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pH诱导的d-氨基酸氧化酶立体选择性的翻转

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pH诱导的D-氨基酸氧化酶立体选择性的翻转

利用天然乙内酰脲酶启动子在大肠杆菌中诱导N-氨甲酰-d-氨基酸酰胺水解酶的可溶性表达

中国化学会第六届全国分子手性学术研讨会

作者：刘庆菊陈莉张志昆周影杜碧柏杨鹏肖亚婷杨昆昊李向军何裕建中国科学院大学化学与化工学院北京大学天然药物及仿生药物国家重点实验室

近年来,对酶的立体异构选择性的研究越来越多,也越来越受关注。本文以生物体内最典型的立体异构选择性酶d-氨基酸氧化酶(dAAO)为对象,研究了酶的立体异构选择性与水相中pH的相关性。首先,通过研究水溶液不同pH条件下,dAAO对d-氨基酸、L... 详细信息

近年来,对酶的立体异构选择性的研究越来越多,也越来越受关注。本文以生物体内最典型的立体异构选择性酶d-氨基酸氧化酶(dAAO)为对象,研究了酶的立体异构选择性与水相中pH的相关性。首先,通过研究水溶液不同pH条件下,dAAO对d-氨基酸、L-氨基酸的手性选择性,发现在特殊pH条件,只能特异性识别d-氨基酸的dAAO可以对L-丙氨酸、L-脯氨酸、L-精氨酸等L-氨基酸发生明显的选择作用,将它们氧化脱氨基成相应的α-酮酸和氨。之后对能够被dAAO选择的L-氨基酸溶液进行毛细管电泳分析,发现除L-丙氨酸外,其余的氨基酸在反应时间内并未发生消旋,证实了dAAO对L-氨基酸的选择作用。1.引言在生物体内,酶发挥着非常广泛地作用,目前对酶的性质的研究也日益增多。在酶的诸多性质中,立体选择专一性是至关重要的性质之一。据报道,对酶的立体选择专一性的控制可以通过改变酶自身(定点突变和定点进化)、反应温度和反应介质等来实现。众所周知,水对酶的催化过程是必不可少的,水溶液中的氢离子、金属离子、稀土离子等都会或多或少对酶的性质产生影响。已有研究表明,pH能对化学反应过程中的立体选择性产生影响,d-氨基酸氧化酶(dAAO)是生物体内最典型的立体选择性酶之一,进入生物体内的d-氨基酸会被氧化脱氨基解除其毒性。dAAO对催化反应底物具有高度的立体选择性和广谱性,当反应体系中同时存在L-氨基酸和d-氨基酸时,该酶只作用于d-氨基酸,对L-氨基酸却不起作用。本文以生物体内最典型的立体选择异构酶dAAO为对象,研究了其立体选择性与水相中的pH等的相关性。2.实验部分2.1材料与仪器实验所用的氨基酸、4-氨基安替比林(4-AAP)、3,5-二氯-2-羟基苯磺基酸钠(dHBS)都是购自百灵威科技有限公司,dAAO和过氧化物酶(POd)均购自西格玛奥德里奇公司。实验用的仪器为:紫外分光光度计(岛津的UV-2550)、高效液相色谱仪(日本岛津LC-20AT)高效液相色谱仪、毛细管电泳仪(贝克曼的MdQ-3063847)超声波清洗器(SK3310LHC)。2.2紫外光谱检测HO紫外检测实验采用的是改进的酶法,具体原理如下:d—AA+O+HO(?)α-酮酸+HO+NHHO+4-AAP POd/dHBS→红色亚醌类物质+HO该反应生成的红色亚醌类物质在512 nm处有紫外吸收。2.3毛细管电泳检测CE操作条件:缓冲溶液采用pH为9.2的20 mM硼砂缓冲液;背景电解质液是采用30 mMβ-Cd,25 mM SdS,IPA17%,20 mM硼砂缓冲液pH 9.6(仪器在这个条件下分离检测脯氨酸、苯丙氨酸、精氨酸对映体),拆分丙氨酸对映体背景电解质为:30 mMβ-Cd,25 mM SdS,IPA 17%,45 mM硼砂缓冲液pH 9.6;分离电压为20KV,检测波长210nm,毛细管47 cm×75um(I,d);温度:20℃。3.结果与讨论3.1 L-氨基酸反应的检测正常情况下,dAAO氧化可以与d-脯氨酸发生氧化脱氨基反应,生成的过氧化氢在POd的作用下与dHBS和4-AAP反应生成在512 nm处有紫外吸收的红色亚醌类物质。然而,向用不同pH缓冲溶液配成的L-脯氨酸溶液中加入酶工作液,发现在pH为8.0时,dAAO对L-脯氨酸发生明显的作用(图1)。同样,在pH为9.8时,dAAO对L-丙氨酸发生显著反应。对18种氨基酸一一进行实验,发现在某些pH条件下,dAAO可以对L-脯氨酸、L-丙氨酸、L苯丙氨酸等L-氨基酸发生选择作用。3.2反应前后L-氨基酸量的改变为了进一步证明是L-氨基酸与dAAO发生作用,我们采用毛细管电泳比较了反应前后L-氨基酸量的变化。表2给出了几种出现明显现象的L-氨基酸,与dAAO反应前后的毛细管电泳色谱峰面积的百分比。这也证明了确定L-氨基酸与dAAO发生了作用。表2.L-氨基酸与dAAO反应前后毛细管电泳色谱峰面积百分比3.3氨基酸消旋的检测我们都知道氨基酸溶液极易发生消旋,为了证明是L-氨基酸与dAAO发生反应,而不是L-氨基酸消旋成的d-氨基酸与dAAO发生反应,我们用毛细管进行检测。由图2可以发现,在反应时间内L-脯氨酸溶液中并未发现d-脯氨酸的存在,这证明了是L-脯氨酸与dAAO发生了反应。3.4 dAAO选择性翻转的可能机理我们推测,dAAO选择性发生翻转主要是由于pH影响了酶活性中心氨基酸残基和底物氨基酸的存在状态。以丙氨酸为例,生理条件下,丙氨酸上的羧基以负离子状态存在,能够与酶活性中心的氨基酸残基等形成氢键,共价键,而氨基是以氨阳离子形式存在,可以与酶活性中心上的氨基酸残基形成氢键、静电作用等。丙氨酸的pK2为9.7,当pH为9.8时,丙氨酸上的氨是以-NH形式存在,由于-NH和-CH是电子等排体,性质相近,L-丙氨酸侧链上的-

