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小鼠ctsk敲降重组腺相关病毒的构建及其功能研究

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安徽医科大学学报 2024年第6期59卷 1001-1005页

作者：何静禚鑫喆邹欣雨王梦凡王秀云安徽医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室合肥230032

目的构建小鼠组织蛋白酶K(ctsk)基因的敲降重组腺相关病毒(AAV-shctsk),检测AAV-shctsk在小鼠体内的敲降效率,及其对脂肪组织脂质储存的影响。方法设计阴性对照组(NC)及ctsk的shRNA引物,退火后插入到骨架载体中,挑选克隆并测序鉴定,重... 详细信息

目的构建小鼠组织蛋白酶K(ctsk)基因的敲降重组腺相关病毒(AAV-shctsk),检测AAV-shctsk在小鼠体内的敲降效率,及其对脂肪组织脂质储存的影响。方法设计阴性对照组(NC)及ctsk的shRNA引物,退火后插入到骨架载体中,挑选克隆并测序鉴定,重组质粒经纯化后,利用转染试剂PEI将构建好的腺相关病毒载体、包装质粒和辅助质粒共转染到293T细胞中,进行腺相关病毒包装与扩增,得到AAV-shNC以及AAV-shctsk。利用脂肪组织原位注射将AAV病毒注射入小鼠附睾脂肪组织,2周后免疫印迹实验检测小鼠脂肪组织中ctsk蛋白的表达量及HE染色检测脂肪组织中脂滴大小。结果成功获得AAV-shNC以及AAV-shctsk腺相关病毒。原位注射AAV-shctsk的小鼠脂肪组织中ctsk成功敲降,脂肪组织中白色脂肪细胞显著变小。结论小鼠ctsk的敲降腺相关病毒构建成功,脂肪组织ctsk敲降引起脂肪组织中脂质含量减少。

关键词： ctsk 腺相关病毒脂肪组织原位注射

龟板联合阿伦磷酸钠对激素性骨质疏松大鼠腰椎Runx2、ctsk表达的影响

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中华中医药杂志 2017年第5期32卷 2181-2185页

作者：沈耿杨任辉张志达丘婷招文华余翔梁德姚珍松杨志东江晓兵广州中医药大学广州510405 广州中医药大学第一附属医院广州510405

目的:观察龟板联合阿伦磷酸钠(ALN)对激素性骨质疏松(GIOP)大鼠腰椎Runx2、ctsk表达的影响。方法:40只3月龄雌性SD大鼠随机分为4组:空白组、模型组、ALN组、龟板联合ALN组(联合组)。模型组、ALN组及联合组皮下注射地塞米松造模,成功后... 详细信息

目的:观察龟板联合阿伦磷酸钠(ALN)对激素性骨质疏松(GIOP)大鼠腰椎Runx2、ctsk表达的影响。方法:40只3月龄雌性SD大鼠随机分为4组:空白组、模型组、ALN组、龟板联合ALN组(联合组)。模型组、ALN组及联合组皮下注射地塞米松造模,成功后分别用0.9%氯化钠溶液、ALN和龟板联合ALN进行灌胃。12周后取大鼠腰椎进行:micro-CT检测腰椎骨微细结构、HE染色观察骨组织形态学,qPCR及Western blot分别检测腰椎Runx2、ctsk mRNA和蛋白表达。结果:与空白组比较,模型组Tb.N、***明显下降(Pctsk mRNA和蛋白表达明显升高(Pctsk mRNA和蛋白表达明显下调(Pctsk的表达密切相关。

关键词：激素性骨质疏松龟板阿伦磷酸钠协同作用 ctsk Runx2

蓉黄颗粒治疗非透析CKD-MBD肾虚湿热证患者的临床观察及其对血清OC、ctsk的影响

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蓉黄颗粒治疗非透析CKD-MBD肾虚湿热证患者的临床观察及其对血清O...

