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家蝇cecropin基因的原核表达及表达产物的免疫学鉴定

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中国人兽共患病学报 2009年第5期25卷 439-441,445页

作者：王炜郑学礼南方医科大学公共卫生与热带病学院病原生物学系广州510515

目的克隆家蝇抗菌肽基因cecropin A,进行原核表达,制备兔抗家蝇幼虫血清鉴定表达产物。方法在GenBank中检索家蝇cecropin A基因序列,设计特异性引物,从家蝇幼虫组织总RNA中RT-PCR扩增cecropin A成熟肽(Ma-turececropin,MC)基因,克隆入... 详细信息

目的克隆家蝇抗菌肽基因cecropin A,进行原核表达,制备兔抗家蝇幼虫血清鉴定表达产物。方法在GenBank中检索家蝇cecropin A基因序列,设计特异性引物,从家蝇幼虫组织总RNA中RT-PCR扩增cecropin A成熟肽(Ma-turececropin,MC)基因,克隆入原核表达载体pET32a中,并转化大肠埃希菌BL21(DE3)。经异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析重组蛋白。用家蝇幼虫匀浆液免疫家兔,获得多抗血清,双向琼脂扩散实验鉴定多克隆抗血清的效价。Western blotting鉴定纯化后的重组蛋白质。结果重组蛋白质Thiore-doxin(硫氧还蛋白,Trx)-MC,经兔抗家蝇幼虫血清鉴定正确。结论天然MC在原核表达系统中得到正确表达。

关键词：家蝇 cecropin 多克隆抗体融合表达

家蚕抗菌肽cecropin A的表达特征及其体内外抑菌研究

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基因组学与应用生物学 2016年第6期35卷 1368-1376页

作者：吕丁丁耿涛侯成香黄玉霞覃光星郭锡杰江苏科技大学生物技术学院镇江212018 镇江市高等专科学校镇江212003

家蚕抗菌肤cecropin A(BmCecA)是家蚕体液免疫中产生的一种重要的抗菌肤。本研究利用RT-PCR技术克隆出BmCecA基因的开放阅读框(ORF),该ORF编码22个氨基酸的信号肤和37个氨基酸的成熟肤,通过蛋白结构分析该成熟肤形成经典的双亲α螺旋。... 详细信息

家蚕抗菌肤cecropin A(BmCecA)是家蚕体液免疫中产生的一种重要的抗菌肤。本研究利用RT-PCR技术克隆出BmCecA基因的开放阅读框(ORF),该ORF编码22个氨基酸的信号肤和37个氨基酸的成熟肤,通过蛋白结构分析该成熟肤形成经典的双亲α螺旋。实时荧光定量PCR表明,BmCecA在5龄家蚕的体壁、马氏管、中肠、丝腺、血淋巴和脂肪体中均有表达在脂肪体中表达量最高,其次是血淋巴。通过固相合成法合成BmCecA成熟肤用质谱和聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明其分子量约为4.05 kD,高效液相色谱检测其纯度为89.14%。用合成多肤分别对革兰氏阴性菌大肠杆菌(Escherichia coli)、铜绿假单胞菌(Pseudomouas aerugiuosa)、革兰氏阳性菌球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)做体外抑菌实验,发现BmCecA对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有明显的抑菌作用。首次用BmCecA做家蚕的体内抑菌实验,结果显示注射BmCecA的家蚕存活率显著高于对照组相对于对照组,致死中时间(LT_(50))分别延长了17.85%(大肠杆菌)、37.31%(铜绿假单胞菌)、21.92%(球形节杆菌)、49.45%(枯草芽孢杆菌)差异显著。凝胶迁移实验结果说明BmCecA可能在破坏细菌细胞膜之后作用于基因组DNA和RNA,从而导致细菌的快速死亡。本研究结果有利于从分子水平上深入理解家蚕乃至其它昆虫抵御细菌侵染的防御机理,也为家蚕的抗菌育种提供理论依据。

关键词：家蚕 cecropin A 抗菌活性细菌

抗菌肽cecropin D在毕赤酵母中的表达、纯化及活性鉴定

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中国生物制品学杂志 2008年第3期21卷 185-189页

作者：尹娜李鸿钧彭梅谢天宏张光明施锐孙茂盛中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所分子生物室昆明650118

