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紫花苜蓿Cu/Zn-SOD基因在矮牵牛中的表达及其耐冷性分析

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紫花苜蓿Cu/Zn-SOD基因在矮牵牛中的表达及其耐冷性分析

作者：平璐吉林农业大学

学位级别：硕士

矮牵牛作为东北地区常见的花卉,由于其具有生长周期短、易成活、色彩丰富多样的特点,在城市园林植物中的应用非常广泛。并且矮牵牛再生繁殖能力较好,在植物基因工程中属于常用的受体材料,易于农杆菌转化。但矮牵牛不耐冷,不能在低温的... 详细信息

矮牵牛作为东北地区常见的花卉,由于其具有生长周期短、易成活、色彩丰富多样的特点,在城市园林植物中的应用非常广泛。并且矮牵牛再生繁殖能力较好,在植物基因工程中属于常用的受体材料,易于农杆菌转化。但矮牵牛不耐冷,不能在低温的气候条件下生长,降低了矮牵牛的利用率。若能提高矮牵牛的耐冷性,对于东北地区秋末冬初季节植物景观搭配,可以提供更多花色的选择。为此本试验结合矮牵牛特点,首先筛选不同品种矮牵牛的最适再生培养条件;并在此基础上,通过转入从耐寒性较强的紫花苜蓿“龙牧803”品种中克隆的Cu/Zn-SOD基因,使cu/zn-sod在矮牵牛植株中进行过量表达,来提高矮牵牛植株的耐冷性。具体研究结果如下:1.四种不同花色的矮牵牛品种Pink、Red、Pink Vein和Peppermint以MS为基础培养基,并分别添加三种不同浓度的6-BA、NAA、IBA和除草剂双丙氨膦诱导不定芽,筛选出最适合矮牵牛受体转基因的材料为Pink品种;以及与之匹配的最优诱导培养基为:MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1NAA+3 mg·L-1bar。2.选择紫花苜蓿耐冷性较好的“龙牧803”品种作为材料,从中成功提取总RNA,通过反转录成cDNA后克隆得到Cu/Zn-SOD基因CDS区。在此基础上,通过构建植物表达载体pC3301-sod,利用农杆菌介导的方式,将该植物表达载体转入到受体材料Pink中。3.得到的转基因矮牵牛材料,通过PCR检测,证明Cu/Zn-SOD基因已经转入到矮牵牛中;对PCR阳性植株通过Southern blot的杂交检测,确定Cu/Zn-SOD基因已经整合到矮牵牛基因组中,并且初步确定该外源基因为单拷贝;Southern杂交检测和Bar试纸条实验排除转基因植株的农杆菌污染。4.4℃低温条件下,阳性植株长势优于对照植株;阳性植株叶片相对电导率的上升趋势小于对照植株叶片;阳性植株叶片的叶绿素含量变化下降趋势小于对照植株叶片。以上结果说明转Cu/Zn-SOD基因能够有效提高矮牵牛植株耐冷性。

关键词： Cu/Zn-SOD基因植物表达载体构建不定芽诱导转基因矮牵牛耐冷性

低氧-复氧胁迫对鲢抗氧化酶活性及cu/zn-sod和Mn-sod基因表达的影响

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水生生物学报 2022年第4期46卷 498-506页

作者：张美东凌晨沙航陈梦王丹罗相忠邹桂伟梁宏伟中国水产科学研究院长江水产研究所武汉430223 华中农业大学水产学院武汉430000

为探究低氧-复氧胁迫对鲢(Hypophthalmichthys molitrix)抗氧化酶活性及cu/zn-sod和Mn-sod基因表达的影响,对鲢进行急性低氧、持续低氧及复氧实验,进而分析血清、心脏和肝脏中不同抗氧化酶和sods基因表达的变化特征。结果表明:在急性低... 详细信息

为探究低氧-复氧胁迫对鲢(Hypophthalmichthys molitrix)抗氧化酶活性及cu/zn-sod和Mn-sod基因表达的影响,对鲢进行急性低氧、持续低氧及复氧实验,进而分析血清、心脏和肝脏中不同抗氧化酶和sods基因表达的变化特征。结果表明:在急性低氧胁迫后,血清中总抗氧化能力(T-AOC)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性随着氧浓度的降低均呈上升趋势,但超氧化物歧化酶(sod)活性呈先升后降的趋势。在持续低氧胁迫后,血清中T-AOC和GSH-PX活性随着低氧胁迫时间的增加显著升高(Psod活性显著高于常氧水平(Pcu/zn-sod和Mn-sod基因表达在低氧胁迫24h时显著低于常氧水平(Psod活性在低氧胁迫24h时显著高于常氧水平(Pcu/zn-sod和Mn-sod基因表达在低氧胁迫24h时也显著高于常氧水平(Psod、CAT和GSHPX活性均能恢复至常氧水平,且心脏和肝脏中cu/zn-sod和Mn-sod基因表达的也能恢复至常氧水平,但肝脏中Mn-sod基因表达恢复至常氧水平较在心脏中所需时间更少。因而,鲢可以通过调节抗氧化酶的活性来保护自身免受氧化应激造成的损伤。研究为解析低氧胁迫下鲢抗氧化应激机制提供了基础。

