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尼罗罗非鱼转录组与数字基因表达谱分析及Siglecs基因的表达研究

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尼罗罗非鱼转录组与数字基因表达谱分析及Siglecs基因的表达研究

作者：张蕊上海海洋大学

学位级别：硕士

尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）隶属于鲈形目（Percifomes）、丽鱼科(Cichlidae)、罗非鱼属(Tilapia)。因其具有适应性强、生长快、繁殖力高和食性广等优点，被联合国粮农组织定为向世界各国推荐的养殖对象。中国为罗非鱼养殖的... 详细信息

尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）隶属于鲈形目（Percifomes）、丽鱼科(Cichlidae)、罗非鱼属(Tilapia)。因其具有适应性强、生长快、繁殖力高和食性广等优点，被联合国粮农组织定为向世界各国推荐的养殖对象。中国为罗非鱼养殖的主要国家，罗非鱼养殖产量达到每年120万吨，占世界罗非鱼总产量的近50%。但近年来，由于养殖密度高、养殖环境恶化等原因，养殖罗非鱼暴发了链球菌病，导致养殖罗非鱼的大量死亡，造成巨大的经济损失并威胁着罗非鱼养殖业的健康发展。本研究分析了无乳链球菌攻毒前后尼罗罗非鱼的转录组与数字基因表达谱（Digital Gene Expression, dge）以探究细菌感染造成的罗非鱼转录组变化，进而选定了重要免疫受体基因Siglecs进行克隆以及序列分析和组织表达研究。这些研究将有助于加深认识罗非鱼抵御病原菌入侵的免疫应答机制，为制定合理有效的罗非鱼链球菌病防控措施以及罗非鱼养殖业的可持续健康发展提供科学依据。1.受无乳链球菌感染的尼罗罗非鱼转录组与数字基因表达谱分析本研究应用Illumina RNA-seq技术进行尼罗罗非鱼转录组研究，经SOAPdenovo软件拼接组装，最终得到82,799Unigenes (平均大小:618bp)。Unigenes通过与Nr, Swissprot, COG (Cluster of OrthologousGroups of proteins), KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)以及GO (Gene ontology)数据库进行BlastX比对，得到功能注释。以此转录组拼接Unigenes作为参考序列，结合dge技术，我们对无乳链球菌攻毒前后的尼罗罗非鱼转录组变化进行研究。结果得到774条表达显著上调的Unigenes以及625条表达显著下调的Unigenes，其中，293个差异表达基因能够注释到181条信号通路中，包括17条免疫相关的信号通路（涉及65个差异表达基因）。另外，我们还对Toll-likereceptor信号通路中的6个差异表达的基因进行了实时荧光定量PCR检测，结果验证了dge分析的可靠性。本研究得到的大量转录组组装序列丰富了罗非鱼基因序列资源，得到的差异表达基因及其相关通路分析为进一步了解罗非鱼抗链球菌感染机制以及其他免疫相关研究提供了宝贵资源。2.尼罗罗非鱼Siglec基因的克隆与组织表达分析克隆得到尼罗罗非鱼Siglec-1和Siglec-14基因。Siglec-1基因的ORF为1350bp，编码氨基酸449个。蛋白初级结构预测结果显示，Siglec-1具有信号肽1个，Ig-like结构域3个，跨膜结构域1个以及胞质区ITIM结构域1个。在系统进化树中，鱼类的Siglec-1聚为一支，哺乳类的则聚为另一支。Siglec-14基因的ORF为921bp，编码氨基酸306个。蛋白初级结构预测结果显示，Siglec-14具有信号肽1个，Ig-like结构域2个，跨膜结构域1个。实时荧光定量PCR分析结果显示，Siglec-1和Siglec-14均在尼罗罗非鱼各组织中广泛表达，其中，表达量最高的组织都是脾脏，其次是鳃和心脏，肝脏中表达量最低。本研究将为下一步进行无乳链球菌与尼罗罗非鱼Siglecs基因互作的相关研究奠定基础。

