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白菜型油菜dead-box解旋酶基因BrDHC1响应干旱胁迫的功能研究

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白菜型油菜DEAD-box解旋酶基因BrDHC1响应干旱胁迫的功能研究

作者：江文静郑州大学

学位级别：硕士

dead-box解旋酶主要通过ATP的水解获得能量催化DNA/RNA的解旋,在DNA复制、修复、重组、转录、核糖体生物发生和翻译起始等细胞基本过程中发挥重要作用。目前,关于dead-box解旋酶在多种植物中对干旱、高盐、低温、高温等非生物胁迫的耐... 详细信息

dead-box解旋酶主要通过ATP的水解获得能量催化DNA/RNA的解旋,在DNA复制、修复、重组、转录、核糖体生物发生和翻译起始等细胞基本过程中发挥重要作用。目前,关于dead-box解旋酶在多种植物中对干旱、高盐、低温、高温等非生物胁迫的耐受性已经被证实,因此利用其开发抗逆性植物具有巨大的应用前景。干旱会严重阻碍植物的生长,造成作物产量和品质下降。BrDHC1蛋白作为dead-box解旋酶的成员之一,在植物中还尚未有研究,对其生物学功能也尚未可知。为了探究BrDHC1基因对干旱胁迫的响应,本研究以白菜型油菜为实验材料,通过创制RNA干扰BrDHC1转基因植株和过表达BrDHC1转基因植株来探究植株对干旱胁迫的响应,从形态特征、生理指标和相关胁迫基因的表达分析来揭示BrDHC1抗旱的机制。主要研究结果如下:(1)通过生物信息学研究发现,拟南芥中At3g02060基因与白菜型油菜的BrDHC1基因是同源基因,基因三倍化事件后,白菜型油菜中BrDHC1只保留了一个拷贝。TAIR数据库检索分析发现,At3g02060是dead-box蛋白家族ATP依赖的DNA解旋酶,推测BrDHC1也是dead-box蛋白家族中的DNA解旋酶。此外,通过对BrDHC1构建系统发育树、功能结构域和启动子顺式作用元件分析推测,该基因可能参与对干旱胁迫的响应。(2)实时荧光定量PCR检测BrDHC1在不同组织的表达量,结果发现BrDHC1基因在白菜型油菜幼叶中表达量最高。构建p CAMBIAsuper1300-BrDHC1-EGFP载体,以1300-EGFP载体为对照,进行烟草叶片的侵染,制备烟草叶片的原生质体来探究BrDHC1蛋白的定位,结果显示BrDHC1蛋白定位在叶绿体中。(3)在干旱胁迫响应研究中,与野生型植株相比,过表达BrDHC1转基因白菜型油菜的种子萌发率提高,根系发达,叶片气孔闭合,叶片正常展开,叶色呈现绿色,叶片保持较高的相对含水量,失水率降低,减少了叶片水分的流失,提高了植株叶片的水分利用率;而RNA干扰BrDHC1转基因白菜型油菜的种子萌发率显著下降,根系的下伸程度低,发育迟缓,叶片气孔开放程度大,叶片褶皱卷曲,叶色呈现黄色,叶片的相对含水量低,失水率高,不利于在干旱环境下生长。这表明过表达BrDHC1植株对干旱适应力更强,而RNA干扰BrDHC1植株对干旱的适应力较弱。(4)对干旱胁迫下各植株进行生理指标测定发现,与野生型植株相比,过表达BrDHC1植株的叶绿素a和叶绿素b含量升高,可以提高光合利用率,抗氧化酶体系SOD、POD、CAT酶活力显著提高,可以有效清除积累的活性氧(ROS),渗透调节物脯氨酸和可溶性糖含量也显著升高,丙二醛(MDA)含量增加,但增加速率缓慢,膜脂氧化程度较低,受损程度较轻;RNA干扰BrDHC1转基因植株叶绿素a和叶绿素b含量降低,光合作用下降,抗氧化酶体系SOD、POD、CAT酶活性降低,渗透调节物脯氨酸和可溶性糖含量也有所降低,丙二醛(MDA)含量显著增加,膜脂受损程度严重。此外,我们发现胁迫相关基因NAC2、MYB44、ABRE2等表达量在过表达BrDHC1植株中显著上调,而在RNA干扰BrDHC1植株中显著下调。进一步表明,过表达BrDHC1植株具有抗旱性,而RNA干扰BrDHC1植株对干旱胁迫敏感。本研究从表型观察、生理指标检测和相关胁迫基因的表达进行综合分析,结果表明BrDHC1基因的过表达更有利于增强植株在干旱胁迫下的耐受性,白菜型油菜BrDHC1对植株的生长发育起正向调控作用。