目的在毕赤酵母GS115中表达抗菌肽cecropin D,并检测其抗菌活性。方法根据毕赤酵母密码子的偏爱性,人工合成6条寡聚核苷酸片段,经磷酸化、退火、连接并克隆入酵母表达载体pPIC9K。重组表达质粒pPIC9K-D转化至毕赤酵母菌GS115,经G418筛选... 详细信息

目的在毕赤酵母GS115中表达抗菌肽cecropin D,并检测其抗菌活性。方法根据毕赤酵母密码子的偏爱性,人工合成6条寡聚核苷酸片段,经磷酸化、退火、连接并克隆入酵母表达载体pPIC9K。重组表达质粒pPIC9K-D转化至毕赤酵母菌GS115,经G418筛选,阳性高拷贝克隆用0.5%的甲醇诱导表达,表达产物经CM-Sepharose层析柱纯化,Tricine-SDS-PAGE分析,琼脂糖扩散法和比浊法测定其抗菌活性。结果经Tricine-SDS-PAGE检测,在相对分子质量3900左右处可见目的蛋白表达条带,纯化后的目的蛋白纯度达90%以上,获得的抗菌肽cecropin D对一些革兰阳性菌和革兰阴性菌均有抑菌活性。结论抗菌肽cecropin D成功地在毕赤酵母中分泌表达,为以后深入研究抗菌肽奠定了基础。

关键词：抗菌肽 cecropin D 毕赤酵母分泌表达抗菌活性

Study on Preventive Effect of cecropin and Lysozyme on Skin Fester Disease in Trionyx sinensis

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Animal Husbandry and Feed Science 2017年第6期9卷 390-393,406页

作者： Chen Chunshan Guo Minglei Wei Kai Ma Long Geng Yan Beijing Aquatic Wildlife Rescue and Conservation Center

[ Objective ] This study was to investigate the preventive effect of cecropin and lysozyme on skin fester disease in Trionyx sinensis. [ Method ] By employing intramuscular injection method, the preventive effect of mixtures of cecropin （10 mg/kg） and lysozyme（ 10 mg/kg） and of cecropin（6 mg/kg） and lysozyme（ 5 mg/kg） were challenged on Aeromonas encheleia-caused skin fester disease in T. sinensis. The mortality and relative percent survival were used evaluate the preventive effect of different drugs. The serum agglutination titer, cytophagocytosis and bactericidal activity were detected to compare the effect of drugs on the immunity and disease resistance of T. sinensis. [ Result] The residue concentrations of gentamicin and lysozyme in serum were compared to evaluate the side effect of drugs used challenged. The results showed that combined use of cecropin and lysozyme gave the best preventive effect and immunity in T. sinensis, with an extremely significant difference from other treatments （ P 〈 0.01 ）. Analysis of drug residue in serum indicated that lysozyme was completely metabolized 6 days after medication, while gentamicin residue was still observed 12 days later. [ Conclusion] The combined application of cecropin and lysozyme showed better preventive effect than antibiotics in fester disease of T. sinensis. Moreover, no drug residue and side effect were observed in the combined use treatment. This method avoids the side effect of antibiotics, worthy of extension at commercial scale.

关键词： Trionyx sinensis cecropin Lysozyme Skin fester disease Prevention

家蚕和果蝇的抗菌肽cecropin B基因的原核表达及抑菌活性分析

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蚕业科学 2011年第2期37卷 246-253页

作者：杨莹王成林徐家萍尤征英凌琳周敬波安徽农业大学生命科学学院合肥230036

动物抗菌肽天蚕素(cecropin)因具有抗菌谱广、活性较强、不易产生耐药性等特点而成为新型抗菌剂开发的材料。为了探讨通过原核表达的途径高效获取天然cecropin,以重叠PCR方法分别人工合成家蚕(Bombyx mori)和果蝇(Drosophilamelanogast... 详细信息