关键词：低氧胁迫抗氧化酶 Cu/Zn-SOD基因 Mn-sod基因鲢

玉米弯孢叶斑病菌Cu/Zn-SOD基因敲除载体构建

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玉米弯孢叶斑病菌Cu/Zn-SOD基因敲除载体构建

玉米大斑病菌Cu/Zn-SOD基因的克隆、鉴定及功能分析

中国植物病理学会2015年学术年会

作者：闫丽斌肖淑芹李辉路媛媛李国福薛春生沈阳农业大学植物保护学院

玉米弯孢叶斑病是分布较广,危害较重的叶部病害,曾给我国东北地区玉米生产上造成严重危害。超氧化物歧化酶（sod）是一种逆境条件下清除细胞内活性氧的关键酶,而铜锌超氧化物歧化酶（cu/zn-sod）是该酶系中最主要的活性氧清除剂,与植物... 详细信息

玉米弯孢叶斑病是分布较广,危害较重的叶部病害,曾给我国东北地区玉米生产上造成严重危害。超氧化物歧化酶（sod）是一种逆境条件下清除细胞内活性氧的关键酶,而铜锌超氧化物歧化酶（cu/zn-sod）是该酶系中最主要的活性氧清除剂,与植物的抗逆性关系密切。现已证明sod是许多动物源病原菌的致病决定因子。在植物病原菌中也有报道证明sod与植物病原真菌的生长、定殖有关。cu/zn-sod能够对生物体代谢所产生的超氧阴离子自由基进行特异性清除,从而防止生物分子氧化,其结构高度保守。在一级结构上,cu/zn-sod由154个氨基酸残基组成,其中与活性相关的氨基酸残基在不同物种间高度同源。本研究以玉米弯孢叶斑病菌CX-3为出发菌株,根据NCBI数据库中与玉米弯孢叶斑病菌同源性较高的其他植物病原真菌的Cu/Zn-SOD基因序列,采用生物信息学方法获得玉米弯孢叶斑病菌中编码Cu/Zn-SOD基因的氨基酸序列,设计并合成克隆该基因的引物,PCR扩增后测序,玉米弯孢叶斑病菌Cu/Zn-SOD基因序列全长978bp,共编码154个氨基酸,共有三个内含子分别位于13 bp、193 bp、345 bp处,其长度分别为377 bp、71 bp、65 bp,与4spergillus niger的cu/zn-sod同源性为84%。设计引物加入酶切位点,采用PCR、限制性内切酶酶切、连接等过程,将玉米弯孢叶斑病菌Cu/Zn-SOD基因侧翼序列导入双元载体pPZP1 00HG,成功构建玉米大斑病菌Cu/Zn-SOD基因敲除载体,并采用冻融法将pPZP100HG-cu/zn-sod转入农杆菌AGL-1。在此基础上,拟进行农杆菌介导遗传转化（ATMT）获得玉米大斑病菌Cu/Zn-SOD基因缺失突变体,接种观察玉米弯孢叶斑病菌活性氧代谢以及其致病力变化。

关键词：玉米弯孢叶斑病菌（curvularia lunata） Cu/Zn-SOD基因敲除载体

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玉米大斑病菌Cu/Zn-SoD基因的克隆、鉴定及功能分析

茶树花cu/zn-sod酶活性及其基因表达分析

中国植物病理学会2012年学术年会

作者：张莉肖淑芹张美丽张跃文李辉路媛媛隋韵涵薛春生沈阳农业大学植物保护学院

由凸脐蠕孢菌[Exserohilum turcicum（Pass.）Leonard et Suggs]侵染引起的玉米大斑病是我国东北地区玉米生产上的主要病害之一,其致病性强弱是影响流行的关键因素。cu/zn-sod是生物体抗氧化酶系统的主要成员,高度保守,在一级结构上,cu/... 详细信息