关键词：白菜型油菜 dead-box解旋酶 BrDHC1 干旱胁迫叶绿体

罗布麻dead-box解旋酶基因（AvDH1）的转录分析与功能验证

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罗布麻DEAD-box解旋酶基因（AvDH1）的转录分析与功能验证

作者：刘怀华山东农业大学

学位级别：硕士

土壤盐渍化抑制作物生长,降低农产品产量,是影响农业生产和生态环境的严重问题,而且土壤盐渍化的耕地面积正逐年增加。植物的耐盐性又是一个复杂的数量性状,涉及诸多基因和多种耐盐机制的协调作用,具体作用机制仍未阐明。因此,研究植物... 详细信息

土壤盐渍化抑制作物生长,降低农产品产量,是影响农业生产和生态环境的严重问题,而且土壤盐渍化的耕地面积正逐年增加。植物的耐盐性又是一个复杂的数量性状,涉及诸多基因和多种耐盐机制的协调作用,具体作用机制仍未阐明。因此,研究植物耐盐相关基因的功能具有重要意义,不仅有利于植物耐盐分子机制具体作用途径的明确;而且有利于基因工程有效地提高转基因作物的耐盐性。本研究对罗布麻dead-box解旋酶的基因(AvDH1)的表达特性进行了分析,对AvDH1转化棉花新品系鲁613获得的转化株系进行了耐盐性鉴定,获得主要结果如下:1.非生物胁迫下罗布麻中AvDH1基因的表达:Northern杂交分析表明,AvDH1基因受盐胁迫诱导表达,而且其mRNA的含量随着盐浓度的增加而增加;在盐胁迫下该基因在罗布麻的根、茎及叶片各组织中组成型表达;这些说明在盐胁迫下AvDH1基因对于维持细胞基本功能可能具有重要作用。在罗布麻的根、茎及叶片各组织中该基因也受低温胁迫诱导表达,但是其表达量随着时间的延长逐渐降低,而在渗透胁迫处理下AvDH1基因不表达,这说明AvDH1基因为盐诱导特异表达基因。在外施脱落酸的处理下该基因也不表达,这说明该基因受到不依赖于脱落酸的盐胁迫信号转导途径的调节。2.利用花粉管通道技术将AvDH1基因导入鲁613棉花中,获得的种子在含盐量为0.5%的盐池进行筛选,获得4个耐盐单株,对耐盐单株自交形成的株系进行卡那霉素田间筛选,株系T40252全为阳性表现,这说明其基因型为纯合型,株系T42047和T40224卡那霉素抗性植株与非抗性植株的比例接近3:1,经标准误差法检验,这两个株系的观察值和理论值之间相符,符合孟德尔一对显性遗传性状的分离规律,这说明其基因型为杂合型;而T41705全为阴性表现,这说明其可能为假阳性植株。对选至分离株系的抗性植株进行自交,通过T3抗感单株的分离比例分析,进一步验证了杂合型符合3:1的孟德尔一对显性遗传性状的分离规律。从3个株系中随机选择的抗性植株进行特异PCR扩增检测,抗性单株均扩增出大约225bp的目的片段,这与阳性质粒扩增片段大小相同,而受体鲁613对照无此片断。进行PCR-Southern杂交分析,转基因株系检出片断与阳性质粒检出片断相同,而受体鲁613对照无片断检出,此结果与PCR检测结果一致,分子杂交结果表明AvDH1基因已经整合入受体棉花鲁613的基因组中,并且稳定的遗传。3.