作者：胡军安徽中医药大学

学位级别：硕士

目的:通过观察蓉黄颗粒针对非透析CKD-MBD肾虚湿热证患者的临床疗效及其对血清中OC、ctsk的干预作用,评价验证蓉黄颗粒治疗此类型患者的显著优势和安全性,探明蓉黄颗粒调控CKD-MBD患者骨代谢的潜在作用靶点和机制,为蓉黄颗粒的理论研究... 详细信息

目的:通过观察蓉黄颗粒针对非透析CKD-MBD肾虚湿热证患者的临床疗效及其对血清中OC、ctsk的干预作用,评价验证蓉黄颗粒治疗此类型患者的显著优势和安全性,探明蓉黄颗粒调控CKD-MBD患者骨代谢的潜在作用靶点和机制,为蓉黄颗粒的理论研究和临床规范化应用提供确切证据。方法:自安徽省中医院肾内科CKD3a-5期且未透析患者中,选取出70例符合标准的CKD-MBD患者加入临床试验,按随机原则将其划分为对照组(35例)和观察组(35例);同时随机选取20例GFR正常的志愿者作为正常组。对照组给予CKD饮食、控制血压、纠正贫血、调节血清Ca、P、iPTH代谢异常以及中药保留灌肠等常规治疗,观察组在上述方案基础上联合蓉黄颗粒冲服,设定4周为一疗程,共观察3个疗程。动态观察两组患者治疗前后的中医证候积分、肾功能(Scr、e GFR、BUN)以及血清Ca、P、iPTH、OC、ctsk的变化情况,记录不良事件的发生情况;正常组仅检测血清OC、ctsk水平。临床试验结果通过SPSS 26.0软件进行检验分析。结果:1.疾病疗效比较:观察组治疗后的CKD-MBD疗效、中医证候疗效均显著优于对照组(P0.05)。和治疗前相比,对照组第一疗程、第二疗程、第三疗程的中医证候积分均无明显变化(P>0.05);而观察组每个疗程的中医证候积分均较治疗前显著下降(P0.05)。和治疗前相比,对照组第一疗程的血清Scr、e GFR、BUN均无明显变化(P>0.05),而第二疗程、第三疗程的肾功能各项指标均较治疗前显著改善(P0.05),而血清BUN显著优于对照组(P0.05)。和治疗前相比,对照组第一疗程的血清Ca、P均显著改善(P0.05);对照组第二疗程、第三疗程的各项指标均较治疗前显著改善(P0.05);观察组第二疗程、第三疗程的各项指标均显著优于对照组(Pctsk变化比较:治疗前两组患者的血清OC、ctsk比较均无明显差异(P>0.05);但和正常组相比,两组患者的血清OC、ctsk均显著上升(Pctsk均较治疗前显著下降(Pctsk均显著优于对照组(Pctsk的代谢水平紧密相关。

关键词： CKD-MBD 蓉黄颗粒肾虚湿热证中医证候积分肾功能 OC ctsk

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汉防己甲素诱导自噬抑制破骨细胞的分化

中国组织工程研究 2023年第28期27卷 4473-4479页

作者：张博文李美张晋宁杨天翔程萌旗陈德胜宁夏医科大学临床医学院宁夏回族自治区银川市7500042 宁夏医科大学少数民族医药现代化教育部重点实验室宁夏回族自治区银川市750004 上海交通大学附属第六人民医院关节外科上海市200233 宁夏回族自治区人民医院骨科宁夏回族自治区银川市750004

背景:已有研究表明汉防己甲素可以通过激活AMPK信号通路诱导细胞自噬从而抑制肿瘤细胞增殖,但目前汉防己甲素诱导破骨细胞自噬和分化的相关研究甚少。目的:探究汉防己甲素在不同浓度下对破骨细胞分化和自噬的影响,并分析诱导破骨细胞自... 详细信息

