1 h,HRP标记的兔抗鸭IgG 1:2000稀释后孵育0.5 h,单组份TMB显色10 min为最佳反应条件,并确定阳性阈值为0.25;基于VP4蛋白的ELISA检测方法最佳包被浓度为2.6μg/mL,37℃孵育1h后4℃包被过夜,5%脱脂牛奶封闭1h,血清1:20稀释后孵育0.5 h,HRP标记的兔抗鸭IgG 1:1600稀释后孵育1 h,单组份TMB显色液显色10min为最佳反应条件,并确定阳性阈值为029。本试验所建立的两种间接ELISA检测方法特异性好、重复性强、灵敏度高,与细胞中和试验结果总符合率可达90%和80%,可用于dhav-3抗体的检测。

关键词： dhav-3 VP2 VP4 原核表达间接 ELISA

一步法双重荧光定量RT-PCR检测dhav-1和dhav-3方法的建立与应用

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一步法双重荧光定量RT-PCR检测DHAV-1和DHAV-3方法的建立与应用

作者：胡琴四川农业大学

学位级别：硕士

鸭病毒性肝炎(Duck Viral Hepatitis, DVH)是由鸭肝炎病毒(Duck hepatitis virus, DHV)引起的一种鸭的急性、高度致死性传染病,给我国乃至全世界的养鸭业造成了巨大的经济损失。本文针对1型鸭甲肝病毒(dhav-1)的VP0基因及3型鸭甲肝病毒(... 详细信息

鸭病毒性肝炎(Duck Viral Hepatitis, DVH)是由鸭肝炎病毒(Duck hepatitis virus, DHV)引起的一种鸭的急性、高度致死性传染病,给我国乃至全世界的养鸭业造成了巨大的经济损失。本文针对1型鸭甲肝病毒(dhav-1)的VP0基因及3型鸭甲肝病毒(dhav-3)的VP3基因分别设计引物和TaqMan探针,建立了分别检测dhav-1和dhav-3的单一荧光定量RT-PCR方法及同时检测dhav-1和dhav-3的双重荧光定量RT-PCR方法,主要结果如下：1、荧光定量RT-PCR检测dhav-1在dhav-1 VP0区域设计引物及TaqMan探针,建立了一步法rRT-PCR检测dhav-1的方法。该法在底物(dhav-1核酸)浓度为4.88×1010 copies/μL-4.88×101 copies/μL范围内相关方程为Y=-3.367X+42.688,R2=1.000,具有良好的线性关系;扩增效率为98.1%,对核酸的检出低限为49copies/μL,该检测方法对dhav-3、鸭疫里默氏杆菌、鸭瘟、大肠杆菌、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、多杀巴氏杆菌、新城疫病毒、番鸭细小病毒、鸭肿头出血症病毒、雏鹅新型病毒性肠炎病毒等病原检测为阴性,具有良好敏感性和特异性。2、荧光定量RT-PCR检测dhav-3在dhav-3 VP3区域设计引物及TaqMan探针,建立一步法rRT-PCR检测dhav-3的方法。该方法在底物(dhav-3核酸)浓度为4.72×1010copies/μL-4.72×101 copies/μL范围内相关方程为Y=-3.373X+44.261, R2=0.996,具有良好的线性关系：扩增效率为97.9%;对核酸的检出低限为48copies/μL,该检测方法对dhav-1、鸭疫里默氏杆菌、鸭瘟、大肠杆菌、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、多杀巴氏杆菌、新城疫病毒、番鸭细小病毒、鸭肿头出血症病毒、雏鹅新型病毒性肠炎病毒等病原检测为阴性,具有良好敏感性和特异性。3、一步法双重荧光定量RT-PCR检测dhav-1和dhav-3方法的建立在dhav-1 VP0区域和dhav-3 VP3区域分别设计引物及TaqMan探针,建立了一步法双重rRT-PCR检测dhav-1和dhav-3的方法。该方法在底物(dhav)浓度为1010-101 copies/μL数量级范围内具有良好线性关系。其中,dhav-1标准曲线方程式为Y=-3.371X+42.679,R2=0.999,扩增效率为98.0%,灵敏度为49copies/μL, dhav-3标准曲线方程式为Y=-3.398X+42.858,R2=0.998,扩增效率为96.9%,灵敏度为5copies/μL。该方法仅对dhav-1和dhav-3呈检测阳性,而对鸭疫里默氏杆菌、鸭瘟、大肠杆菌、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、多杀巴氏杆菌、新城疫病毒、番鸭细小病毒、鸭肿头出血症病毒、雏鹅新型病毒性肠炎病毒等病原检测阴性,具有良好敏感性和特异性。4、dhav-3单独或与dhav-1混合感染在鸭胚内的增殖规律应用建立的一步法rRT-PCR方法对dhav-3在鸭胚体内增殖和分布进行检测,结果表明鸭胚在感染dhav-3后24 h各组织均检出dhav-3(含量为104-105 copies/g数量级),鸭胚死亡时间集中在接种dhav-3后56-60,h,死亡鸭胚各组织病毒含量为107-109 copies/g数量级,其中尿囊膜含毒量最高为***/g。对采集自全国各地的38份疑似鸭肝炎肝脏病料进行单一荧光定量RT-PCR检测及双重荧光定量RT-PCR检测,二者检测结果一致,其中27份为dhav-1、7份为dhav-3、4份为dhav-1和dhav-3混合感染。对dhav-1和dhav-3混合感染鸭胚中dhav-1和dhav-3的增殖和分布进行检测,结果表明鸭胚各组织中dhav-1与dhav-3均在接种后60 h达到最大病毒含量,为108-1010 copies/g数量级;其中肌肉、心、肝、肌胃和肠dhav-1含量最高达10’0copies/g数量级,脑和尿囊液dhav-1含量最高约为109 copies/g数量级;脑、肌肉、心、肝、肌胃和肠dhav-3含量最高为108-109 copies/g数量级,尿囊液dhav-3含量最高达1010 copies/mL数量级。对不同比例病毒量混合接种死亡鸭胚尿囊液及胚体进行一步法双重rRT-PCR检测发现,当固定dhav-1接种量为10 copies时,随着dhav-3接种量的减少(108-104copies),死亡鸭胚尿囊液中dhav-3增殖拷贝数量级由108 copies/mL降至104copies/mL

