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cre/loxp重组系统的修饰及其在树干毕赤酵母中的应用

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Cre/Loxp重组系统的修饰及其在树干毕赤酵母中的应用

作者：傅静江南大学

学位级别：硕士

树干毕赤酵母（Scheffersomyces stipitis）能够将木糖有效的转化成乙醇，是最具工业生产前景的戊糖酵母之一。自然界中有丰富的植物纤维资源，充分合理利用这些农林废弃物，通过生物转化生产对人类有用的产品，具有十分重要的的现实和... 详细信息

树干毕赤酵母（Scheffersomyces stipitis）能够将木糖有效的转化成乙醇，是最具工业生产前景的戊糖酵母之一。自然界中有丰富的植物纤维资源，充分合理利用这些农林废弃物，通过生物转化生产对人类有用的产品，具有十分重要的的现实和长远意义。野生型菌株对木糖的转化率及菌体生长量还未达到工业菌株的要求，而在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）搭建的木糖代谢途径并未实现木糖有效地转化成乙醇。因此，通过对S. stipitis进行基因工程操作来提高木糖转化率，以及构建一株新型的酵母基因工程菌，已经成为研究热点。但S. stipitis具有编码偏好性，密码子CUG识别Ser，而不是常见的Leu，导致富含CTG的外源基因在S. stipitis中不能表达或表达效果不佳，限制分子生物学技术的应用。本论文构建适用于S. stipitis的筛选标记并通过定点突变修饰cre/loxp重组系统，实现乙醛脱氢酶Ⅴ基因（Aldehyde dehydrogenase5，ALD5）无痕敲除，为S. stipitis的遗传转化研究提供基础工具，并以此为基础为开发外源基因表达体系奠定基础。本论文对S. stipitis染色体倍性进行验证。使用DNA含量参比法对S. stipitis染色体倍性进行了分析，根据S. cerevisiae单倍体与二倍体染色体含量的特征性差异，测定DNA含量并分析，确定S. stipitis为单倍体细胞。构建尿嘧啶营养缺陷型和抗药性筛选标记为分子生物学操作作准备。通过重叠PCR法构建S. stipitis URA3基因同源重组片段。双交换同源重组敲除URA3基因，获得尿嘧啶营养缺陷型菌株S. stipitis （ura3-）。酵母中常用抗性筛选标记有G418和HygromycinB，实验结果表明该菌株对G418具有较强抗性，对Hygromycin B较敏感，选择Hygromycin B作为新的抗药性筛选标记。 cre/loxp系统中含有cre重组酶基因和Hygromycin B抗性基因两个外源基因，将CDS区中CTG密码子定点突变成TTG，在S. stipitis中编码有活性的蛋白。以ALD5为靶基因，构建ALD5基因同源臂片段，同时中间插入含loxp位点的URA3基因作为选择标记，敲除其ALD5基因，获得重组菌S. stipitis（ald5-）。半乳糖诱导cre重组酶表达并切除URA3基因，获得菌株S. stipitis（ald5-ura3-），重组率达到50%，GAL启动子可以在S. stipitis中启动外源基因的转录。

关键词：树干毕赤酵母 cre/loxp重组系统定点突变尿嘧啶营养缺陷型潮霉素B

利用cre/loxp重组系统构建甜菜碱合成酶多基因表达载体

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高技术通讯 2007年第7期17卷 749-754页

作者：王亮苏乔安利佳大连理工大学环境与生命学院生物科学与工程系大连116023

通过使用一套基于cre/loxp重组系统的植物多基因表达载体构建系统,将辽宁碱蓬（Suaeda liaotungesis kitag）的胆碱单加氧酶（CMO）基因、甜菜碱醛脱氢酶（BADH）基因以及烟草的核基质结合区（MAR）序列构建到同一表达载体上,得到可直... 详细信息

通过使用一套基于cre/loxp重组系统的植物多基因表达载体构建系统,将辽宁碱蓬（Suaeda liaotungesis kitag）的胆碱单加氧酶（CMO）基因、甜菜碱醛脱氢酶（BADH）基因以及烟草的核基质结合区（MAR）序列构建到同一表达载体上,得到可直接用于农杆菌转化的植物表达载体pYLTAC747H-MAR-BADH-CMO-MAR.该甜菜碱合成酶多基因表达载体的成功构建为进一步进行植物的遗传转化,以有效提高转基因植株的耐盐性提供了实验基础.实验中,用热激法替代了电击法进行质粒的大肠杆菌转化,并去掉了透析等步骤,简化了构建过程.