关键词：转录组 dge 差异表达基因 Siglec I型凝集素免疫

蛋白激发子MoHrip1诱导水稻抗病机理的研究

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蛋白激发子MoHrip1诱导水稻抗病机理的研究

作者：吕顺中国农业科学院

学位级别：硕士

水稻是一种世界范围内的重要粮食作物,每年受各种病害如稻瘟病的影响可能导致作物减产,严重威胁着世界人口的粮食需求。激发子是一类可以诱导植物产生防卫反应的特殊化合物,可以通过提高植物自身的免疫力来帮助植物抵御外界病原菌的侵... 详细信息

水稻是一种世界范围内的重要粮食作物,每年受各种病害如稻瘟病的影响可能导致作物减产,严重威胁着世界人口的粮食需求。激发子是一类可以诱导植物产生防卫反应的特殊化合物,可以通过提高植物自身的免疫力来帮助植物抵御外界病原菌的侵染以免受病害的损伤。近年来,关于病原真菌激发子的研究时有报道,但在其作用机理上的研究进展相对缓慢。MoHrip1是本实验室先前报道的从稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)中分离得到的一个分泌型蛋白类激发子,可以提高水稻对稻瘟菌和白叶枯菌的抗性。为研究MoHrip1诱导水稻获得抗病性的机理,本实验通过对MoHrip1处理后的水稻进行转录组测序和数字基因表达谱技术进行分析,研究MoHrip1诱导的水稻抗病性与水稻转录水平上基因表达之间的关系。同时对MoHrip1处理后水稻叶片水杨酸的含量和MoHrip1处理水稻种子后水稻幼苗的生长情况以及赤霉素含量进行检测,得出一些与MoHrip1诱导水稻抗病性相关的结论。本实验的具体研究结果如下:1.通过RNA-seq和dge分析获得水稻处理组与对照组的测序结果,得到308个差异表达基因,这些基因的差异表达可能与MoHrip1诱导植物抗病有关。通过对基因进行聚类分析,推测激发子的诱导可能激活色氨酸途径,促进植物体内生长素及其他以色氨酸为前体的物质的生物合成。2.用荧光定量PCR验证了测序数据的准确性,筛选兴趣基因并按照功能或编码产物特性进行分类,通过分析及验证推测植物抗毒素类物质是激发子诱导作用产生的主要抗生物质,水稻抗病性的增强可能与MoHrip1诱导的植物抗毒素的合成有关。同时根据基因表达特性筛选出激发子特异诱导表达基因共80个,可以作为激发子互作方面研究的候选基因。3.对激发子处理后水稻中水杨酸的含量进行了检测,根据结果推测处理组中水杨酸含量的升高是因为激发子诱导的水杨酸途径合成基因上调和茉莉酸途径抑制子基因上调共同作用的结果。水杨酸可能作为MoHrip1诱导的主要信号分子参与植物的抗病反应。4.对激发子处理水稻种子后幼苗的生长情况和赤霉素的含量进行了检测,根据结果推测水稻幼苗的促生长现象是由于内源赤霉素含量的升高引起的,而赤霉素含量的变化与激发子处理诱导的JAZs和DELLAs的交联作用被加强相关。本研究阐明了蛋白激发子能通过诱导水稻抗生类物质合成基因、抗病相关转录因子编码基因等的差异表达以及提高植物内源水杨酸的含量以使水稻获得抗病性,为研究激发子诱导抗病性的作用机理提供了数据支持和新的见解。在诱导植物产生抗病性的同时,MoHrip1处理还可以通过提高水稻幼苗赤霉素的含量以促进水稻的生长发育,为研究激发子在植物上的功能作用提供了新的实验数据和推论

关键词：激发子 MoHrip1 dge 抗病性水杨酸

宁都三黄鸡卵巢组织性早熟候选基因的筛选及功能分析

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宁都三黄鸡卵巢组织性早熟候选基因的筛选及功能分析

作者：梁桂桃江西农业大学

学位级别：硕士

宁都三黄鸡属于江西地区具有肉质鲜美和性早熟等特色的地方品种鸡,是优质的性早熟性状研究的遗传资源。性成熟是一个复杂的繁殖性状,若能找到控制该性状的主要基因或是主要代谢途径,能加快对性早熟的研究。但是目前对于宁都三黄鸡性早... 详细信息