选择T2代株系中分子杂交表现为阳性的单株和受体鲁613的单株,在盐胁迫条件下,进行花粉萌发鉴定,结果表明在盐胁迫下转基因株系的花粉萌发率高于受体,差异达到极显著水平;对转基因单株和受体倒四叶,进行叶片耐盐鉴定,结果表明,在150mmol/L的NaCl浓度下,受体鲁613的叶片变黄,叶绿素含量下降了24.3%,而T42047、T40252和T40224的表现趋于一致,仅下降了约5%,显著高于对照;其中转基因株系T40252在300mmol/L的NaCl浓度下,叶片才开始变黄,这表明转基因棉花叶片的耐盐性高于对照。4.选择T3代稳定纯合的株系,进行盆栽耐盐性鉴定,结果表明在在300mmol/L的NaCl浓度下,转基因株系的生长虽然受到一定程度的影响,但是,仍然保持存活,而受体鲁613种子不能萌发或者生长过程中萎蔫死亡;在100mmol/L与200mmol/L各转基因株系株高与存活率均显著高于对照。对盐胁迫转基因株系受体鲁613的SOD酶活性变化分析表明,在100mmol/L的NaCl浓度下,各株系SOD酶的比活与对照表现趋于一致,均有大幅上升。在200mmol/L的NaCl浓度下,鲁613子叶SOD酶的活性仅略有上升,而T42047、T40252和T40224子叶SOD酶的活性表现趋于一致,增长了约30%,明显高于对照;在100、200mmol/L的NaCl胁迫下,转基因株系T42047、T40252和T40224的相对电导率均显著低于受体鲁613。以上结果表明三个转AvDH1基因棉花纯合株系的耐盐性显著提高。5.核酸序列的预测分析表明:AvDH1基因所编码的氨基酸序列与拟南芥中一个dead-box解旋酶的序列高度同源,具有73%的一致性,共447个氨基酸残基组成,预测的分子量为50478Da,等电点为7.61。AvDH1基因的翻译产物具有dead-box家族所有的9个保守基序,位于氨基酸序列的第33-365个之间。其SAT基序为Thr-Ala-Thr,与其它dead-box家族不同;在羧基末端,即氨基酸序列中第365-447之间,存在两个参与RNA结合的RGG-box基序,还具有细胞核定位信号序列,KKSRKEKK。

关键词： AvDH1 dead-box解旋酶罗布麻棉花盐胁迫

dead-box RNA解旋酶家族在天然免疫应答信号通路中的作用

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微生物学报 2021年第3期61卷 587-595页

作者：许淑娟谢晶莹冯若飞西北民族大学生物医学研究中心生物工程与技术国家民委重点实验室甘肃兰州730030 甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070

病毒入侵宿主细胞时,宿主细胞启动抑制病毒复制的免疫机制。同样,病毒也会利用多种手段去逃避先天免疫感应机制的监测以及宿主细胞对外来者的降解,同时还会操纵宿主细胞为自身的增殖提供便利。dead-box解旋酶家族是一类存在于宿主细胞... 详细信息

病毒入侵宿主细胞时,宿主细胞启动抑制病毒复制的免疫机制。同样,病毒也会利用多种手段去逃避先天免疫感应机制的监测以及宿主细胞对外来者的降解,同时还会操纵宿主细胞为自身的增殖提供便利。dead-box解旋酶家族是一类存在于宿主细胞中的功能蛋白,它们在转录、剪接、mRNA的合成和翻译等多种细胞过程中起着关键作用。该家族成员拥有识别RNA的能力以及参与多个细胞过程,所以它们可以以多种方式影响病毒感染宿主细胞后引起的天然免疫应答。本文就近年来有关于dead-box RNA解旋酶在天然免疫方面的研究进行综述,以期为相关研究提供材料支撑。