关键词： dhav-1 dhav-3 双重荧光定量RT-PCR 鸭胚增殖规律

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鸭病毒性肝炎三价卵黄抗体的制备与应用

鸭病毒性肝炎三价卵黄抗体的制备与应用

作者：王栋伟山东农业大学

学位级别：硕士

鸭病毒性肝炎(Duck viral hepatitis,DVH)是由鸭肝炎病毒(Duck hepatitis virus,DHV)引起的一种以雏鸭痉挛、角弓反张和肝脏肿胀出血为主要特征的急性传染病。自1963年我国首次报道了鸭病毒性肝炎之后,在浙江、福建、北京、山东等地均... 详细信息

鸭病毒性肝炎(Duck viral hepatitis,DVH)是由鸭肝炎病毒(Duck hepatitis virus,DHV)引起的一种以雏鸭痉挛、角弓反张和肝脏肿胀出血为主要特征的急性传染病。自1963年我国首次报道了鸭病毒性肝炎之后,在浙江、福建、北京、山东等地均有该病的流行,患病雏鸭精神沉郁、垂头缩颈、行动呆滞,发病后短时间内迅速死亡,发病率可达100%,死亡率可达95%～100%。该病在我国一直以dhav-1和dhav-3的流行为主,但近几年来在我国山东等部分地区开始相继出现DAstV-1的感染,从而进一步加大了对鸭病毒性肝炎的防控难度,同时给我国养鸭业造成了巨大的经济损失。目前对于该病多种血清型的防控没有一个整体的预防和治疗措施。卵黄抗体是免疫蛋鸡的鸡蛋中提取的针对特定抗原的抗体,是卵黄中的一种免疫球蛋白,具有良好的稳定性、耐热性、耐酸性,同时安全、高效、无残留,治疗效果显著,特异性好,适合实际生产。本研究选用dhav-1、dhav-3及DAstV-1毒株制备鸭病毒性肝炎三价油乳剂灭活疫苗,对产蛋高峰期的蛋鸡进行免疫,制成了鸭病毒性肝炎三价卵黄抗体,研究制备的卵黄抗体对dhav-1、dhav-3及DAstV-1病的预防及治疗效果,从而为我国鸭病毒性肝炎病整体的预防与治疗提供一种有效、快速的生物制品,为鸭病毒性肝炎病的综合防控提供一定的技术支持。***-1、dhav-3及DAstV-1毒株的动物回归试验将本实验室前期已经分离鉴定保存的dhav-1、dhav-3及DAstV-1毒株作为疫苗株并进行动物回归试验。结果显示,当腿部肌肉注射0.4 mL dhav-1(TCID=10/0.1mL)病毒液后,雏鸭出现精神沉郁、采食下降、羽毛杂乱、角弓反张,并在短时间内死亡,对死亡雏鸭进行剖检可见肝脏肿大、密布针尖大小的出血点;当腿部肌肉注射0.4 mL dhav-3(TCID=10/0.1mL)病毒液后,雏鸭出现与dhav-1相似的临床症状及剖检变化,不同的是死亡时间相较于dhav-1要晚一些;当腿部肌肉注射0.2 mL DAstV-1(TCID=10/0.1mL)病毒液后,雏鸭出现与dhav-1相似的临床症状,但死亡时间和死亡率不及dhav快和高,剖检可见肝脏肿大、有出血点及带状出血,肾脏肿大出血。2.鸭病毒性肝炎三价油乳剂灭活疫苗的制备将三种抗原液经甲醛灭活后按1:1:1体积混合,与吐温-80按96:4的比例混合作为制备疫苗的水相,将油相与水相按2:1的比例进行乳化,制备鸭病毒性肝炎三价油乳剂灭活疫苗,并对疫苗进行性状检验。结果表明,抗原液最佳灭活条件为终浓度为1.0‰的甲醛37℃灭活24 h;性状检验结果表明,该疫苗为油包水型,离心稳定性良好,未见细菌、霉菌及支原体等微生物污染。3.鸭病毒性肝炎三价卵黄抗体的制备将制备的油乳剂灭活疫苗免疫蛋鸡,收集第四次免疫后的高免蛋制成卵黄抗体,利用鸭胚中和试验来检测卵黄抗体中dhav-1、dhav-3的效价,利用间接ELISA方法检测卵黄抗体中DAstV-1的效价。对提取的卵黄抗体进行性状检验、雏鸭预防保护试验及雏鸭攻毒治疗试验。卵黄抗体检测效价结果显示,收集第四次免疫后的高免蛋制成的卵黄抗体中dhav-1中和效价为2(1:143)、dhav-3中和效价为2(1:256)、DAstV-1 ELISA效价为2(1:512)。性状检验结果显示,该抗体为淡黄色透明澄清的液体,久置后会有少量白色沉淀。卵黄抗体安全性良好,3日龄雏鸭颈部皮下注射1.0 mL,未见局部红肿及全身性不良反应。雏鸭预防保护试验结果显示,当雏鸭在3日龄时分别腿部肌肉注射1 mL该卵黄抗体时,可以有效预防dhav-1、dhav-3及DAstV-1的侵害,预防保护效果良好。雏鸭攻毒治疗试验结果显示,当雏鸭感染病毒后,在感染病毒后6 h注射1.0 mL卵黄抗体对dhav-1、dhav-3的治愈率最高,在感染病毒后12 h注射1.0 mL卵黄抗体对DAstV-1的治愈率最高,治疗效果最好。综上所述,本研究制备的鸭病毒性肝炎三价卵黄抗体具有良好的预防保护效果,且对感染雏鸭具有较好的治疗效果,能够对目前我国主要流行的dhav-1、dhav-3及近几年来出现的DAstV-1的侵害起到良好预防和治疗作用,为当前我国对于鸭病毒性肝炎的预防与治疗提供了一种快速、有效的新型生物制品,为鸭病毒性肝炎病的综合防控提供了一定的技术支持。