宁都三黄鸡属于江西地区具有肉质鲜美和性早熟等特色的地方品种鸡,是优质的性早熟性状研究的遗传资源。性成熟是一个复杂的繁殖性状,若能找到控制该性状的主要基因或是主要代谢途径,能加快对性早熟的研究。但是目前对于宁都三黄鸡性早熟的遗传机制还未见报道。本试验前期通过对宁都三黄鸡性早熟未开产卵巢(P-F-O1)、性早熟开产卵巢(P-F-O2)、性晚熟未开产卵巢(L-F-O1)和性晚熟开产卵巢(L-F-O1)进行Tag-dge测序,并对部分差异表达基因开展qPCR验证及在广丰白耳黄鸡卵巢表达量分析,在此基础上进一步选取基因HEP21和SOX14进行在宁都三黄鸡中的突变位点搜寻及其与繁殖性状的关联分析,主要结果如下:⒈dge测序及功能富集分析:对测序结果进行统计分析,P-F-O1与P-F-O2比较后得到差异表达显著基因共有5083个,而在L-F-O1与L-F-O2比较中差异表达显著基因共有4201个。其中,仅在早熟鸡卵巢中出现的差异显著基因有1840个,仅在迟熟鸡卵巢中出现的差异显著基因有966个。在P-F-O1和P-F-O2对比组中差异表达的基因,按照GO条目,富集到分子功能、所处细胞位置和参与的生物学过程分别有38、34和52个GO term。在L-F-O1和L-F-O2对比组差异表达基因富集于这三大类的GO term分别有52、40、57条。对P-F-O1和P-F-O2差异表达的基因与KEGG数据库进行比对时,归类到69条生化途径,其中11条显著富集分别为:Ribosome、Intestinal immune network for IgA production、Neuroactive ligand-receptor interaction、Herpes simplex infection、Phagosome、Influenza A、Tryptophan metabolism、Cytokine-cytokine receptor interaction、Calcium signaling pathway、NOD-like receptor signaling pathway、Cell adhesion molecules(CAMs)。在L-F-O1和L-F-O2对比组中差异表达的基因与KEGG数据库进行比对时,归类到68条生化途径,其中12条显著富集分别为:Calcium signaling pathway、Intestinal immune network for IgA production、Neuroactive ligand-receptor interaction、Cardiac muscle contraction、Herpes simplex infection、Phagosome、Jak-STAT signaling pathway、Vascular smooth muscle contraction、Dorso-ventral axis formation、Cell adhesion molecules(CAMs)、Cytokine-cytokine receptor interaction、ECM-receptor interaction。⒉通过功能富集结合表达差异情况最终筛选出10个(VMO1、ASPG、BMP5、BMP15、INHA、INHBA、PTGS1、RRH、HEP21和SOX14)与繁殖相关的功能候选基因,开展基于荧光定量PCR(qRT-PCR)的验证分析及在广丰白耳黄鸡卵巢中表达量分析。结果显示,8个基因(BMP5、BMP15、INHA、INHBA、PTGS1、RRH、HEP21和SOX14)在宁都三黄鸡未开产和开产卵巢中表达趋势与测序结果一致,表明前期Tag-dge结果的准确性。基因SOX14、PTGS1和BMP15在广丰白耳黄鸡未开产和开产卵巢中表达差异不显著而其他基因差异显著,由此初步推测基因SOX14、PTGS1和BMP15或许为宁都三黄鸡母鸡性早熟特色基因的候选基因。⒊基因HEP21和SOX14突变位点与宁都三黄鸡繁殖性状关联分析表明,HEP21.A+550G位点与宁都黄鸡84日龄和91日龄的冠高显著相关(Pdge测序,初步筛选出影响性早熟的候选基因,为我国地方鸡品种遗传资源种质特性研究提供分子基础数据。

关键词： dge 差异基因宁都三黄鸡性早熟关联分析

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公鸡弱精症相关候选基因的筛选及功能研究

公鸡弱精症相关候选基因的筛选及功能研究

作者：富丽扬州大学

学位级别：硕士

在家禽生产中,据不完全统计,每年有5-12%的种公鸡因产精能力低下遭到淘汰。中国的大部分地方鸡品种更是存在繁殖效率低下的显著弱点,其公母配比高于专门化高产品种一倍以上,是产业化程度不高,良种繁育体系不健全的重要原因之一。为了探... 详细信息