关键词： dead-box解旋酶 RNA识别病毒逃逸天然免疫

低温胁迫下红榄李(Lumnitzera littorea)dead-box RNA解旋酶基因的表达分析

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热带海洋学报 2022年第6期41卷 44-55页

作者：郝露露柯明思朱奕秀许燕敏张颖郑春芳温州大学生命与环境科学学院浙江温州325035 岭南师范学院生命科学与技术学院广东湛江524048 海南省林业科学研究(海南省红树林研究院) 海南海口571129

转录组分析发现dead-box RNA解旋酶家族参与红榄李(Lumnitzera littorea)对低温胁迫的响应。本文对4个低温显著差异表达基因Lldead12,Lldead32,Lldead43和Lldead65的生物信息学特性、组织特异性以及在不同温度处理下的红榄李幼苗中的差... 详细信息

转录组分析发现dead-box RNA解旋酶家族参与红榄李(Lumnitzera littorea)对低温胁迫的响应。本文对4个低温显著差异表达基因Lldead12,Lldead32,Lldead43和Lldead65的生物信息学特性、组织特异性以及在不同温度处理下的红榄李幼苗中的差异表达进行研究。结果表明,Lldead12、Lldead32、Lldead43和Lldead65均属于疏水性蛋白,二级结构均由α-螺旋、β-转角、延伸链和无规则卷曲组成,具有多个糖基化位点和磷酸化位点,且不含有跨膜结构域和信号肽。亚细胞定位分析表明,Lldead12和Lldead32分别定位于细胞质和细胞核,而Lldead43和Lldead65则定位于线粒体上。通过蛋白质氨基酸序列的比对分析发现Lldead12、Lldead32和Lldead43分别与马尾松(Pinus massoniana)、巨桉(Eucalyptus grandis)和石榴(Punica granatum)的dead-box RNA解旋酶有较近的亲缘关系。荧光定量PCR技术分析发现,Lldead12和Lldead32在叶中高表达,Lldead43和Lldead65在茎和花中高表达,但这4个基因在根中都不表达,说明这4个基因对红榄李生长发育的调控主要集中在叶、茎和花等器官。低温胁迫对红榄李幼苗这4个基因的表达均有显著的抑制,说明它们参与了红榄李在低温环境下的分子响应,其中Lldead12和Lldead32可能参与了叶绿体的发育, Lldead43和Lldead65可能参与到了维持线粒体功能的稳定。以上结果可为红榄李抗冷性苗木的培育提供科学依据。

关键词：红树林红榄李 dead-box解旋酶低温胁迫生物信息学分析

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拟穴青蟹DDX5基因的表达及功能初步分析

应用海洋学学报 2024年第2期43卷 225-235页

作者：赵逗裟姚成杰张子平王艺磊集美大学水产学院、农业农村部东海海水健康养殖重点实验室福建厦门361021 福建农林大学海洋学院福建福州350002

拟穴青蟹(Scylla paramamosain)是我国东南沿海重要的经济养殖蟹类之一。DDX5基因是dead-box解旋酶基因家族中的成员,已有研究表明其在生殖细胞的成熟分化及功能维持中起重要的调控作用。我们从拟穴青蟹转录组数据库中筛选获得了DDX5(Sp... 详细信息

