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水产学报 2024年第2期48卷 31-45页

作者：张鑫洛王永阳吴子良黄小红陈新华张伟妮海水养殖生物育种全国重点实验室福建省海洋生物技术重点实验室福建农林大学中西兽医结合与动物保健福建省高校重点实验室

为了揭示硬骨鱼C型凝集素受体(C-type lectin receptor,CTLR)的生物学功能，实验以从大黄鱼转录组数据库中筛选出的一个CTLR基因—C型凝集素结构域家族4成员e基因(clec4e)为研究对象，研究其分子特征、表达分布和凝集特性。结果显示，Lc... 详细信息

为了揭示硬骨鱼C型凝集素受体(C-type lectin receptor,CTLR)的生物学功能，实验以从大黄鱼转录组数据库中筛选出的一个CTLR基因—C型凝集素结构域家族4成员e基因(clec4e)为研究对象，研究其分子特征、表达分布和凝集特性。结果显示，Lcclec4e cDNA全长1 546 bp，开放阅读框(ORF)771 bp，编码254个氨基酸。Lcclec4e的N端有一个跨膜区，无信号肽，C端含有一个糖识别结构域(CRD)，其中含有糖结合位点ePN和WFD以及6个可形成二硫键的保守半胱氨酸。系统发育分析表明，Lcclec4e与多种鲈形目鱼类clec4e具有较近的亲缘关系。荧光定量PCR结果显示，Lcclec4e在所检测的10种组织中呈组成型分布，且在肝脏中表达量最高；Lcclec4e在来源于大黄鱼头肾组织的原代巨噬细胞、淋巴细胞和粒细胞中均有表达，且在巨噬细胞中表达量最高；经灭活溶藻弧菌刺激后，Lcclec4e在3种免疫细胞中的表达均极显著上调。原核表达的重组Lcclec4e胞外段(recombinant Lcclec4e-extracellular domain,rLcclec4e-ex)具有Ca2+依赖性的凝集活性，可凝集小鼠、家兔的红细胞，以及嗜水气单胞菌、变形假单胞菌、溶藻弧菌和坎氏弧菌等4种水产常见的革兰氏阴性菌。D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、D-麦芽糖、α-乳糖和脂多糖均可抑制rLcclec4e-ex对大黄鱼重要病原菌变形假单胞菌的凝集作用，说明Lcclec4e可能与变形假单胞菌表面的糖类物质结合。上述结果提示，Lcclec4e可能作为一种模式识别受体，通过结合病原菌表面的糖类病原体相关分子模式来识别病原，参与大黄鱼抗细菌感染的免疫防御。

关键词：大黄鱼 C型凝集素受体(CTLR) clec4e 红细胞凝集细菌凝集

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连接粘附分子样蛋白JAML在急性肾损伤中的作用

连接粘附分子样蛋白JAML在急性肾损伤中的作用

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作者：王碧欧山东大学

学位级别：硕士

研究目的与意义急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)已成为全球性的公共健康问题,其死亡率居高不下且极易发展为慢性肾病及终末期肾病。其常见的诱因包括:肾缺血再灌注、肾毒性药物、脓毒症等。急性肾损伤的病理生理学机制十分复杂,免... 详细信息