动物抗菌肽天蚕素(cecropin)因具有抗菌谱广、活性较强、不易产生耐药性等特点而成为新型抗菌剂开发的材料。为了探讨通过原核表达的途径高效获取天然cecropin,以重叠PCR方法分别人工合成家蚕(Bombyx mori)和果蝇(Drosophilamelanogaster)的抗菌肽cecropin B基因(CecB2)并克隆至T载体,测序确认后分别克隆至pET-32a载体,转化至*** BL21(DE3)宿主菌进行表达。通过SDS-PAGE和Western blotting检测到2种目的蛋白均得到表达,但表达量存在差异,Bradford法测定纯化后的BmCecB2融合蛋白和DmCecB2融合蛋白的质量浓度分别为0.6、2.0 mg/mL。经Ni-NTA亲和层析纯化和透析处理后的2种产物的抗菌活性存在明显差异:DmCecB2和BmCecB2的质量浓度为10 mg/mL时,对*** DH5α的抑菌圈直径分别为15、8 mm左右,最小抑菌浓度分别为0.05、0.10 mg/mL。以上结果说明DmCecbB2的原核表达效率及表达产物的抑菌活性均明显高于BmCecB2。用生物信息学方法分析家蚕和果蝇的CecB2蛋白在结构上存在差异,这可能是导致2种产物活性不同的主要原因。

关键词：家蚕果蝇抗菌肽 cecropin B 原核表达抗菌活性基因结构

杂合抗菌肽cecropin P1-Dermaseptin S4在毕赤酵母中的分泌表达及活性鉴定

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中国病原生物学杂志 2014年第2期9卷 172-176页

作者：孙长峰仲维霞王洪法崔勇赵桂华山东省医学科学院、山东省寄生虫病防治研究所山东渟272033 济南大学、山东省医学科学院医学与生命科学学院山东济南250100

目的在毕赤酵母中分泌表达具有抗菌活性的杂合抗菌肽cecropin P1-Dermaseptin S4(CP1-DS4)。方法根据毕赤酵母密码子的偏爱性优化cecropin P1和Dermaseptin S4两抗菌肽基因序列,通过SOE-PCR拼接,构建克隆载体pMD18T-cp1-ds4并测序;pMD18... 详细信息

目的在毕赤酵母中分泌表达具有抗菌活性的杂合抗菌肽cecropin P1-Dermaseptin S4(CP1-DS4)。方法根据毕赤酵母密码子的偏爱性优化cecropin P1和Dermaseptin S4两抗菌肽基因序列,通过SOE-PCR拼接,构建克隆载体pMD18T-cp1-ds4并测序;pMD18T-cp1-ds4经EcoRⅠ、XbaⅠ双酶切后构建重组表达载体pPICZαA-cp1-ds4,测序验证开放阅读框(ORF)正确后经SacⅠ线性化处理,然后电转化毕赤酵母X-33(800V,1mm电转化杯,15s电击1次)并利用Zeocin筛选阳性重组子。重组子接种BMGY、BMMY培养基,采用5%的甲醇诱导表达,采用Tricine-SDS-PAGE分析表达上清,表达上清浓缩后进行抑菌试验。结果在本研究中拼接引物经SOE-PCR拼接后得到优化的长度为120bp的Dermaseptin S4基因基因片段,该片段与cecropin P1基因连接形成约197bp杂合抗菌肽片段,成功构建pPICZαA-cp1-ds4表达载体,电转化获得重组酵母菌pPICZαA-cp1-ds4/X-33,经诱导后可产生分子质量单位约为9.7ku的目的多肽,该多肽对大肠埃希菌和金黄葡萄球菌均有抑制作用。结论杂合肽CP1-DS4可以在毕赤酵母X-33中融合分泌表达,且具有抗菌活性。

关键词：杂合抗菌肽 cecropin P1 dermaseptin s4 毕赤酵母分泌表达

绿僵菌素A对家蚕cecropin B和gloverin 4基因表达的影响

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环境昆虫学报 2016年第5期38卷 984-989页

作者：胡维娜何广位李福霞胡琼波华南农业大学农学院广州510642

绿僵菌素A(DA)是由金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae产生的一种环缩羧肽类次生化合物,具有抗昆虫免疫作用,但是人们对其影响免疫相关基因调控的机理缺乏了解。本实验以家蚕Bm12细胞为材料,采用RNAi技术沉默相关转录因子,结合荧光定量... 详细信息