背景:已有研究表明汉防己甲素可以通过激活AMPK信号通路诱导细胞自噬从而抑制肿瘤细胞增殖,但目前汉防己甲素诱导破骨细胞自噬和分化的相关研究甚少。目的:探究汉防己甲素在不同浓度下对破骨细胞分化和自噬的影响,并分析诱导破骨细胞自噬能否起到抑制其分化的作用。方法:(1)第一部分:使用重组小鼠巨噬细胞集落刺激因子和核因子κB受体活化因子配体两种细胞因子对小鼠RAW264.7巨噬细胞进行诱导,使其向破骨细胞转化。细胞诱导及药物干预分组如下:空白对照组(完全培养基),阳性对照组(含两种细胞因子),低、中、高剂量汉防己甲素干预组(阳性对照组分别添加0.1,0.5,1.0μmol/L汉防己甲素)。抗酒石酸酸性磷酸酶染色法观察成熟破骨细胞数量变化;Western blot法检测组织蛋白酶K(ctsk)、自噬微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)和自噬底物泛素结合蛋白(p62)的蛋白相对表达量;RT-PCR检测ctsk、LC3-Ⅱ和p62的mRNA相对表达量;丹酰尸胺(MDC)染色观察诱导过程中破骨细胞中自噬小体的数量变化。(2)第二部分:选取抑制破骨细分化效果最明显的汉防己甲素浓度(1.0μmol/L)进行回复性验证。各组处理如下:阳性对照组(含两种细胞因子),自噬抑制剂组(巴佛洛霉素处理),药物干预组(汉防己甲素干预),药物干预+自噬抑制剂组。抗酒石酸酸性磷酸酶染色法观察成熟破骨细胞数量变化;Western blot法检测ctsk的蛋白相对表达量。结果与结论:(1)一定浓度汉防己甲素能够对破骨细胞的分化起抑制作用,并且抑制作用随药物浓度升高而提升;(2)汉防己甲素在一定浓度下能够激发破骨细胞分化过程中自噬标志物的表达及减少自噬特异性底物累积,并在破骨细胞分化过程中可刺激自噬小体形成;(3)使用自噬抑制剂后,汉防己甲素抑制破骨细胞分化的作用受到显著影响;(4)综上,一定浓度的汉防己甲素能够通过激活自噬抑制破骨细胞的分化。

关键词：汉防己甲素破骨细胞自噬骨溶解微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ ctsk

骨巨细胞瘤单细胞测序方法的建立及数据分析初步探索

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骨巨细胞瘤单细胞测序方法的建立及数据分析初步探索

作者：刘新月天津医科大学

学位级别：硕士

目的骨巨细胞瘤作为亚洲人群多发的一种骨肿瘤,其对骨组织破坏能力强、致侵袭能力强、易复发、残率高且具有一定的转移性,寻找其骨侵蚀破坏的机制及新的治疗靶点成为该肿瘤的研究重点。目前关于骨巨细胞瘤的研究多为临床方面对术式的探... 详细信息