关键词： pH d-氨基酸氧化酶立体选择性 L-氨基酸 d-氨基酸

来源： cnki会议评论

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中国医药工业杂志 2008年第9期39卷 675-675页

作者：张伟

将来源于放射土壤杆菌（***）TH572的编码N-氨甲酰-d-氨基酸酰胺水解酶的基因克隆至质粒pET30a上，并转化大肠杆菌BL21（dE3），结果蛋白质大部分以包涵体形式表达。本试验采用天然的乙内酰脲酶启动子（PHase，长度为209bp）构建质粒pG... 详细信息

将来源于放射土壤杆菌（***）TH572的编码N-氨甲酰-d-氨基酸酰胺水解酶的基因克隆至质粒pET30a上，并转化大肠杆菌BL21（dE3），结果蛋白质大部分以包涵体形式表达。本试验采用天然的乙内酰脲酶启动子（PHase，长度为209bp）构建质粒pGEMT—dCB，并优化了该启动子下游的核糖体结合位点（RBS）以促进表达。

关键词： d-氨基酸酰胺水解酶乙内酰脲酶大肠杆菌启动子可溶性表达天然诱导

天津工业生物所在d-氨基酸脱氢酶改造及大位阻d-氨基酸合成方面取得新进展

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化工新型材料 2018年第12期46卷 167-167页

作者：新型

非天然的d-氨基酸除了具有天然氨基酸的大部分功能外,还具有天然氨基酸所不具备的优良性能,在药物合成(医药和农药)、食品、化妆品等方面具有广泛的用途。利用d-氨基酸脱氢酶可以以酮酸和铵盐为原料通过还原氨化一步生成d-氨基酸。

关键词： d-氨基酸药物合成脱氢酶天然氨基酸位阻改造生物工业

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d-型氨基酸的生物法制备

分子催化 2006年第3期20卷 284-288页

作者：陈建波徐毅上海师范大学生命与环境科学学院上海200234 华东理工大学生物工程学院上海200237

自然界存在20种氨基酸,均为L-型氨基酸,它们是组成蛋白质的基本结构单元.所以,人们一般认为d-氨基酸在自然界中极少存在,因此对于d-氨基酸的功能或性质方面的研究也非常少.近年来,随着科学研究的深入,人们发现非天然的d-型氨基酸虽然不... 详细信息