拟穴青蟹(Scylla paramamosain)是我国东南沿海重要的经济养殖蟹类之一。DDX5基因是dead-box解旋酶基因家族中的成员,已有研究表明其在生殖细胞的成熟分化及功能维持中起重要的调控作用。我们从拟穴青蟹转录组数据库中筛选获得了DDX5(SpDDX5)基因序列,采用实时荧光定量PCR技术分析了其在成熟青蟹各组织、性腺各发育时期及胚胎各发育时期的表达模式。此外,利用RNAi技术分析了SpDDX5在性腺发育中可能发挥的作用。结果如下:SpDDX5的开放阅读框长1 893 bp,编码630个氨基酸,具有DEXDc和HELICc两个结构域。SpDDX5在拟穴青蟹的各组织中广泛表达,且在精巢中的表达水平明显高于其他组织(P<0.05);在精巢发育过程中,SpDDX5的表达水平逐渐降低;在胚胎发育过程中,SpDDX5的表达水平逐渐升高。干扰SpDDX5后,生殖细胞分子标记基因Vasa和Nanos表达上调,性腺发育相关基因foxl-2表达下调,Dmrt家族基因Dsx表达上调,Dmrt-like和idmrt-2表达下调。根据以上结果,我们推测SpDDX5基因可能在拟穴青蟹生殖细胞发育和精巢发育中发挥重要作用。

关键词：海洋生物学 DDX5基因 dead-box解旋酶 RNAi 生殖细胞发育精巢发育拟穴青蟹

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DDX5蛋白抑制宿主先天性免疫的初步研究

DDX5蛋白抑制宿主先天性免疫的初步研究

作者：马振邦江西农业大学

学位级别：硕士

宿主细胞dead-box(DDX)家族蛋白是一种结构高度保守且数量众多的RNA解旋酶,主要参与宿主细胞基因的转录调控。然而,近年来的研究表明,DDX家族蛋白还参与宿主的先天性免疫反应,在I型干扰素(IFN-I)的产生及炎症反应方面发挥重要作用。DDX... 详细信息

宿主细胞dead-box(DDX)家族蛋白是一种结构高度保守且数量众多的RNA解旋酶,主要参与宿主细胞基因的转录调控。然而,近年来的研究表明,DDX家族蛋白还参与宿主的先天性免疫反应,在I型干扰素(IFN-I)的产生及炎症反应方面发挥重要作用。DDX5蛋白是DDX家族的重要成员,其不仅在细胞生长发育及肿瘤发生发展中发挥作用,而且在多种病毒的感染过程中影响病毒的复制。然而其作用机制尚不清楚,我们在前期研究中发现,MDV可以调控宿主DDX5蛋白来抑制宿主先天性免疫反应,并促进病毒在鸡胚成纤维细胞上的生长,这表明DDX5在禽类先天性免疫过程中发挥重要作用。然而,DDX5是否在哺乳动物先天性免疫过程中发挥同样的作用尚未见报道。为了进一步证实DDX5蛋白调控哺乳动物的先天性免疫反应。本研究采用水疱性口炎病毒(VSV)分别感染DDX5基因敲降或过表达的小鼠成纤维细胞,通过测定病毒诱导的IFN-β和IL-6 m RNA转录水平、细胞上清IFN-β和IL-6的含量及对病毒复制的影响,结果发现DDX5显著性抑制病毒感染后IFN-β和IL-6的产生并增强病毒的复制,研究表明DDX5在先天性免疫中作为一个负抗病毒调节因子来抑制病毒感染后IFN-β和IL-6的产生并且促进病毒的复制;采用CRISPR/Cas9技术构建DDX5基因缺失小鼠,对其后代与野生型后代小鼠使用VSV与仙台病毒(Se V)进行攻毒实验,通过ELISA测定比较两种不同小鼠巨噬细胞培养上清和血清中IFN-β和IL-6的分泌量,并测定小鼠体内器官(肺、肝、脾)中病毒的复制滴度,同时进行组织病理学分析,结果显示病毒感染后,DDX5小鼠相对于野生型子代小鼠,血清中IFN-β和IL-6的产量显著增加,并且DDX5小鼠的肺间质性肺炎较少,肝脏损伤较轻,脾脏病变较少,研究表明DDX5蛋白在小鼠体内通过负调控先天性免疫,促进病毒复制并加强了病毒导致的组织损伤;为进一步探索作用机制,通过Pull down和Co-IP实验筛选鉴定出与DDX5相互作用的宿主蛋白靶蛋白METTL3,通过分析DDX5/METTL3的结构域,分别构建DDX5截短体和METTL3截短体鉴定蛋白相互作用的功能域,结果发现DDX5与METTL3之间的分子相互作用需要有METTL3的N端结构域和DDX5的P68HR结构域,研究证实DDX5通过其P68HR区域和METTL3的N端相互作用。综上所述,我们首次证明DDX5蛋白在哺乳动物细胞内负调控IFN-β和IL-6的产生,其通过P68HR结构域与宿主细胞METTL3蛋白的N端区域相互作用。研究结果不仅为DDX5在病毒感染先天性免疫过程中的作用机制的研究提供基础,也为新型的抗病毒药物研发提供潜在靶点。