目的骨巨细胞瘤作为亚洲人群多发的一种骨肿瘤,其对骨组织破坏能力强、致侵袭能力强、易复发、残率高且具有一定的转移性,寻找其骨侵蚀破坏的机制及新的治疗靶点成为该肿瘤的研究重点。目前关于骨巨细胞瘤的研究多为临床方面对术式的探索或病例回顾性研究,基础研究方面也多集中于破骨细胞的RNAK信号通路等,因此本研究将重点关注于剖析骨巨细胞瘤肿瘤组织细胞构成以实现对组织内细胞间异质性的分析,结合基因测序技术实现对肿瘤组织中造成骨侵蚀的多核破骨细胞样巨细胞与破骨细胞的分离,并对两者的差异表达基因进行生物学分析,探索对骨巨细胞瘤诊断治疗、预后评估及侵袭转移有重要影响的基因及其机制。方法本研究采用的测序方法为单细胞转录组测序技术,作为在二代测序技术上发展起来的新一代测序技术,单细胞测序可以实现组织内不同细胞单独分离、单独测序、单独建库的目标,同时也提高了基因表达水平测序的精确度,弥补了传统转录组测序方法中信号呈均值、易忽略少数细胞的不足之处,真正达到了在单个细胞水平上解析瘤内细胞异质性,为肿瘤的发生发展机制研究和诊疗方面开辟了新方向,提供了新思路。本研究将骨巨细胞瘤组织通过组织处理-组织解离-过滤检测的步骤将肿瘤组织处理至数量与活性均合格的细胞悬液并进行测序建库,对数据进行标准化过滤、线性转化、降维等处理,进行细胞聚类分析,将所有细胞按基因表达分类为12个细胞群。由于目前并没有关于单细胞测序技术在定义细胞类型上的明确方法,因此本研究在查询多个数据库及相关资料后,首次使用了在定义每个细胞群类型时,调取细胞差异表达基因并一一查询基因信息,同时通过采集数据库中细胞标记基因再对照本数据的查询定义方法,将12个不同细胞群分别进行定义命名,两种方向互相验证共同作用提高了严谨性及准确度,并填补了骨巨细胞瘤单细胞测序技术在定义细胞方法上的空白。在确定破骨细胞样巨细胞群和破骨细胞群后,本研究提取了这两个细胞群相比于其他细胞群中高表达的差异表达基因,并对这些基因进行GO基因注释(分子功能+生物学功能)查询,寻找破骨细胞样巨细胞的过度骨吸收特性有关的重要基因。结果通过单细胞测序技术和生物学分析技术将肿瘤组织内细胞分群聚类后,确定了本研究所选取的骨巨细胞瘤中具有的细胞类型包括:NKT细胞、成骨细胞、浆细胞、B细胞、巨细胞、巨噬细胞、T细胞、基质细胞、单核细胞、破骨细胞、少量肌细胞、破骨细胞前体细胞、血管内皮细胞和成纤维细胞。在确定细胞类型后,提取了破骨细胞样巨细胞和破骨细胞群相比于其他细胞群中高表达的差异表达基因各50个,通过韦恩图比对发现两细胞群的差异表达基因中重合部分超过半数(27个),对这些功能同表达基因进行热图展示分析后,发现破骨细胞表达较高的基因包括CA2、ATP6V1E1、CKB、SPP1、ATP6V1C1、ATP6V1G1、GLRX、CSTB、ATP6V0E1、MATK、RAC2、SLC9B2、ATP6V1B2、CHCHD10、TCIRG1、ATP6V1H、ATP6V1F、RALA、ACP5、CTSD、CD68,而相比之下,共同基因中(50),巨细胞表达较高的基因包括TKT、SNX10、MMP9、CD84、RGS10、ctsk。对每个基因进行GO基因注释及查询后发现,在破骨细胞表达较高的基因中,基因SPP1除了正性调控骨吸收外,还参与了成骨细胞分化和骨化的过程,这是维持骨组织中成骨沉积-骨吸收稳态的重要环节,而巨细胞内SPP1的表达却较低。基因MATK参与了Erb B2(HER2基因)信号通路,而在研究中报道过骨肿瘤中的基因Erb B2的过表达伴有患者肺转移,也标志了较差的预后。在巨细胞表达较高的基因中,基因ctsk参与了负调控膜内骨化、骨吸收和软骨发育的生物学过程,这些功能可能是造成巨细胞骨破坏的机制,在研究中也报道过AKT/NFATc1/ctsk轴在颅骨发育过程中促进破骨细胞生成和骨吸收,而在骨巨细胞瘤中ctsk对于破骨细胞和骨吸收的机制并没有阐明。另一巨细胞表达较高的基因为基因SNX10,其生物学功能包括调节骨矿化、破骨细胞分化、骨吸收等与破骨细胞类功能,而且有研究显示基因SNX10参与破骨细胞激活,SNX10突变将造成破骨细胞功能障碍,进而影响骨质硬化,但基因SNX10在骨巨细胞瘤中对破骨细胞的作用机制并没有相应研究阐述。结论本研究通过对单细胞技术实验方法、数据的处理分析,定义细胞方法的探索和掌握,达到了对骨巨细胞瘤单个细胞层面和基因层面的剖析,分析定义了该肿瘤的所含细胞类型并初步确定了四个最可能造成肿瘤骨侵蚀特性的基因SPP1、MATK、ctsk和SNX10,弥补了当前骨巨细胞瘤研究领域的缺陷。

关键词：骨巨细胞瘤单细胞测序破骨细胞样巨细胞 SPP1 MATK ctsk SNX10

IL-17和牙周膜成纤维细胞对体外诱导破骨样细胞生成的影响

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IL-17和牙周膜成纤维细胞对体外诱导破骨样细胞生成的影响

作者：吴凯广西医科大学

学位级别：硕士

目的:牙根吸收是正畸治疗过程中常见的并发症,而IL-17和牙周膜成纤维细胞可能通过诱导牙周膜微环境中的破骨细胞前体生成具有骨吸收功能的破骨细胞从而引发牙根吸收。本实验拟探讨IL-17作用的牙周膜成纤维细胞和RANKL对人外周血单核细... 详细信息