在家禽生产中,据不完全统计,每年有5-12%的种公鸡因产精能力低下遭到淘汰。中国的大部分地方鸡品种更是存在繁殖效率低下的显著弱点,其公母配比高于专门化高产品种一倍以上,是产业化程度不高,良种繁育体系不健全的重要原因之一。为了探究公鸡弱精症的发病机理,本课题前期应用数字基因表达谱技术(Digital Gene Expression,dge)构建了无精症公鸡与正常公鸡的睾丸差异表达基因数据库。本研究用生物信息学方法重新分析dge数据库,挑选了与公鸡弱精症相关的6个候选基因(***, hPGDS、SPAG6、WNT2、CCNF),从300只42周龄的北京油鸡种公鸡的大群体中,进行了为期4周的精液品质检测,筛出弱精及正常个体各15只。采用RT-qPCR对这6个候选基因在两组个体的睾丸组织中的表达量进行了相对定量检测,来验证dge结果的可靠性。从验证的差异表达基因中挑选了CCNF (cyclin F),同时以鸡精原干细胞-SSCs、睾丸支持细胞、DF1细胞为实验模型,进行了三种细胞CCNF基因表达量的检测;采用RNAi技术,构建的4条慢病毒靶向干扰载体在三种细胞上做了转染效率和干扰效率的检测,筛选出最佳转染效率时病毒滴度/MOI值和最优干扰序列,应用RT-qPC R技术检测转染后24 h、48 h、72 h、96 h模式细胞中CCNF基因的mRNA水平的表达量;用CCK8法检测慢病毒载体siR-1侵染后模式细胞在不同时间点细胞周期的变化,为探索公鸡弱精症的发病机理的深入研究和最终寻找到致病潜在标志物做了基础铺垫。结果表明：1. RT-qPCR对dge中挑选的与弱精相关的6个候选基因的定量结果发现,COX7B、PTGDS在弱精组个体睾丸的表达量显著高于正常个体(Pdge的结果相吻合,说明dge结果可靠,确立了COX7B、PTGDS, WNT2、hPGDS、CCNF这5个基因可作为公鸡弱精症的重要候选基因。2.从前期初步验证的候选基因中挑选了CCNF基因,SSCs、睾丸支持细胞、DF1细胞的定量检测结果显示CCNF在这三种细胞的表达量相当,说明CCNF基因具有广泛表达特性。3.在三种模式细胞上的转染效率检测和干扰载体的筛选结果发现,当病毒液与培养基以1：19即滴度为5×106TU/mL、MOI=5,此条件下的慢病毒液侵染DF1和支持细胞效率可达60%,而在SSCs上的转染效率只有20%,说明慢病毒载体对SSCs侵染效果不佳。进而在DF1和支持细胞上的CCNF靶向siRNA干扰的定量检测结果显示siR-1转染两种细胞后在72 h和96 hCCNF基因表达量极显著下调(P<0.01),说明构建的干扰载体能有效沉默这两种细胞中CCNF基因的表达。4.在两种细胞上四个时间点CCK8检测细胞活力的结果发现,空白组和阴性对照组细胞活力均没有明显变化;与空白组相比,在siR-1干扰的支持细胞中,72 h和96 h这两个时间点的细胞活力极显著下降(P<0.01),而在siR-1干扰的DF1细胞中,72 h和96 h这两个时间点的细胞活力显著下降(P<0.05);两种细胞在相同干扰条件下,支持细胞增值变化强于DF1细胞。结果说明CCNF基因参与了细胞的增殖的调控,且随着其表达量的降低,细胞增殖也会随之下降或停滞。

关键词：弱精症 dge RT-qPCR CCNF基因 RNAi 慢病毒 SSCs

纳米ZnO对斑马鱼肝损伤及相关基因影响的研究

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纳米ZnO对斑马鱼肝损伤及相关基因影响的研究

作者：陈晓菲宁波大学

学位级别：硕士

nZnO因其特殊的颗粒尺寸及特有的物理化学性质，被广泛应用于各个领域。纳米技术和人造纳米材料的安全性（Manufactured Nanomaterials，MNMs）以及生物效应;健康、环境受到的不利影响也越来越被受到广泛的关注。在近年来的报道中，ZnO... 详细信息