关键词： cre/loxp重组系统甘氨酸甜菜碱 CMO BADH MAR 多基因表达载体

表达cre重组酶cre-pCEP4载体的构建及其在cre/loxp重组系统中的应用

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吉林大学学报（医学版） 2011年第2期37卷 196-201,F0002页

作者：周杨朱建国唐小春闫森宋娜张明军李莉欧阳红生逄大欣吉林大学畜牧兽医学院动物胚胎工程吉林省重点实验室吉林长春130062

目的:构建表达cre重组酶的载体cre-pCEP4,并验证其能够有效识别loxp位点,为人类疾病动物模型的建立提供依据。方法:构建重组载体cre-pCEP4和pStop-eGFP,利用Fugene HD转染猪胚胎成纤维细胞(PEF)和MCF-7细胞系,利用荧光显微镜观察绿色荧... 详细信息

目的:构建表达cre重组酶的载体cre-pCEP4,并验证其能够有效识别loxp位点,为人类疾病动物模型的建立提供依据。方法:构建重组载体cre-pCEP4和pStop-eGFP,利用Fugene HD转染猪胚胎成纤维细胞(PEF)和MCF-7细胞系,利用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况。结果:成功构建重组载体cre-pCEP4和pStop-eGFP,将2个载体瞬时共转染PEF;经潮酶素B筛选出cre重组酶稳定表达的MCF-7细胞系瞬时转染pStop-eGFP,在荧光显微镜下观察2种细胞均有绿色荧光蛋白的表达。而单独转染pStop-eGFP的MCF-7细胞系和PEF均未见绿色荧光蛋白的表达。结论:重组载体cre-pCEP4在细胞内能够表达cre重组酶,并且表达的cre重组酶能够识别loxp位点,删除两同向loxp间的DNA片段。

关键词： cre-pCEP4 cre/loxp重组系统猪胚胎成纤维细胞 MCF-7细胞系

基于cre/loxp重组系统的多基因载体构建及烟草转化研究

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北京林业大学学报 2010年第5期32卷 121-125页

作者：贾香楠李伟沈俊岭欧阳昆唏陈晓阳北京林业大学林木育种国家工程实验室华南农业大学林学院

利用一套基于cre/loxp重组系统的植物多基因表达载体系统将苏云杆菌毒蛋白基因(BtCryIAc)、甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH)、GA20氧化酶基因(pttGA20ox)和rolB基因构建于植物表达载体pYL1305上,命名为pYL1305BBGR。采用农杆菌介导的叶盘法转... 详细信息

利用一套基于cre/loxp重组系统的植物多基因表达载体系统将苏云杆菌毒蛋白基因(BtCryIAc)、甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH)、GA20氧化酶基因(pttGA20ox)和rolB基因构建于植物表达载体pYL1305上,命名为pYL1305BBGR。采用农杆菌介导的叶盘法转化烟草,经PCR和Southern blot检测发现,多基因已成功转入烟草基因组中;经半定量RT-PCR检测证实,4个基因均能正常表达。

关键词： cre/loxp重组系统多基因表达载体 BtCrylAc基因 BADH基因 pttGA200x基因 rolB基因

cre/loxp系统在转基因小鼠上的应用策略

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生物化学与生物物理进展 2000年第3期27卷 235-238页

作者：朱焕章史景泉 *** 第三军医大学西南医院病理学研究所重庆400038

cre/loxp位点特异重组酶系统已发展为在体内外进行遗传操作的一个新的有力工具 .该系统在转基因小鼠上的应用 ,可使转基因的表达或靶基因的缺失 /突变的位点特异DNA重组不仅发生在小鼠发育的某一阶段或特定的组织器官 ,而且 ,若与控制Cr... 详细信息

cre/loxp位点特异重组酶系统已发展为在体内外进行遗传操作的一个新的有力工具 .该系统在转基因小鼠上的应用 ,可使转基因的表达或靶基因的缺失 /突变的位点特异DNA重组不仅发生在小鼠发育的某一阶段或特定的组织器官 ,而且 ,若与控制cre表达或功能的诱导系统结合 ,则可以时空方式体现 .