目的:牙根吸收是正畸治疗过程中常见的并发症,而IL-17和牙周膜成纤维细胞可能通过诱导牙周膜微环境中的破骨细胞前体生成具有骨吸收功能的破骨细胞从而引发牙根吸收。本实验拟探讨IL-17作用的牙周膜成纤维细胞和RANKL对人外周血单核细胞生物学行为的影响,检测不同浓度IL-17刺激下的牙周膜成纤维细胞条件培养液和RANKL不同时间作用下,PBMC中ctsk、MMP-9和CAⅡmRNA表达的影响,以及共培养体系下,观察破骨样细胞的形态与特征标记物,探讨IL-17和牙周膜成纤维细胞在正畸牙根吸收中可能的作用及其作用机制。方法:1.采用密度梯度离心法法培养人外周血单核细胞,接种于48孔板,倒置显微镜观察细胞生长状态,采用组织块培养法培养牙周膜组织,建立HPDLF和PBMC间接共培养体系;2.取第4-6代生长良好的HPDLF,分别加入己经配制的含IL-17浓度为0或20ng/ml的DMEM培养基作用42h,换用含10%FBS的DMEM培养基作用12小时,收集HPDLF细胞上清液,加入50ng/ml的RANKL,作为条件培养液;3.以不同HPDLF条件培养液分别作用于PBMC 3天,5天,7天,10天,采用RT-qPCR法检测外周血单核细胞诱导生成破骨样细胞ctsk、MMP-9、CAⅡImRNA的表达水平;4.不同条件培养液作用于外周血单核细胞后,间接共培养诱导破骨样细胞生成14d,鬼笔环肽染色观察和计数破骨样细胞的细胞骨架中纤维肌动蛋白环的形态、数目。结果:1.所培养外周血单核细胞为圆形,疏松贴壁生长,作为破骨细胞前体细胞。牙周膜成纤维细胞为长梭形,呈放射状或漩涡状生长,生长状态稳定。2.经RT-qPCR检测,在共培养体系下,与对照组相比,IL-17(+)条件培养液和RANKL作用于PBMC后,可上调ctsk、MMP-9、CAⅡmRNA的表达,其中,以IL-17(+)、RANKL(+)组和10d组的表达变化量最明显,组间差别有统计学意义(Pctsk、MMP-9、CAⅡmRNA的破骨样细胞。***-17作用的牙周膜成纤维细胞条件培养液和RANKL能促进PBMC对ctsk、MMP-9、CAⅡmRNA的表达。3.在与人牙周膜成纤维细胞直接共培养的前提下,人外周血单个核细胞可分化为具有纤维肌动蛋白环形态的破骨样细胞。***-17和人牙周膜成纤维细胞在体外能够诱导破骨细胞前体生成破骨样细胞,可能的机制是通过牙周膜微环境中的人牙周膜成纤维细胞表达RANKL介导破骨细胞分化与成熟。

关键词：白介素-17 人牙周膜成纤维细胞 ctsk MMP-9 破骨样细胞

龟鹿二仙胶及其拆方对体外培养破骨细胞骨吸收功能的影响

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龟鹿二仙胶及其拆方对体外培养破骨细胞骨吸收功能的影响

作者：杨树华福建中医药大学

学位级别：硕士

目的：观察龟鹿二仙胶对体外培养破骨细胞骨吸收功能的影响,并按君臣配伍原则,拆分为龟鹿组、龟鹿参组及龟鹿杞组,实施荧光定量PCR检测其对TRAP、CTR、ctsk基因表达的影响,比较龟鹿二仙胶及其拆方含药血清干预体外培养破骨细胞骨吸收功... 详细信息

目的：观察龟鹿二仙胶对体外培养破骨细胞骨吸收功能的影响,并按君臣配伍原则,拆分为龟鹿组、龟鹿参组及龟鹿杞组,实施荧光定量PCR检测其对TRAP、CTR、ctsk基因表达的影响,比较龟鹿二仙胶及其拆方含药血清干预体外培养破骨细胞骨吸收功能的差异,进一步探讨龟鹿二仙胶治疗骨质疏松症的作用机制及其君臣配伍的科学意义。方法：1.龟鹿二仙胶及其拆方含药血清的制备。2. RAW264.7细胞系诱导形成破骨细胞。3.各组含药血清干预体外培养破骨细胞。4. RTF-QPCR检测鹿二仙胶及其拆方含药血清干预后体外培养破骨细胞TRAP、CTR、ctsk基因表达结果。结果：对TRAP基因表达检测结果为：龟鹿二仙胶组ctsk基因表达检测结果为：龟鹿二仙胶组龟鹿杞组>龟鹿参组>生理盐水组;与生理盐水对照组比较：各实验组皆有显著差异(Pctsk基因表达,龟鹿二仙胶组最优。各实验组能够不同程度提高体外培养破骨细胞CTR基因的表达,龟鹿二仙胶组最优。龟鹿二仙胶及其拆方含药血清可通过抑制体外培养破骨细胞TRAP和ctsk基因的表达,提高CTR基因的表达,来抑制破骨细胞的骨吸收作用,这可能是其治疗骨质疏松症的机制,龟鹿二仙胶全方的效果最优。