自然界存在20种氨基酸,均为L-型氨基酸,它们是组成蛋白质的基本结构单元.所以,人们一般认为d-氨基酸在自然界中极少存在,因此对于d-氨基酸的功能或性质方面的研究也非常少.近年来,随着科学研究的深入,人们发现非天然的d-型氨基酸虽然不是构成蛋白质的基本结构单元,但许多植物、微生物和高等植物中都有d-氨基酸的存在.

关键词： d-氨基酸酶法制备

工程菌生物转化d-型氨基酸的研究——N-氨甲酰-d-氨基酰胺水解酶的基因克隆、表达及性能

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工程菌生物转化D-型氨基酸的研究——N-氨甲酰-D-氨基酰胺水解酶...

作者：钮利喜山西大学

学位级别：硕士

光学活性的d-氨基酸作为一种中间体被广泛应用于半合成抗生素、多肽激素、拟除虫菊脂、杀虫剂等的合成。非天然d-氨基酸常用生物法或生物-化学法生产。底物5’单替代海因首先由d-海因酶转化为中间物N-氨甲酰-d-氨基酸，然后被N-氨甲酰-d... 详细信息

光学活性的d-氨基酸作为一种中间体被广泛应用于半合成抗生素、多肽激素、拟除虫菊脂、杀虫剂等的合成。非天然d-氨基酸常用生物法或生物-化学法生产。底物5’单替代海因首先由d-海因酶转化为中间物N-氨甲酰-d-氨基酸，然后被N-氨甲酰-d-氨基酸酰胺水解酶(dCase)或者化学脱酰胺将其进一步转化为d-氨基酸。目前，工业范围的d-氨基酸生产都采用酶法转化。按本室从菌株SS-ori中纯化的dCase的N-末端氨基酸序列设计了正向引物，并在已报道的不同来源菌株dCase的氨基酸序列同源性分析的基础上设计了简并反向引物。用菌株SS-ori总dNA为模板，经PCR扩增得到一长度约为0.9kb的片段，dNA测序表明基因全长912bp。将dCase基因分别克窿到pUC18、pET3a、pET32M、pRSET、pGEX4T-2、pExSecI、pMAL-c2X等一系列表达载体中，然后在*** dH5α、*** 2426、*** BL21中进行表达。但大多数表达产物为包涵体而不具酶活性。最终在工程菌*** BL21／pMd中获得dCase可溶表达，表达产物为融合蛋白MBP-dCase(77kd)，SdS-PAGE光密度扫描表明，其表达量约占菌体超声后离心上清总蛋白的20％。经Amylose亲和纯化和Superose 12凝胶排阻层析后达到了电泳纯。根据pMAL-c2X质粒背景，用Factor Xa剪切后，可得约42kd的MBP和35kd的dCase。酶活性检测表明，当用N-氨甲酰-dL-缬氨酸作为底物，细胞浓度达Od600nm=10时，每升菌体每小时可产生d-缬氨酸约1.0克。采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)分析了工程菌*** EHd-YZⅡ6和天然菌SS-ori转化dL-对羟基苯海因的反应产物，探讨了流动相组份及其比例对分离的影响，结果表明流动相为50mmol／L的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH4.2)和甲醇的混合溶液(体积配比为90：10)，为最佳洗脱缓冲系统;采用C拄，在波长254nm检测条件下，有较好分离效果。底物dL-对羟基苯海因(dL-HPH)以及产物N-氨甲酰-d-对羟基苯甘氨酸(CpHPG)和产物d-对羟基苯甘氨酸(d-HPG)的质量浓度与峰面积呈良好的线性关系，相关系数在0.99以上。用HPLC法既可测定d-海因酶和N-氨甲酰-d-氨基酸酰胺水解酶的活性，又可对转化产物CpHPG和d-HPG进行了定量分析。由于N-氨甲酰-d-氨基酸酰胺水解酶极易氧化失活且耐热性较差。因此采用易错聚合酶链式反应(error prone PCR)的方法，对dCase进行定向进化，已获得初步结果，并构建了pET32M-CAT质粒，旨在利用氯霉素乙酰转移酶(CAT)的高度可溶性对突变文库进行初步的可溶性表达筛选。进一步工作正在进行中。

