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稳定表达cas9蛋白的BHK-21单克隆细胞系的建立与鉴定

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中国兽医杂志 2022年第9期58卷 12-17页

作者：葛丽娟权冉陈俊贞袁圆圆付强李泽宇史慧君新疆农业大学动物医学学院新疆乌鲁木齐830052

为建立基于CRISPR/cas9技术的基因敲除细胞文库,本研究采用慢病毒转导构建稳定表达cas9蛋白的BHK-21-cas9单克隆细胞系。将pMD2.G、pSPAX2和lenticas9-Blast共转染HEK-293T细胞包装慢病毒,感染BHK-21细胞后经Blasticidin S进行阳性筛选... 详细信息

为建立基于CRISPR/cas9技术的基因敲除细胞文库,本研究采用慢病毒转导构建稳定表达cas9蛋白的BHK-21-cas9单克隆细胞系。将pMD2.G、pSPAX2和lenticas9-Blast共转染HEK-293T细胞包装慢病毒,感染BHK-21细胞后经Blasticidin S进行阳性筛选,筛选5代后通过有限稀释法培养cas9单克隆细胞,利用Western blot检测cas9蛋白的表达。为获得cas9活性强的BHK-21-cas9单克隆细胞系,根据紧密连接蛋白(OCLN)基因序列,设计针对OCLN基因的sgRNAs,构建lentiGuide-Puro-OCLN sgRNA重组质粒,测序鉴定后将lentiGuide-Puro-OCLN sgRNA重组载体转染BHK-21-cas9单克隆细胞系。使用嘌呤霉素进行阳性细胞筛选,经过Western blot检测OCLN蛋白的表达。Western blot检测cas9蛋白结果显示,共获得了17株BHK-21-cas9单克隆细胞系;测序结果显示,lentiGuide-Puro-OCLN sgRNA载体构建成功,通过Western blot鉴定,有2株cas9编辑效果好、具有高敲除效率的BHK-21单克隆细胞系。结果表明,本研究构建了稳定表达cas9蛋白的BHK-21-cas9单克隆细胞系,可以用于CRISPR/cas9敲除文库的转导,建立基因敲除细胞文库,为筛选影响病毒感染和复制的功能基因提供了科学依据。

关键词： cas9蛋白 BHK-21细胞系慢病毒紧密连接蛋白

cas9蛋白对亲骨转移人乳腺癌细胞株生物学性质和超微结构的影响

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中国生物工程杂志 2016年第7期36卷 1-6页

作者：宋丽杰王丽杨传红赖晃文王捷华南理工大学生物科学与工程学院广州510006 广州军区广州总医院广州510010

目的:构建表达cas9蛋白的亲骨转移人乳腺癌细胞株,并研究cas9蛋白的表达对细胞生物学性质和超微结构的影响,为利用CRISPR/cas9技术研究乳腺癌骨转移分子机制提供实验基础。方法:通过慢病毒载体介导cas9蛋白基因转染亲骨转移人乳腺癌细胞... 详细信息

目的:构建表达cas9蛋白的亲骨转移人乳腺癌细胞株,并研究cas9蛋白的表达对细胞生物学性质和超微结构的影响,为利用CRISPR/cas9技术研究乳腺癌骨转移分子机制提供实验基础。方法:通过慢病毒载体介导cas9蛋白基因转染亲骨转移人乳腺癌细胞株MDA-MB-231BO,通过G418筛选转染细胞,采用流式细胞术、Western blot、免疫细胞化学验证cas9基因转染是否成功;运用实时无标记动态细胞分析技术和细胞划痕实验检测cas9蛋白表达对细胞增殖及迁移的影响;透射电镜观察cas9蛋白表达对细胞超微结构的影响。结果:成功构建稳定表达cas9蛋白的亲骨转移人乳腺癌细胞株MDA-MB-231BO-cas9,cas9蛋白的表达对细胞的增殖、迁移和超微结构无明显影响。结论:MDA-MB-231BO-cas9细胞可用于CRISPR/cas9技术进一步研究。

关键词： cas9蛋白亲骨转移人乳腺癌细胞实时无标记动态细胞分析透射电镜

稳定表达cas9蛋白的HeLa细胞系的建立

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中国预防兽医学报 2020年第9期42卷 893-898页