关键词：先天性免疫 dead-box解旋酶 DDX5 METTL3 IFN-β

甘薯盐胁迫诱导Ibdead1基因的克隆、生物信息学及表达分析

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江苏师范大学学报（自然科学版） 2017年第3期35卷 23-29页

作者：朱明库孟小庆蔡敬李格李宗芸江苏师范大学生命科学学院/江苏省药用植物生物技术重点实验室江苏徐州221116

dead-box解旋酶是植物中最大的解旋酶家族,不仅在几乎所有涉及DNA/RNA代谢的细胞过程中发挥关键作用,而且还广泛参与植物生长发育与胁迫响应过程.目前,甘薯中有关dead-box基因的功能研究尚未见报道.本研究以耐盐性品种徐薯22与盐敏感性... 详细信息

dead-box解旋酶是植物中最大的解旋酶家族,不仅在几乎所有涉及DNA/RNA代谢的细胞过程中发挥关键作用,而且还广泛参与植物生长发育与胁迫响应过程.目前,甘薯中有关dead-box基因的功能研究尚未见报道.本研究以耐盐性品种徐薯22与盐敏感性品种徐薯32为研究材料,通过RNA-seq及生物信息学分析,首次从甘薯中筛选出一个受盐胁迫诱导的dead-box基因,命名为Ibdead1.根据转录组分析的测序结果设计引物,从徐薯22中克隆出该基因的全长序列(GenBank登录号:MF043568).序列分析表明,Ibdead1基因包含一个1 701bp的开放阅读框,编码566个氨基酸.序列分析显示Ibdead1蛋白具有一个dead-box蛋白典型的解旋酶中心和多个磷酸化位点,且为dead-box RNA解旋酶.系统进化树及qRT-PCR分析均表明,Ibdead1基因可能在甘薯盐胁迫响应过程中发挥重要作用.这些结果为进一步研究Ibdead1基因在甘薯盐胁迫响应中的功能奠定了基础.

关键词：甘薯 dead-box解旋酶生物信息学表达分析

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真核翻译起始因子4A研究进展与展望

山东农业科学 2014年第11期46卷 143-147页

作者：周玉梅祖从从周建峰中国海洋大学海洋药物教育部重点实验室山东青岛266003

真核翻译起始因子4A(eIF4A)蛋白属于dead-box RNA解旋酶家族,具有RNA依赖的ATP酶活性和ATP依赖的RNA解旋酶活性。脊椎动物中已经鉴定出三种eIF4A:eIF4A1、eIF4A2和e IF4A3。除参与翻译起始,eIF4A家族成员在胚胎发育等多种生命过程中也... 详细信息

真核翻译起始因子4A(eIF4A)蛋白属于dead-box RNA解旋酶家族,具有RNA依赖的ATP酶活性和ATP依赖的RNA解旋酶活性。脊椎动物中已经鉴定出三种eIF4A:eIF4A1、eIF4A2和e IF4A3。除参与翻译起始,eIF4A家族成员在胚胎发育等多种生命过程中也发挥着重要的作用。虽然三种eIF4A在序列上高度相似,但它们的作用不尽相同。eIF4A成员作用的独特性和多样化通常由相互作用的结合蛋白来调节。本文将eIF4A家族成员的最新研究进展,特别是e IF4A成员各自独特的作用作一综述。

关键词： eIF4A 翻译起始 dead-box解旋酶胚胎发育