关键词： d-氨基酸 N-氨甲酰-d-氨基酸酰胺水解酶可溶性融合表达生物转化指定性进化高效液相色谱

基于d型氨基酸代谢差异的食源性致病菌多元区分

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基于D型氨基酸代谢差异的食源性致病菌多元区分

作者：历苗苗天津科技大学

学位级别：硕士

细菌无处不在,涉及人类生活的方方面面,与人类健康密切相关。其中,致病菌污染是造成食品安全问题的主要因素,全球每年由此导致的食源性疾病病例高达数百万起。特别地,近年来由于抗生素的大规模使用甚至滥用,导致大量耐药菌出现,其危害... 详细信息

细菌无处不在,涉及人类生活的方方面面,与人类健康密切相关。其中,致病菌污染是造成食品安全问题的主要因素,全球每年由此导致的食源性疾病病例高达数百万起。特别地,近年来由于抗生素的大规模使用甚至滥用,导致大量耐药菌出现,其危害愈发严重,对食品安全领域提出了更大的挑战。基于此,实现食源性致病菌快速、准确的判别和药敏检测对及时明确感染病原菌并遏制细菌耐药的发生发展至关重要。本论文利用“一锅法”制备了d-氨基酸(d-丙氨酸(d-Ala),d-2,3-二氨基丙酸(d-dap),d-谷氨酸(d-Glu))功能化的纳米金(Au NPs)探针(Au/d-Ala,Au/d-dap,Au/d-Glu),由此构建了一种比色传感器阵列以用于食源性致病菌的判别、定量分析和药敏检测。d-氨基酸(d-AA)是细菌细胞壁肽聚糖的组成部分,外源性的d-AA可被细菌代谢利用。因此,在细菌存在的情况下,Au/d-AA探针表面的d-氨基酸会被细菌代谢利用至细胞壁,从而使Au NPs失去保护发生聚集,引发探针紫外吸收峰的红移。由于不同的细菌对不同的d-AA展现出不同的代谢能力,导致Au NPs的聚集行为存在差异,由此产生独特的细菌指纹响应模式,通过对数据矩阵进行线性判别分析(LdA),最终实现了8种细菌的区分,包括金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、阪崎肠杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐卡那霉素大肠杆菌和大肠杆菌dH5α。此外,所构建的传感阵列可实现大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在10-10 CFU/m L浓度范围的检测,以及细菌混合物的区分,包括普通致病菌混合样品、致病菌与耐药致病菌混合样品及致病菌与非致病菌混合样品的区分。不仅如此,该传感阵列也能够在复杂体系中,如牛奶和自来水中实现对8种细菌的区分,并且对其中添加不同种细菌的盲样可实现100%识别。同时,基于细菌对d-AA的代谢特性,通过监测细菌在有无抗生素存在时对Au/d-AA探针分散状态的影响,可间接读出抗生素对细菌代谢d-AA活性的影响。基于此原理,本论文开发了一种快速的药敏试验方法,实现了金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌对环丙沙星、四环素、氨苄青霉素和万古霉素的敏感性判断。

关键词：食源性致病菌比色传感阵列线性判别分析 d-氨基酸药敏检测

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青霉素酰化酶制备d-氨基酸方法通过鉴定

中国饲料添加剂 2006年第8期 50-50页

由中国科学院成都有机化学公司自主研究开发的”用青霉素酰化酶制备d-氨基酸的方法”项目通过了四川省科学技术厅组织的技术鉴定。该方法提供了一种制备d-氨基酸的新技术，具有工艺先进、产品纯度高、环保、生产成本低等特点。该成果采... 详细信息

由中国科学院成都有机化学公司自主研究开发的”用青霉素酰化酶制备d-氨基酸的方法”项目通过了四川省科学技术厅组织的技术鉴定。该方法提供了一种制备d-氨基酸的新技术，具有工艺先进、产品纯度高、环保、生产成本低等特点。该成果采用化学消旋和生物酶法拆分相结合制备d-氨基酸方法，制备出多种高光学纯度的d-氨基酸产品，其技术具有先进性和创新性；其制备过程对环境基本无污染，

关键词： d-氨基酸技术鉴定酶制备青霉素酰化化学公司产品纯度中国科学院