关键词： dhav-1 dhav-3 DAstV-1 灭活疫苗卵黄抗体

鸭甲肝病毒3型2012年山东分离株VP1基因的序列分析

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病毒学报 2013年第5期29卷 522-528页

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为揭示近年来鸭甲肝病毒3型(dhav-3)中国分离株VP1基因的遗传变异规律,本研究对2012年从山东省分离到的13株dhav-3的VP1基因分别进行PCR扩增、序列测序与分析。结果显示,13株dhav-3的VP1基因均由720个核苷酸组成,共编码240个氨基酸,核... 详细信息

为揭示近年来鸭甲肝病毒3型(dhav-3)中国分离株VP1基因的遗传变异规律,本研究对2012年从山东省分离到的13株dhav-3的VP1基因分别进行PCR扩增、序列测序与分析。结果显示,13株dhav-3的VP1基因均由720个核苷酸组成,共编码240个氨基酸,核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别为94.6%～99.9%和95.0%～100%。与GenBank中公布的31株dhav-3的VP1基因的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为92.5%～100%和90.8%～100%。系统进化分析显示,dhav-3可分为两个基因型,其中除疫苗毒B63之外所有中国分离株均属于GⅠ型,越南分离毒株主要属于GⅡ型S1亚型,而韩国分离株组成GⅡ型中的S2亚型,具有明显的地域特征。

关键词： dhav-3 VP1基因序列分析 GenBank

表达1型和3型鸭甲型肝炎病毒VP1基因重组新城疫病毒的构建及其免疫原性

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中国兽医学报 2017年第9期37卷 1641-1647页

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为进一步研发安全有效的鸭甲型肝炎病毒(dhav)多价疫苗,本研究以新城疫病毒(NDV)LaSota弱毒疫苗株为载体,构建出共表达dhav-1和-3型VP1基因的重组病毒rLS-1VP1-2A-3VP1,并对其毒力、生物学特性进行鉴定。通过间接免疫荧光试验(IFA)验证dhav-1和-3型VP1蛋白在细胞内能够有效表达。利用Western blot进一步验证重组病毒产生的中和抗体能和dhav-1和dhav-3VP1表达蛋白发生较强的反应。重组病毒rLS-1VP1-2A-3VP1保持了原重组疫苗株rLS-RFP对鸡胚的高滴度生长适应和低致病的特性。将重组病毒rLS-1VP1-2A-3VP1免疫种鸭1次,通过中和试验检测该重组病毒能够在鸭体内产生针对dhav-1和dhav-3的中和抗体,平均效价分别为1∶18.17和1∶16.60。本研究结果表明重组病毒rLS-1VP1-2A-3VP1具有作为鸭肝炎重组病毒活载体疫苗用于种鸭的潜力。

关键词：鸭甲型肝炎病毒(dhav) dhav-1 dhav-3 反向遗传操作重组新城疫病毒