由凸脐蠕孢菌[Exserohilum turcicum（Pass.）Leonard et Suggs]侵染引起的玉米大斑病是我国东北地区玉米生产上的主要病害之一,其致病性强弱是影响流行的关键因素。cu/zn-sod是生物体抗氧化酶系统的主要成员,高度保守,在一级结构上,cu/zn-sod由154个氨基酸残基组成,其中与活性相关的氨基酸残基在不同物种间高度同源。sod对氧自由基有解毒功能,它是真菌抵抗各种逆境条件的重要保护酶,是生物体内抗活性氧胁迫的重要屏障。现已证明sod是许多动物病原菌的致病决定因子。在植物病原菌中也有报道证明sod与植物病原菌的生长、定殖有关。本研究以玉米大斑病菌StH7为出发菌株（1号小种）,根据NCBI已知其他病原菌的Cu/Zn-SOD基因序列,采用the Gene Ontology生物信息学方法获得玉米大斑病菌中类似Cu/Zn-SOD基因序列,合成引物PCR扩增后测序,经Blast比对玉米大斑病菌Cu/Zn-SOD基因序列全长978bp,在13bp、193bp、345bp处有3个内含子,长度分别为377bp、71bp、65bp,共编码154个氨基酸,与Aspergillus fumigatus的cu/zn-sod同源性为83%;与此同时将玉米大斑病菌培养于含有不同浓度潮霉素的LCA培养基上,筛选出抑制其生长的潮霉素浓度为100μg/ml。设计引物加入酶切位点,采用PCR、限制性内切酶酶切、连接、去磷酸化等过程,将标记基因潮霉素以及玉米大斑病菌Cu/Zn-SOD基因侧翼序列导入双元载体pPZP100,并采用冻融法将pPZP100HStcu/zn-sod转入农杆菌AGL-1中,构建玉米大斑病菌Cu/Zn-SOD基因敲除载体。在此基础上,拟进行农杆菌介导遗传转化（ATMT）获得玉米大斑病菌Cu/Zn-SOD基因缺失突变体,接种观察玉米大斑病菌活性氧代谢以及其致病力变化。

关键词：玉米大斑病菌 Cu/Zn-SOD基因 ATMT

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热带作物学报 2020年第6期41卷 1167-1173页

作者：王梦馨吴国火崔林韩宝瑜中国计量大学生命科学学院/浙江省生物计量及检验检疫技术重点实验室浙江杭州310018

为研究Cu/Zn-SOD基因在茶树花不同发育阶段、不同品种间的表达规律以及Cu/Zn-SOD基因表达量与酶活性之间的关系,本研究将‘龙井43’品种茶树花分为4个发育阶段,选择15个品种的茶树花为研究对象,采用实时荧光定量PCR技术对3个cu/zn-sod... 详细信息

为研究Cu/Zn-SOD基因在茶树花不同发育阶段、不同品种间的表达规律以及Cu/Zn-SOD基因表达量与酶活性之间的关系,本研究将‘龙井43’品种茶树花分为4个发育阶段,选择15个品种的茶树花为研究对象,采用实时荧光定量PCR技术对3个Cu/Zn-SOD基因表达水平进行定量分析,同时测定cu/zn-sod酶活性。结果表明:在茶树花的4个发育阶段中,第4阶段cu/zn-sod酶活性最低,与其他3个阶段具有显著差异;不同品种的茶树花cu/zn-sod酶活性有较大差异,其中‘紫鹃’茶树花cu/zn-sod酶活性最高,其次是‘黄金芽’和‘白叶1号’,‘黄观音’的cu/zn-sod酶活性最低。茶树花不同发育阶段中Cu/Zn-SOD基因表达水平存在较大差异,细胞质型cu/zn-sod1基因表达水平远高于叶绿体型cu/zn-sod2和过氧化物酶体cu/zn-sod3;不同品种茶树花Cu/Zn-SOD基因表达水平有较大差异,cu/zn-sod1基因在‘黄牡丹’茶树花中表达量最高,cu/zn-sod2基因在‘白叶1号’和‘黄观音’茶树花中表达量最高,cu/zn-sod3基因在‘紫鹃’茶树花中的表达量最高。相关性分析得知‘龙井43’茶树花不同发育阶段cu/zn-sod酶活性与Cu/Zn-SOD基因表达量之间的相关性不明显,而不同品种茶树花的cu/zn-sod酶活性与cu/zn-sod3基因表达量存在显著相关性。本研究初步明确了cu/zn-sod酶活性较高的茶树品种和茶树花适宜的采摘时间,为茶树花sod进一步研究提供参考。