nZnO因其特殊的颗粒尺寸及特有的物理化学性质，被广泛应用于各个领域。纳米技术和人造纳米材料的安全性（Manufactured Nanomaterials，MNMs）以及生物效应;健康、环境受到的不利影响也越来越被受到广泛的关注。在近年来的报道中，ZnO纳米颗粒对水生生物的毒性机制主要为产生的氧化应激或氧自由基（ROS），少量报道显示nZnO的基因毒性，如DNA损伤，而从分子角度研究ZnO纳米颗粒对水生生物毒性影响的还鲜有报道，特别是未见对斑马鱼肝组织损伤相关基因影响的报道。因此本研究以斑马鱼（Daniorerio）为受试生物，利用石蜡切片、生理生化检测、 RT-PCR、qPCR和数字基因表达谱（dge）等方法，从组织病理、生理生化和分子角度，研究ZnO纳米颗粒对肝组织损伤相关基因的影响，为深入研究纳米材料对水生生物毒性影响的分子机理及其在生态环境中的生物效应提供理论依据。 ZnO纳米颗粒表征为球形，粒径20±10nm，纯度较高。石蜡切片观察当ZnO纳米颗粒悬浮液浓度≥5.6mg·l-1时肝组织出现损伤现象。暴露不同浓度（2.8mg·l-1，5.6mg·l-1，11.2mg·l-1，22.4mg·l-1，44.8mg·l-1）ZnO纳米颗粒，斑马鱼肝组织中GSH含量与对照组相比显著（pdge分析得到差异基因的表达聚类模式、GO功能显著富集基因和Pathway显著富集基因。发现差异基因显著富集于细胞位置中的细胞器膜、细胞器、外膜和线粒体等，分子功能中的氧化还原酶活性等及代谢过程中的羧酸代谢、有机酸代谢、细胞铜代谢、小分子代谢和细胞氨基酸代谢等，并经KEGG富集分析，差异基因最显著富集的Pathway为线粒体氧化磷酸化途径。因此，ZnO纳米颗粒对斑马鱼肝组织损伤的影响主要为氧化应激，并且线粒体氧化磷酸化是影响是肝组织损伤的重要途径之一。

关键词：纳米ZnO 斑马鱼 dge

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松果体参与鹅就巢调控过程的分子网络构建

松果体参与鹅就巢调控过程的分子网络构建

作者：金雪梅四川农业大学

学位级别：硕士

鹅的季节性繁殖和强就巢性是导致其产蛋率低下,阻碍鹅产业发展的重要因素。松果体作为禽类脑部的重要神经内分泌腺,能将外界光刺激下转化为神经内分泌信号,通过多种代谢途径间接或直接对动物的产蛋、就巢过程起调控作用。为了探究松果... 详细信息

鹅的季节性繁殖和强就巢性是导致其产蛋率低下,阻碍鹅产业发展的重要因素。松果体作为禽类脑部的重要神经内分泌腺,能将外界光刺激下转化为神经内分泌信号,通过多种代谢途径间接或直接对动物的产蛋、就巢过程起调控作用。为了探究松果体在鹅就巢过程中基因差异性表达的分子网络机制,本实验分别以产蛋期和就巢期鹅松果体为实验材料,进行Illumina/Solexa测序及数字基因表达谱(dge)分析,以期对松果体组织在鹅就巢过程中呈现差异性表达的基因进行鉴别及筛选,并对其进行GO分析和KEGG pathway分析。主要研究结果如下：1.在构建的产蛋组和就巢组文库中分别检测到1.85G和1.51G的Raw read序列数据,经过一系列质量控制过滤之后,得到了可信度较高的1.82G和1.48G的Clean read序列。2.利用RSEM软件,将产蛋组、就巢组过滤后的测序序列分别进行基因组定位分析,两组所得定位百分比均接近90%(产蛋组89.49%;就巢组89.84%)。3.通过dge技术,在就巢期和产蛋期的松果体组织中共检测到99个差异性表达的基因,其中有20个基因表达上调,79个基因表达下调。4.本实验通过对差异表达基因进行GO功能分类及Pathway分析,发现这些差异表达基因共参与了95个调控通路,其中主要显著富集在色氨酸代谢通路、光传导通路、血清素激活神经元通路、甘油脂质代谢通路、叶酸生物合成等通路,进一步证明了松果体在鹅产蛋性能和繁殖性能中起着重要作用。5.就巢组和产蛋组的松果体差异表达基因主要富集在对光刺激的感光知觉功能上,松果体的感光知觉是调控鹅就巢过程的关键因素。6.获得了松果体在就巢组和产蛋组中差异表达基因的分子网络图,揭示差异表达基因参与了鹅就巢过程中的氨基酸代谢、核苷酸代谢、维生素代谢、能量代谢、脂质代谢等多个代谢过程,并显著富集在光传导通路中,对视杆细胞中视黄醇的代谢发挥着重要作用。