作者：刘燕飞那雷王晓钧中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/马传染病和慢病毒病研究创新团队黑龙江哈尔滨150069

为建立基于CRISPR-cas9技术的基因敲除细胞文库,本研究利用慢病毒载体pMD2.G、pSPAX2(HIV-1的gag-pol表达质粒)和lentiCRISPR v2-Hyg包装慢病毒,感染HeLa细胞2 d后用400μg/mL潮霉素培养液筛选两周,获得稳定表达cas9蛋白的多克隆细胞系... 详细信息

为建立基于CRISPR-cas9技术的基因敲除细胞文库,本研究利用慢病毒载体pMD2.G、pSPAX2(HIV-1的gag-pol表达质粒)和lentiCRISPR v2-Hyg包装慢病毒,感染HeLa细胞2 d后用400μg/mL潮霉素培养液筛选两周,获得稳定表达cas9蛋白的多克隆细胞系。利用流式细胞分选系统分选及western blot鉴定获得9株HeLa-cas9单克隆细胞系。为获得具有高效率敲除内源基因的HeLa细胞系,利用同时表达绿色荧光蛋白(GFP)和GFP sgRNA的慢病毒感染HeLa-cas9单克隆细胞系,经1μg/mL嘌呤霉素培养液筛选一周,流式细胞术检测表达绿色荧光蛋白细胞的百分比,以计算HeLa细胞株的敲除效率,进而建立了一株稳定表达cas9蛋白的具有高敲除效率的HeLa单克隆细胞系。该细胞的cas9敲除效率为87%,CCK-8检测结果表明其具有很好的细胞活性。本研究获得的具有高敲除效率的稳定表达cas9蛋白的HeLa细胞系可以用于CRISPR敲除文库的转导,建立基因敲除细胞文库,为筛选参与特定功能的未知蛋白提供细胞平台。

关键词： cas9蛋白 HeLa细胞系基因敲除效率

cas9蛋白的克隆表达、分离纯化及多克隆抗体制备

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贵州医科大学学报 2019年第7期44卷 757-761,766页

作者：刘芳卢婷蔡梦迪吴芳草陈相好王彩霞崔古贞陈峥宏贵州医科大学基础医学院微生物学教研室贵州贵阳550025 贵州省普通高等学校病原生物学特色重点实验室贵州贵阳550025 贵州医科大学医学检验学院贵州贵阳550004

目的:获得高纯度cas9蛋白,制备cas9蛋白特异性抗体。方法:以cas9基因序列为模板,设计特异性引物,PCR扩增获得cas9基因全长序列,利用无缝拼接技术构建pET28a-cas9重组表达载体;转化***21(DE3),经IPTG诱导表达cas9蛋白,并利用His-Tag技术... 详细信息

目的:获得高纯度cas9蛋白,制备cas9蛋白特异性抗体。方法:以cas9基因序列为模板,设计特异性引物,PCR扩增获得cas9基因全长序列,利用无缝拼接技术构建pET28a-cas9重组表达载体;转化***21(DE3),经IPTG诱导表达cas9蛋白,并利用His-Tag技术分离纯化cas9蛋白;将纯化获得的cas9蛋白免疫新西兰大白兔,制备cas9蛋白多克隆抗体。结果:pET28a-cas9重组表达载体转化的***21(DE3)可表达cas9蛋白,纯化的cas9蛋白免疫家兔得到的多克隆抗体效价>1∶256 K。结论:本研究获得了高质量cas9蛋白及多克隆抗体,为后续CRISPR-cas9基因编辑的应用奠定了良好的基础。