关键词：基因打靶 cre/loxp重组系统转基因小鼠调控

无标记的变异链球菌的clpP基因缺陷株的构建

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中华微生物学和免疫学杂志 2010年第12期30卷 1073-1077页

作者：彭诚于丹妮张文娟韩育植任志明天津医科大学第二医院口腔科 300211

目的构建无标记的clpP基因缺陷的变异链球菌（简称变链菌）突变株.方法设计引物PCR扩增大观霉素（Sp）抗性基因,使loxp位点位于Sp抗性基因的两侧,构建出大观霉素抗性基因盒（loxp-Sp-loxp）.将clpP基因克隆到pGEM-T-Easy TA载体后,双... 详细信息

目的构建无标记的clpP基因缺陷的变异链球菌（简称变链菌）突变株.方法设计引物PCR扩增大观霉素（Sp）抗性基因,使loxp位点位于Sp抗性基因的两侧,构建出大观霉素抗性基因盒（loxp-Sp-loxp）.将clpP基因克隆到pGEM-T-Easy TA载体后,双酶切以去除clpP基因的部分序列,并连入loxp-Sp-loxp,得到clpP基因缺陷的同源重组载体pIB△clpP-Sp.将该载体线性化并电转变链菌标准株,大观霉素筛选得到clpP基因缺陷株.再以温敏质粒pcrePA电转缺陷株,cre重组酶表达并删除选择标记基因,继而在限制性温度下培养以消除pcrePA,获得无标记的clpP基因缺陷株,并进行PCR及DNA测序鉴定.结果 PCR及DNA测序结果表明clpP基因内部分序列已被删除,且无Sp抗性基因,该部位只留有一个34 bp的loxp位点.结论在变链菌中成功构建出无标记的clpP基因缺陷株,为进一步研究clpP基因的功能及其在变链菌致龋过程中的作用奠定了基础.

关键词：变异链球菌 clpP基因 CIpP 同源性重组 cre/loxp重组系统

髓系特异性Abro1基因敲除小鼠构建和表型初步分析

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中国免疫学杂志 2022年第5期38卷 580-585页

作者：李亚婷张洁尹荣华杨晓明(指导) 任广明(指导) 葛志强(指导) 天津大学化工学院制药工程系天津300072 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院生命组学研究所北京102206

目的:构建髓系特异性Abro1(Abraxas brother 1)基因敲除小鼠,并初步分析其对小鼠造血系统及LPS诱导败血症的影响。方法:采用CRISPR/Cas9基因编辑技术和cre/loxp重组系统构建Abro1^(flox/+)小鼠,将Abro1^(flox/+)雌雄小鼠自交,子代得到Ab... 详细信息

目的:构建髓系特异性Abro1(Abraxas brother 1)基因敲除小鼠,并初步分析其对小鼠造血系统及LPS诱导败血症的影响。方法:采用CRISPR/Cas9基因编辑技术和cre/loxp重组系统构建Abro1^(flox/+)小鼠,将Abro1^(flox/+)雌雄小鼠自交,子代得到Abro1^(flox/flox)基因型小鼠。Abro1^(flox/flox)与Lyz2-cre^(+)小鼠交配,子代得到Abro1^(flox/+)/Lyz2-cre^(+)小鼠,再将其与Abro1^(flox/flox)交配,最终得到的Abro1^(flox/flox)/Lyz2-cre^(+)小鼠为髓系特异性Abro1基因敲除小鼠,即MKO小鼠;Abro1^(flox/flox)/Lyz2-cre^(−)小鼠作为野生型小鼠,即WT小鼠。提取WT和MKO小鼠尾基因组DNA,PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳鉴定其基因型。提取WT和MKO小鼠免疫细胞蛋白,Western blot检测ABRO1蛋白表达。流式细胞术分析小鼠骨髓和外周血免疫细胞组成,检测MKO小鼠对造血系统的影响。LPS处理WT和MKO小鼠3 h,检测血清中相关生化指标变化以及炎症因子分泌情况。结果:PCR和Western blot结果显示髓系特异性Abro1基因敲除小鼠构建成功。流式细胞术结果显示WT和MKO小鼠骨髓和外周血中髓系细胞(CD11b^(+)、CD11b^(+)Ly6G^(+)、CD11b^(+)Ly6C^(+))和淋巴细胞组成(CD3^(+)、B220^(+))无差异。LPS诱导败血症实验中,MKO小鼠相关生化指标和炎症因子水平均低于WT小鼠,表明MKO小鼠可抵抗LPS诱导的败血症。结论:成功构建ABRO1 MKO敲除小鼠,发现MKO小鼠造血系统正常,但可抵抗LPS诱导的败血症,ABRO1 MKO小鼠的建立为揭示ABRO1在免疫细胞亚群中的差异性调控机制提供了良好的动物模型。