关键词：鹅松果体就巢产蛋 dge

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转录组今日:微阵列、RNA测序的技术革命

科学新闻 2015年第22期 78-81页

作者： Chris Tachibana 高大海姜天海中国科学院海洋研究所

随着微阵列和当今RNA测序技术的发展,基因表达分析已经开始常规化,帮助研究人员发现新RNA的类型和变体。新技术有希望揭示更多RNA的奥秘,让基于RNA的临床试验变得更为普遍。当Paul McGettigan需要分析一批母牛子宫样品的特性时,他从转... 详细信息

随着微阵列和当今RNA测序技术的发展,基因表达分析已经开始常规化,帮助研究人员发现新RNA的类型和变体。新技术有希望揭示更多RNA的奥秘,让基于RNA的临床试验变得更为普遍。当Paul McGettigan需要分析一批母牛子宫样品的特性时,他从转录组学(一种RNA水平的样品分析)开始入手。McGettigan是爱尔兰都柏林大学农业和食品科学院的研究员,从事牛类的生殖生物学研究,他的项目以对表达基因的概述为起点,用来指导蛋白质组、代谢组和其他方法的后续分析。"转录组学是开始着手时信息量最大的试验方式。"他说。

关键词：测序技术 dge 转录组学 RNA 微阵列

红霉素加快胰十二指肠切除后胃排空──前瞻性随机对照研究

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普外基础与临床杂志 1994年第1期1卷 63-64页

作者：叶辉

红霉素加快胰十二指肠切除后胃排空──前瞻性随机对照研究［英〕／ＣｈａｒｓｌｅｓＪ…斤Ａｎ－ｎａｌｓＳｕｒｇｅｒｙ．１９９３；２１８（３）。２２９。２３８胰十二指肠切除术后常发生胃排空延迟（Ｄｅｌａｙｅｄｇａｓｔｒｉｃ... 详细信息

红霉素加快胰十二指肠切除后胃排空──前瞻性随机对照研究［英〕／ＣｈａｒｓｌｅｓＪ…斤Ａｎ－ｎａｌｓＳｕｒｇｅｒｙ．１９９３；２１８（３）。２２９。２３８胰十二指肠切除术后常发生胃排空延迟（ＤｅｌａｙｅｄｇａｓｔｒｉｃｅｍＰｔｙｉｎｇ，ＤＧＥ），其发生...

关键词：红霉素胃排空随机对照研究胰十二指肠切除术发生率 dge 术后早期血循环吻合口漏胃动素

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胰十二指肠切除术后的胃排空障碍

胰腺病学 2006年第4期6卷 239-242页

作者：朱怀宇单毅车旭胡士杰中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤医院腹部外科北京100021

胃排空障碍（delayed gastric emptying，dge），又称胃瘫（gastroparesis），是胰十二指肠切除术后常见的并发症，其发生率各报道不同，在7％～41％之间（表1）。但多数报道dge位于胰十二指肠切除术后并发症的首位，与其他并发症（胰... 详细信息

胃排空障碍（delayed gastric emptying，dge），又称胃瘫（gastroparesis），是胰十二指肠切除术后常见的并发症，其发生率各报道不同，在7％～41％之间（表1）。但多数报道dge位于胰十二指肠切除术后并发症的首位，与其他并发症（胰瘘、出血、腹腔感染）相比，虽不会危及生命，但对于患者来说，却延长了住院时间，增加了医疗费用，加重了痛苦。

关键词：胰十二指肠切除胃排空障碍肠切除术后术后并发症腹腔感染住院时间医疗费用发生率 dge