关键词：茶树花 Cu/Zn-SOD基因实时荧光定量PCR cu/zn-sod酶活性 ‘龙井43’

多头带绦虫铜锌超氧化物歧化酶基因的原核表达及其表达产物的酶学活性分析

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中国兽医科学 2016年第11期46卷 1406-1411页

作者：黄兴陈林王宇徐璟郭承古小彬杨光友四川农业大学动物医学院四川成都611130 成都农业科技职业学院四川成都611130

为探讨多头带绦虫铜锌超氧化物歧化酶(C u/zn-SO D)基因的特征及该酶在多头带绦虫上的抗氧化作用,采用RT-PCR技术扩增脑多头蚴C u/zn-SO D基因,构建原核表达载体p ET-32a-C u/zn-SO D;然后将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达;... 详细信息

为探讨多头带绦虫铜锌超氧化物歧化酶(C u/zn-SO D)基因的特征及该酶在多头带绦虫上的抗氧化作用,采用RT-PCR技术扩增脑多头蚴C u/zn-SO D基因,构建原核表达载体p ET-32a-C u/zn-SO D;然后将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达;对表达产物进行W estern-blot检测,并进行酶比活性分析。结果显示,多头带绦虫C u/zn-SO D基因编码蛋白的氨基酸序列与猪带绦虫和肥头绦虫C u/zn-SO D基因编码蛋白的氨基酸序列的相似性分别为98%和92%;纯化后的多头带绦虫重组cu/zn-sod蛋白的浓度为1.587 m g/m L;用羟胺法测得该重组蛋白的酶比活性为3 125.64 U/mg±76.82 U/mg;H2O2、SDS和EDTA对重组的多头带绦虫cu/zn-sod的酶活性具有较强的抑制作用,而氯仿-乙醇和脲素则对多头带绦虫cu/zn-sod的酶活性并无影响。上述结果为进一步研究多头带绦虫C u/zn-SO D基因的生物学功能奠定了基础。

关键词：多头带绦虫 Cu/Zn-SOD基因原核表达酶学活性分析

印楝素对合浦绒螯蟹氧化应激生化指标及相关基因表达的影响

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印楝素对合浦绒螯蟹氧化应激生化指标及相关基因表达的影响

作者：刘珂广西大学

学位级别：硕士

印楝素(Azadirachtin)是一种新型的植物源农药,近年来得到了急速发展,但有关其对蟹类养殖安全性评价的资料较少。本实验采用静水方法研究印楝素对合浦绒螯蟹(Eriocheir hepuensis)的急性毒性效应,主要通过半致死浓度摸索、相关氧化指标... 详细信息

印楝素(Azadirachtin)是一种新型的植物源农药,近年来得到了急速发展,但有关其对蟹类养殖安全性评价的资料较少。本实验采用静水方法研究印楝素对合浦绒螯蟹(Eriocheir hepuensis)的急性毒性效应,主要通过半致死浓度摸索、相关氧化指标测定、相关基因克隆、分析和基因表达规律分析等途径来研究印楝素对合浦绒螯蟹的毒性效应。主要研究结果如下:半致死浓度摸索结果:在p H值为7.5～8.0、溶解氧为6.8～7.2 mg/L、水温20～22℃、盐度为0.1～0.3条件下,印楝素对合浦绒螯蟹24 h、48h、72 h、96 h的半致死浓度(LC)分别为87.83 mg/L、57.00 mg/L、42.91mg/L、35.00 mg/L,安全浓度为3.50 mg/L。相关氧化指标结果:20 mg/L印楝素胁迫下:与对照组相比,实验组存活个体鳃中sod活性3 h显著升高(Psod活性3 h、6 h极显著升高(Psod活性0-3 h、3-6 h、6-9 h、12-24 h都显著升高(PCu/Zn-SOD基因克隆及其表达分析:Cu/Zn-SOD基因编码区全长为627bp,可编码208个氨基酸。对cu/zn-sod蛋白质的分析表明该蛋白呈弱酸性,无信号肽,细胞亚定位于胞质中,存在cu-zn＿Superoxide＿Dismutase结构。QRT-PCR技术对Cu/Zn-SOD基因的表达差异分析结果表明:Cu/Zn-SOD基因在正常合浦绒螯蟹中相对表达量较高的组织为肝胰腺、胃和血细胞,肝胰腺表达量为肌肉表达量的56倍。20 mg/L印楝素胁迫下:与对照组相比,Cu/Zn-SOD基因在实验组存活个体肝胰腺、鳃和心脏组织中都呈现单峰升高趋势,肝胰腺、鳃分别在6 h、9 h达到峰值且极显著性升高(PCu/Zn-SOD基因分别在实验组死亡个体肝胰腺、鳃和心脏组织中3-6 h、3-6 h、6-9 h达到升高峰值。GSTM3基因克隆及其表达分析:GSTM3基因编码区全长为675 bp,可编码224个氨基酸。对GSTM3蛋白质的分析表明该蛋白呈弱碱性,无信号肽,细胞亚定位于胞质中,存在GST-N-Mu和GST-C-Mu结构域。GSTM3基因在正常合浦绒螯蟹不同组织中相对表达量较高的组织为肝胰腺和胸神经节,肝胰腺中的表达量能够达到血液中的130倍。20 mg/L印楝素胁迫下:GSTM3基因在实验组存活个体肝胰腺中整体呈现极显著性(P基因在实验组死亡个体肝胰腺和心脏中皆呈现双峰(3-6 h和12-24 h)趋势,鳃组织中呈现单峰(6-9 h)趋势。据此推测印楝素胁迫导致合浦绒螯蟹死亡与其对合浦绒螯蟹造成的氧化损伤具有密切关系,抗氧化调控能力是合浦绒螯蟹抵抗印楝素胁迫的重要因素之一,与自身免疫能力息息相关。