绿僵菌素A(DA)是由金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae产生的一种环缩羧肽类次生化合物,具有抗昆虫免疫作用,但是人们对其影响免疫相关基因调控的机理缺乏了解。本实验以家蚕Bm12细胞为材料,采用RNAi技术沉默相关转录因子,结合荧光定量PCR(q PCR)技术,明确DA处理或沉默TOLL和IMD信号通路相关转录因子后抗菌肽cecropin B和gloverin 4基因表达的变化。实验发现,DA能引起抗菌肽cecropin B基因表达上调和gloverin 4基因表达下调。利用特异性siRNA分别沉默转录因子BmRelish1、BmRelish2、BmRel、Bm FOXg1后,发现只有沉默转录因子BmRelish时,cecropin B和gloverin 4基因表达才下调,说明这两种抗菌肽的合成均通过IMD信号通路调控。当沉默BmRelish1或BmRel基因及DA处理联合作用时,cecropin B基因显著下调,说明在抑制cecropin B合成时,DA与转录因子BmRelish1或者BmRel之间存在密切的协同效应;同样,在促进gloverin 4合成时,DA与转录因子BmRelish2之间也存在着协同效应。

关键词：绿僵菌素A Bm12细胞 cecropin gloverin

抗菌肽cecropin AD在毕赤酵母中的组成型表达及中试发酵研究

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饲料工业 2011年第19期32卷 25-29页

作者：江学斌张敏静林健聪梁世中华南理工大学生物科学与工程学院广州大学生命科学学院暨南大学医药生物技术研究开发中心

构建表达抗菌肽cecropin AD蛋白的真核重组表达质粒pGAPZα-A-CAD,并转化酵母菌Pichia pastoris X-33,Zeocin抗性筛选阳性重组子,通过PCR鉴定、Tricine-SDS-PAGE分析和琼脂孔穴扩散法筛选获得抗菌肽CAD组成型表达菌株,并采用pH-溶氧监... 详细信息

构建表达抗菌肽cecropin AD蛋白的真核重组表达质粒pGAPZα-A-CAD,并转化酵母菌Pichia pastoris X-33,Zeocin抗性筛选阳性重组子,通过PCR鉴定、Tricine-SDS-PAGE分析和琼脂孔穴扩散法筛选获得抗菌肽CAD组成型表达菌株,并采用pH-溶氧监控策略进行工程菌Pichia pastoris X-33/pGAPZα-A-CAD的50 L中试发酵研究。结果表明,本实验成功实现了抗菌肽CAD在毕赤酵母Pichiapastoris X-33中的组成型表达pGAPZα-A,Tricine-SDS-PAGE分析显示在4.0 kDa处有明显的目的条带,工程菌经50 L发酵罐培养48 h后收获的上清液,100℃热处理10 min后,对金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠杆菌ATCC25922等均有明显的抑杀作用。抗菌肽的组成型表达方法在本研究中得到了成功应用,中试研究为以后的规模化生产和应用奠定了基础。

关键词：抗菌肽 cecropin AD 毕赤酵母发酵抑菌活性

抗菌肽cecropin A基因原核表达及表达产物的鉴定(英文)

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中国组织工程研究与临床康复 2011年第24期15卷 4549-4552页

作者：陈磊河南中医学院第一附属医院心内科河南省郑州市450000

背景:cecropins是一种具有抗菌活性的小分子蛋白质。采用真核细胞表达或人工合成cecropins,效率低、成本高。目的:克隆表达家蝇抗菌肽基因cecropin A,并对其重组表达产物进行鉴定。方法:依据GenBank中家蝇cecropin A基因序列设计特异性... 详细信息

背景:cecropins是一种具有抗菌活性的小分子蛋白质。采用真核细胞表达或人工合成cecropins,效率低、成本高。目的:克隆表达家蝇抗菌肽基因cecropin A,并对其重组表达产物进行鉴定。方法:依据GenBank中家蝇cecropin A基因序列设计特异性引物,用RT-PCR从家蝇幼虫组织中扩增cecropin A成熟肽基因,将其克隆入原核表达载体pET32a中,与表达载体中的Thioredoxin基因构成融合基因,并转化*** BL21。经异丙基-β-D硫代半乳糖苷诱导表达。采用家蝇幼虫血淋巴免疫家兔获得抗血清;Western blot和三羟甲基氨基甘氨酸-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定诱导的重组蛋白质。结果与结论:经异丙基-β-D硫代半乳糖苷诱导,***21可表达cecropin A成熟肽,兔抗家蝇幼虫血清、三羟甲基氨基甘氨酸-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳及Western blot结果证实表达产物为cecropin A成熟肽。说明使用原核表达系统可以获得天然cecropin A成熟肽。

关键词：家蝇 cecropin A 多克隆抗体融合表达三羟甲基氨基甘氨酸-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