鸭Mx蛋白单克隆抗体的制备及DHAV-3感染鸭胚Mx蛋白表达模式的分析

作     者：郝春雪 

作者单位：东北农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：马波

授予年度：2018年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：鸭 Mx蛋白 单克隆抗体 DHAV-3 

摘      要：Mx蛋白是具有抗病毒活性的蛋白,在机体内由干扰素诱导产生,但目前鸭Mx蛋白抗病毒的具体机制尚未确定,制备可用于检测鸭Mx蛋白的单克隆抗体,有助于阐明鸭Mx蛋白的结构及其在抗病毒感染中的作用,为深入研究水禽Mx蛋白功能提供必要的物质基础。在分析本实验室已克隆的鸭Mx基因编码氨基酸的同源性及其抗原性的基础上,以实验室保存的重组质粒pMD19-T Simple Mx为模板,通过PCR扩增得到鸭Mx-A(1-300 bp)、Mx-B(1798-2163 bp)、Mx-C(418-939 bp)、Mx-CDS目的基因,并将鸭Mx的三段截短基因同时亚克隆至pET-30a(+)和pET-32a(+)原核表达载体中,构建原核重组表达载体,经重组蛋白的诱导表达,获得重组鸭Mx截短蛋白rDupET-30a-Mx-A、rDupET-30a-Mx-B、rDupET-30a-Mx-C、rDupET-32a-Mx-A、rDupET-32a-Mx-B、rDupET-32a-Mx-C。与此同时构建鸭Mx基因的真核表达质粒pcDNA3.1-Mx-CDS。以rDupET-30a-Mx-A、rDupET-30a-Mx-B、rDupET-30a-Mx-C作为免疫原,rDupET-32aMx-A、rDupET-32a-Mx-B、rDupET-32a-Mx-C作为检测原,进行了单克隆抗体的制备。经3次亚克隆获得了9株分泌抗鸭Mx蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别是2B6、4B6、2D10、3G5、5D5、1C4、3C2、3H4、4F7。分泌的单抗均可以和检测原产生特异性反应,其中6株可以与转染pcDNA3.1-Mx-CDS的DF-1细胞表达的鸭Mx蛋白产生特异性的反应,这6株杂交瘤细胞分别是针对Mx-A蛋白的2B6、4B6,针对Mx-B蛋白的2D10、3G5、5D5,针对Mx-C蛋白的1C4。单抗亚类鉴定的结果显示2B6、4B6、3G5、5D5、3H4株为IgG1亚类,1C4株为IgG2a亚类,2D10、3C2、4F7株为IgG2b亚类,根据9株单抗特异性的鉴定结果以及亚类的确定,从中挑选3株杂交瘤细胞(4B6、3G5、1C4)制备单抗腹水并测效价。应用4B6株单抗检测DHAV-3病毒感染15日龄SPF鸭胚后心脏、肝脏、脑组织、肌肉、肌胃组织、肠组织6个组织的Mx蛋白表达情况,Mx蛋白在不同组织中的表达存在差异且表达量随时间而变化。