关键词： cas9蛋白蛋白表达与纯化多克隆抗体

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Spcas9蛋白的高效可溶表达及应用

食品科学 2023年第10期44卷 150-157页

作者：廖清郑俊威王斌潘力华南理工大学生物科学与工程学院广东广州510006 广东省发酵与酶工程重点实验室广东广州510006

规律间隔成簇短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(CRISPR-associated protein 9,cas9)主要元件cas9蛋白一般采用大肠杆菌表达,但在表达纯化过程中易出现形成包涵体形式的不溶解性蛋白,内毒素含量高、蛋白过大导致蛋白折叠不正确、产量低等问题。为实现化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)cas9蛋白(Spcas9)在大肠杆菌中的高效可溶表达,进一步促进其应用及编辑技术的推广,本研究应用GB1促溶标签提高cas9蛋白表达量及溶解度,同时通过使用多重启动子策略进一步提高了cas9蛋白表达量。两种策略的组合使cas9蛋白表达量提升了2.52倍。体外酶切分析显示融合GB1标签的cas9蛋白功能活性不受影响。进一步组装RNP复合物转化黑曲霉宿主成功破坏了pyrG基因。

关键词： cas9蛋白核糖核蛋白复合体蛋白表达与纯化多重启动子

用于全基因组易位测序的Nalm6-cas9细胞系的构建

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中国实验血液学杂志 2022年第5期30卷 1384-1390页

作者：李倾城黄俊彬薛红漫杨默朱澂明李志光董俊超陈纯中山大学附属第七医院(深圳)儿科儿童血液肿瘤专科广东深圳518107 中山大学附属第七医院(深圳)科研中心广东深圳518107 香港中文大学儿科血液学/肿瘤学/BMT系中国香港999077 中山大学中山医学院广东广州510080

目的:为进行基于CRISPR-cas9的全基因组高通量易位测序,利用慢病毒转导构建表达cas9蛋白的Nalm6-cas9单克隆细胞系。方法:使用慢病毒载体lenticas9-Blast、psPAX2和pMD2.G共转染HEK293T细胞包装病毒,病毒感染Nalm6细胞后使用杀稻瘟菌素(... 详细信息

目的:为进行基于CRISPR-cas9的全基因组高通量易位测序,利用慢病毒转导构建表达cas9蛋白的Nalm6-cas9单克隆细胞系。方法:使用慢病毒载体lenticas9-Blast、psPAX2和pMD2.G共转染HEK293T细胞包装病毒,病毒感染Nalm6细胞后使用杀稻瘟菌素(Blasticidin)筛选,通过有限稀释法获得多个表达cas9蛋白的单克隆细胞株。Western blot检测单克隆细胞株中cas9蛋白的表达水平,细胞计数检测单克隆细胞株的细胞增殖活性。构建lentiCRISPRv2GFP-Δcas9、lentiCRISPRv2GFP-Δcas9-AF4、lentiCRISPRv2GFP-Δcas9-MLL质粒,并分别与pSPAX2、pMD2.G质粒共转染包装病毒,收集病毒感染Nalm6-cas9单克隆细胞株,使用T载体克隆检测单克隆细胞株的cas9蛋白的功能。结果:Western blot结果显示,Nalm6-cas9_1-6单克隆细胞株高水平表达cas9蛋白;细胞计数分析结果显示,Nalm6-cas9_1-6单克隆细胞株细胞增殖活性与对照细胞比较无显著差异;T载体克隆检测显示,Nalm6-cas9_1-6单克隆细胞株cas9蛋白具有高水平切割活性,对AF4和MLL基因的编辑效率在90%以上。结论:本研究得到了稳定表达高活性cas9蛋白的Nalm6-cas9_1-6单克隆细胞株,为基于CRISPR/cas9全基因组高通量易位测序技术探究治疗相关性白血病中MLL易位连接机制提供依据。

关键词： Nalm6细胞系 cas9蛋白慢病毒治疗相关性白血病全基因组高通量易位测序

应用于基因编辑的核糖核蛋白复合体的构建与活性验证

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生物技术通报 2022年第8期38卷 60-68页

作者：高伟欣黄火清赵晶张鑫杨宁杨浩萌中国农业科学院北京畜牧兽医研究所北京100193

CRISPR/cas9基因编辑技术具有操作简单、成本低廉和编辑效率高等优点,已经被广泛应用于动物、植物、微生物的基因编辑研究。在该技术体系中,发挥核酸剪切功能的是cas9蛋白和guideRNA(gRNA)组装而成的核糖核蛋白复合体,即RNP(ribonucleop... 详细信息