关键词：印楝素合浦绒螯蟹半致死浓度氧化指标 Cu/Zn-SOD基因 GSTM3基因基因表达

紫背天葵铜/锌超氧化物歧化酶基因克隆和采后处理对其表达的影响

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紫背天葵铜/锌超氧化物歧化酶基因克隆和采后处理对其表达的影响

作者：许昕南京农业大学

学位级别：硕士

紫背天葵(Gynura bicolorD.C)富含纤维素、多种微量元素、花色苷、氨基酸、黄酮苷和挥发油等,且其sod酶活性较高,是一种很好的药膳型高档蔬菜。紫背天葵采后因自身较强的新陈代谢致使营养物质损失快,需要合适的采后处理来延缓其生命活... 详细信息

紫背天葵(Gynura bicolorD.C)富含纤维素、多种微量元素、花色苷、氨基酸、黄酮苷和挥发油等,且其sod酶活性较高,是一种很好的药膳型高档蔬菜。紫背天葵采后因自身较强的新陈代谢致使营养物质损失快,需要合适的采后处理来延缓其生命活动。目前有许多研究关注采后处理对果蔬的品质及生理生化的影响,但相关基因表达方面的报道较少。本试验通过对紫背天葵Cu/Zn-SOD基因序列克隆,探究不同处理对紫背天葵Cu/Zn-SOD基因表达量的影响,为紫背天葵等叶菜类蔬菜的后续分子生物学和采后处理机制的研究提供依据。主要研究结果如下:1.以改良CTAB法提取紫背天葵叶片总RNA,经克隆得到924bp的基因序列全长,其中包含从104bp到784bp共681bp的ORF区,编码227个氨基酸。对获得的cu/zn-sod氨基酸序列进行多序列比对,表明紫背天葵cu/zn-sod与向日葵、薇甘菊、一枝黄花cu/zn-sod有较高的同源性。生物信息学分析显示,紫背天葵的cu/zn-sod位于细胞质中,属亲水性非分泌蛋白质;整体结构分析其二级结构最主要的结构元件为无规则卷曲和延伸链,而α-螺旋和β-转角散布于整个蛋白。根据同源建模的预测方法,应用Swiss-model构建了紫背天葵cu/zn-sod蛋白高级结构模型。2.分别以1-MCP和乙烯处理紫背天葵分析常温贮藏期间紫背天葵的品质和生理生化变化,结果表明1-MCP处理减弱了呼吸强度、抑制变色,促进了cu/zn-SO 基因的表达和sod及POD酶的活性,抑制了超氧阴离子和过氧化氢的生成,较好地维持了紫背天葵叶片的贮藏品质。乙烯的作用与1-MCP的作用相反。3.常温贮藏条件下,紫背天葵分别经1-MCP和NO处理后均促使Cu/Zn-SOD基因表达上调,其中1-MCP处理更为明显;低温下减压和气调处理也使紫背天葵的Cu/Zn-SOD基因表达上调,但在表达响应时间和作用模式上存在差别。1-MCP处理、气调处理和减压处理对Cu/Zn-SOD基因表达的影响受到时间的调控,低温可以诱导Cu/Zn-SOD基因的表达。

关键词：紫背天葵 Cu/Zn-SOD基因克隆生物信息学分析基因表达