研究目的与意义急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)已成为全球性的公共健康问题,其死亡率居高不下且极易发展为慢性肾病及终末期肾病。其常见的诱因包括:肾缺血再灌注、肾毒性药物、脓毒症等。急性肾损伤的病理生理学机制十分复杂,免疫炎症反应在急性肾损伤中发挥了非常关键的作用。急性肾损伤后肾小管上皮细胞发生变性、坏死,释放损伤相关分子模式(damage associated molecular patterns,DMAP),后者被模式识别受体(pattern recognition receptor,PRRs)识别进而激活固有免疫反应。同时,肾小管上皮细胞也表现出免疫细胞的活性,一方面产生炎性介质,另一方面表达模式识别受体和主要组织相容性复合体(MHC)Ⅱ类分子等。肾小管周围的微血管内皮细胞通透性增加,表达粘附分子,促进炎症细胞的粘附和迁移。此外,各种免疫炎症细胞在损伤区域浸润,进一步活化释放大量炎性介质,导致炎症反应放大以及肾小管上皮细胞进一步损伤。肾组织内这三大类效应细胞相互影响,共同参与了肾脏局部固有免疫及适应性免疫功能紊乱,导致肾脏持续处于过度炎性状态,是引起急性肾损伤的主要机制。近年来,连接黏附样分子蛋白(junctional adhesion molecule-like protein,JAML,amical)在免疫细胞活化和炎症反应中的作用日益受到重视。JAML作为新型的连接黏附分子,是一种分泌性的Ⅰ型跨膜糖蛋白。其结构特点使它不仅可以介导细胞间相互作用,而且可以与细胞内蛋白结合从而介导下游信号通路。然而,JAML在急性肾损伤中是否扮演着重要角色,迄今仍未见报道。所以,探讨JAML在急性肾损伤中的作用有非常重要的意义。本课题将探讨JAML如何参与肾脏区域免疫调节,为阐明肾脏的免疫学机制,寻找新的免疫治疗靶点提供理论依据。研究方法***在肾缺血再灌注小鼠模型中的表达变化1.1体内模型的建立及JAML的检测用雄性野生型(wild type,WT)C57BL/6小鼠构建急性肾缺血再灌注模型,用蛋白质免疫印迹法(westernblot,WB)、实时荧光定量反转录聚合酶链反应法(Real-time RT-PCR)以及免疫组织化学法(immunohistochemistry,IHC)检测JAML在肾缺血再灌注各组织中的表达变化;另外腹腔注射顺铂构建急性肾损伤模型,并用IHC检测JAML的表达变化。1.2 JAML与肾小管不同部位标记物共定位用组织免疫荧光法(immunofluoresce,IF)对JAML与肾小管标记物蛋白进行荧光共定位。1.3体外模型的建立及JAML的检测培养人近曲小管上皮细胞(HK-2),体外模拟肾缺血再灌注模型:糖氧剥夺法(oxygen glucose deprivation,OGD);给药抗霉素A/2-脱氧葡萄糖(AA-2DG);给药氯化钴(CoCl2)。WB检测这几种条件下HK-2细胞中JAML蛋白水平变化。另外,通过缺氧处理的HK-2细胞复氧后,用其上清处理巨噬细胞,WB检测巨噬细胞中JAML的蛋白水平变化。***在小鼠肾缺血再灌注损伤中的作用2.1野生型与JAML-/-小鼠肾脏功能学指标的对比高效液相色谱法(high-performance liquid chromatography,HPLC)检测野生型与JAML-/-(JAML knockout)小鼠血清中肌酐含量。罗氏Cobas 8000全自动生化分析仪分析野生型与JAML-/-小鼠血清中尿素氮的含量。2.2野生型与JAML-/-鼠肾脏形态学损伤的对比苏木素-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining,He)对野生型与JAML-/-小鼠的肾脏石蜡切片进行染色,并进行形态学损伤评分。原位末端转移酶标记技术(terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end labeling,TUNeL)检测野生型和JAML-/-小鼠肾脏细胞凋亡情况。2.3小鼠肾缺血再灌注模型炎症指标检测Real-time RT-PCR检测野生型与JAML-/-小鼠肾脏炎症因子的含量。IHC检测野生型和JAML-/-小鼠肾脏切片巨噬细胞标记蛋白CD68、中性粒细胞标记蛋白Ly6B。3.在肾缺血再灌注损伤中JAML对下游分子clec4e的影响通过基因芯片技术分析肾缺血再灌注野生型和JAML-/-小鼠间的差异表达基因,并绘制模式识别受体家族分子热图。Real-time RT-PCR对筛选出来的基因做进一步验证。RT-PCR检测巨噬细胞与HK-2细胞中模式识别受体clec4e的表达变化。进而,用AA/2-DG刺激HK-2细胞观察clec4e的变化。研究结果***在肾缺血再灌注模型

关键词：急性肾损伤 JAML 人近曲小管上皮细胞 clec4e

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