CRISPR/cas9基因编辑技术具有操作简单、成本低廉和编辑效率高等优点,已经被广泛应用于动物、植物、微生物的基因编辑研究。在该技术体系中,发挥核酸剪切功能的是cas9蛋白和guideRNA(gRNA)组装而成的核糖核蛋白复合体,即RNP(ribonucleoprotein)复合体。目前,应用体外组装的RNP复合体直接递送进入受体细胞进行基因编辑的研究越来越多,成为提高编辑效率、降低脱靶率的有效手段。本研究以获得具有高效剪切活性的RNP复合体为试验目的,在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达了cas9蛋白,并通过His-tag亲和树脂对重组cas9蛋白进行了纯化;同时,通过T7转录试剂盒对gRNA进行体外转录和纯化,使纯化的cas9蛋白和gRNA自发组装成RNP复合体,经体外活性检测,RNP复合体具有很好的DNA双链剪切活性;将其与donor DNA共同转化到黑曲霉菌株,成功敲除了目标蛋白,编辑效率达到90%以上。本研究获得的RNP复合体,可以应用于丝状真菌的基因编辑,节约了试验时间与成本,并推动RNP介导的基因编辑技术在更多领域的应用。

关键词： cas9蛋白 RNP复合体大肠杆菌活性验证

CRISPR-dcas9系统在妇科肿瘤治疗研究中的应用

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实用妇产科杂志 2022年第2期38卷 116-119页

作者：夏月(综述) 李力(审校) 广西医科大学附属肿瘤医院妇瘤科暨区域性高发肿瘤早期防治研究教育部重点室验室广西南宁530021

2013年以来,CRISPR-cas9基因编辑系统成为热点,随着研究深入,研究者们通过对RuvC中的D10A和HNH中的H840A两个位点进行点突变,使cas9蛋白失去核酸酶活性,成为dcas9。虽然不再具有DNA切割活性,但在sgRNA的引导下依然可与目的基因结合。科... 详细信息

2013年以来,CRISPR-cas9基因编辑系统成为热点,随着研究深入,研究者们通过对RuvC中的D10A和HNH中的H840A两个位点进行点突变,使cas9蛋白失去核酸酶活性,成为dcas9。虽然不再具有DNA切割活性,但在sgRNA的引导下依然可与目的基因结合。科学家将该系统应用于宫颈癌、卵巢癌及子宫内膜癌等妇科肿瘤的研究中并取得了巨大突破。通过以该系统为介导调节基因活性或基于dcas9蛋白无核酸酶活性的特性实现DNA实时检测,在妇科肿瘤的预防、筛查及治疗等方面均表现出潜在的临床应用价值。

关键词：规律间隔成簇短回文重复序列 cas9蛋白妇科肿瘤

CRISPR/cas系统介导的基因组定点编辑技术及其在农作物研究中的应用

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基因组学与应用生物学 2016年第6期35卷 1539-1545页

作者：涂万富段真珍张志麒何正权姚伟三峡大学生物技术研究中心宜昌443002 广西大学农学院南宁530004 湖北神农架大九湖国家湿地公园管理局神农架442417

通过序列特异性核酸酶(SSNs)对植物基因组进行定点编辑是一个基因功能验证和作物性状遗传改良的有效工具。近年来基于CRISPR/cas系统的基因组编辑技术成为SSNs又一强有力的工具,该技术发展迅速并得到广泛应用,已经改变了作物生物技术研... 详细信息

通过序列特异性核酸酶(SSNs)对植物基因组进行定点编辑是一个基因功能验证和作物性状遗传改良的有效工具。近年来基于CRISPR/cas系统的基因组编辑技术成为SSNs又一强有力的工具,该技术发展迅速并得到广泛应用,已经改变了作物生物技术研究现状。该系统通过合成单一引导的RNA(sgRNA)来指导cas9核酸酶去剪切靶标DNA序列,完成基因组的定点编辑。与以前的SSNs相比,CRISPR技术更加简单实用,而且花费相对更低。为了更好地利用该技术在作物中开展相关的研究,本综述中我们详细介绍了CRISPR/cas系统的基本结构特征和分子作用机制,总结和探讨了该技术在农作物基因组研究中的应用,并对基因组编辑技术在农业基因工程上的应用进行了展望。

关键词： CRISPR/cas系统 cas9蛋白 sgRNA 农作物