尼罗罗非鱼转录组与数字基因表达谱分析及Siglecs基因的表达研究

作     者：张蕊 

作者单位：上海海洋大学 

学位级别：硕士

导师姓名：叶星

授予年度：2013年

学科分类：0908[农学-水产] 09[农学] 

主      题：转录组 DGE 差异表达基因 Siglec I型凝集素 免疫 

摘      要：尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）隶属于鲈形目（Percifomes）、丽鱼科(Cichlidae)、罗非鱼属(Tilapia)。因其具有适应性强、生长快、繁殖力高和食性广等优点，被联合国粮农组织定为向世界各国推荐的养殖对象。中国为罗非鱼养殖的主要国家，罗非鱼养殖产量达到每年120万吨，占世界罗非鱼总产量的近50%。但近年来，由于养殖密度高、养殖环境恶化等原因，养殖罗非鱼暴发了链球菌病，导致养殖罗非鱼的大量死亡，造成巨大的经济损失并威胁着罗非鱼养殖业的健康发展。本研究分析了无乳链球菌攻毒前后尼罗罗非鱼的转录组与数字基因表达谱（Digital Gene Expression, DGE）以探究细菌感染造成的罗非鱼转录组变化，进而选定了重要免疫受体基因Siglecs进行克隆以及序列分析和组织表达研究。这些研究将有助于加深认识罗非鱼抵御病原菌入侵的免疫应答机制，为制定合理有效的罗非鱼链球菌病防控措施以及罗非鱼养殖业的可持续健康发展提供科学依据。 1.受无乳链球菌感染的尼罗罗非鱼转录组与数字基因表达谱分析 本研究应用Illumina RNA-seq技术进行尼罗罗非鱼转录组研究，经SOAPdenovo软件拼接组装，最终得到82,799Unigenes (平均大小:618bp)。Unigenes通过与Nr, Swissprot, COG (Cluster of OrthologousGroups of proteins), KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)以及GO (Gene ontology)数据库进行BlastX比对，得到功能注释。以此转录组拼接Unigenes作为参考序列，结合DGE技术，我们对无乳链球菌攻毒前后的尼罗罗非鱼转录组变化进行研究。结果得到774条表达显著上调的Unigenes以及625条表达显著下调的Unigenes，其中，293个差异表达基因能够注释到181条信号通路中，包括17条免疫相关的信号通路（涉及65个差异表达基因）。另外，我们还对Toll-likereceptor信号通路中的6个差异表达的基因进行了实时荧光定量PCR检测，结果验证了DGE分析的可靠性。本研究得到的大量转录组组装序列丰富了罗非鱼基因序列资源，得到的差异表达基因及其相关通路分析为进一步了解罗非鱼抗链球菌感染机制以及其他免疫相关研究提供了宝贵资源。 2.尼罗罗非鱼Siglec基因的克隆与组织表达分析 克隆得到尼罗罗非鱼Siglec-1和Siglec-14基因。Siglec-1基因的ORF为1350bp，编码氨基酸449个。蛋白初级结构预测结果显示，Siglec-1具有信号肽1个，Ig-like结构域3个，跨膜结构域1个以及胞质区ITIM结构域1个。在系统进化树中，鱼类的Siglec-1聚为一支，哺乳类的则聚为另一支。Siglec-14基因的ORF为921bp，编码氨基酸306个。蛋白初级结构预测结果显示，Siglec-14具有信号肽1个，Ig-like结构域2个，跨膜结构域1个。实时荧光定量PCR分析结果显示，Siglec-1和Siglec-14均在尼罗罗非鱼各组织中广泛表达，其中，表达量最高的组织都是脾脏，其次是鳃和心脏，肝脏中表达量最低。本研究将为下一步进行无乳链球菌与尼罗罗非鱼Siglecs基因互作的相关研究奠定基础。