关键词： ABRO1 cre/loxp重组系统髓系特异性基因敲除小鼠造血分化败血症

基于AlcR/alcA和cre/loxp系统的标记基因诱导删除体系

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中国农业科学 2011年第17期44卷 3491-3500页

作者：赵青郭仰东谢华马荣才姚磊中国农业大学农学与生物技术学院北京市农林科学院农业生物技术研究中心北京市农业局

【目的】通过构建能够在植物生长发育阶段经乙醇诱导将选择标记基因删除的载体,消除选择标记基因带来的潜在安全隐患。【方法】利用AlcR/alcA诱导系统和cre/loxp位点特异性重组系统删除选择标记基因。当外源诱导物乙醇存在时,激活下游Cr... 详细信息

【目的】通过构建能够在植物生长发育阶段经乙醇诱导将选择标记基因删除的载体,消除选择标记基因带来的潜在安全隐患。【方法】利用AlcR/alcA诱导系统和cre/loxp位点特异性重组系统删除选择标记基因。当外源诱导物乙醇存在时,激活下游cre的表达。cre重组酶识别2个同向loxp位点,剔除位点之间的DNA片段,包括选择标记基因、AlcR/alcA系统和cre/loxp系统,而目的基因gus在诱导前后均为组成型表达。【结果】拟南芥转基因植株受乙醇诱导严格控制cre表达的"开"和"关"。经诱导的转基因植株不能在选择培养基上继续生长。分子生物学检测显示,2个同向loxp位点间序列均已删除,表明标记基因删除效果明显。【结论】基于AlcR/alcA和cre/loxp系统的标记基因诱导删除体系切实可行,有广泛的应用前景。

关键词： cre/loxp重组系统 AlcR/alcA诱导系统删除选择标记基因

大容量天然噬菌体抗体库的建立及多样性初步验证

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军事医学科学院院刊 2008年第4期32卷 305-308,358页

作者：王辉黄英王琰沈倍奋军事医学科学院基础医学研究所北京100850 海军总医院北京100037

目的:构建超大容量天然噬菌体抗体库。方法:从正常人外周血和新生儿脐血中分离淋巴细胞(>180份),提取RNA,用RT-PCR分别扩增抗体可变区轻重链基因(VH和VL),通过重叠PCR技术将VH和VL连接为单链抗体ScFv形式,克隆插入到pDF噬菌粒载体,转化X... 详细信息

目的:构建超大容量天然噬菌体抗体库。方法:从正常人外周血和新生儿脐血中分离淋巴细胞(>180份),提取RNA,用RT-PCR分别扩增抗体可变区轻重链基因(VH和VL),通过重叠PCR技术将VH和VL连接为单链抗体ScFv形式,克隆插入到pDF噬菌粒载体,转化XL1-Blue细菌得到ScFv初级抗体库,并以高感染复数(MOI≥100)感染cre+菌株BS1365,利用cre/loxp位点特异性重组原理,使VH和VL基因定向同源重组匹配,随后以低感染复数(MOIcre/loxp定位重组系统成功构建了超大容量天然噬菌体抗体库,初步尝试对5种抗原进行筛选均获成功,提示该抗体库多样性较好,可用于制备人源抗体。

关键词：噬菌体抗体库 cre/loxp重组系统单链抗体