关键词：龟鹿二仙胶骨质疏松破骨细胞 TRAP ctsk CTR

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FOXF2调控乳腺癌骨转移的机制

FOXF2调控乳腺癌骨转移的机制

作者：李贵喜天津医科大学

学位级别：硕士

研究背景骨是乳腺癌常见的远处转移器官,乳腺癌骨转移主要导致溶骨性病变,严重影响患者生存质量和生存期。阐明乳腺癌溶骨性骨转移的分子机制,有助于开发早期预测骨转移和有效治疗骨转移的诊断和治疗方法。课题组前期研究证实转录因子... 详细信息

研究背景骨是乳腺癌常见的远处转移器官,乳腺癌骨转移主要导致溶骨性病变,严重影响患者生存质量和生存期。阐明乳腺癌溶骨性骨转移的分子机制,有助于开发早期预测骨转移和有效治疗骨转移的诊断和治疗方法。课题组前期研究证实转录因子叉头框F2（Forkhead box F2,FOXF2）具有促进乳腺癌骨转移的作用。为了研究FOXF2调控乳腺癌骨转移的分子机制,通过乳腺癌组织基因表达谱数据的相关性分析,发现FOXF2与一组骨重塑相关基因呈相关性表达,其中包括组织蛋白酶K（Cathepsin K,ctsk）和尿激酶型纤溶酶原激活物（Urokinase-Type Plasminogen Activator,u PA或PLAU）。进一步通过FOXF2结合序列分析,发现ctsk和PLAU启动子区存在多个FOXF2的转录结合域,提示ctsk和PLAU是潜在的FOXF2转录调控靶基因。基于文献报道ctsk和PLAU具有促进乳腺癌溶骨性骨转移的作用,推测FOXF2可能通过转录调控ctsk和PLAU促进乳腺癌溶骨性骨转移。研究目的本研究旨在确定FOXF2对ctsk和PLAU的转录调控作用,以及ctsk和PLAU对FOXF2调控乳腺癌溶骨性骨转移的介导作用。研究方法1.通过公共数据库（GEO:***/geo/info,Accession Number:GSE11121和GSE20685）分析在不同亚型乳腺癌中FOXF2 m RNA与ctsk m RNA和PLAU m RNA表达水平的相关性。2.通过染色质免疫共沉淀（Chromatin immunoprecipitation,Ch IP）确定在乳腺癌细胞MDA-MB-231中FOXF2与ctsk和PLAU启动子中潜在结合位点的结合;通过双荧光素酶报告系统证实FOXF2对ctsk和PLAU启动子活性的调节作用;通过Western blot检测过表达或沉默表达FOXF2后,乳腺癌细胞系MCF-7、T47-D和MDA-MB-231中ctsk和PLAU的m RNA和蛋白水平的变化,证实乳腺癌细胞中FOXF2对ctsk和PLAU的调节作用。3.在MDA-MB-231中过表达FOXF2后沉默表达ctsk或PLAU和沉默表达FOXF2后过表达ctsk或PLAU,分析FOXF2在乳腺癌细胞中的表达对诱导成熟的MC3T3-E1模拟的骨微环境的趋化迁移能力、粘附能力、骨基质降解能力的调控作用,以及诱导小鼠破骨前体细胞分化成熟能力的调控作用。4.通过公共数据库（GEO:***/geo/info,Accession Number:GSE14020）分析乳腺癌病理骨转移癌和非骨转移癌中ctsk和PLAU表达量的差异,以及ctsk和PLAU表达水平对发生单纯骨转移预后的影响。结果1.不同亚型乳腺癌（Luminal-like、Basal-like、Erbb2-Enrich）中FOXF2 m RNA与ctsk m RNA和PLAU m RNA表达水平成正相关性。2.通过Ch IP发现,在ctsk启动子上?586/?579和–732/–725位置存在两个FOXF2结合位点,在PLAU启动子上?1082/?1075、?1109/?1102和?1784/?1777位置存在三个FOXF2结合位点;在MDA-MB-231细胞中沉默FOXF2表达,ctsk和PLAU启动子活性降低,在MCF-7细胞中过表达FOXF2,ctsk和PLAU启动子活性增强。3.在MDA-MB-231细胞中沉默FOXF2表达,ctsk和PLAU蛋白表达水平降低;在MCF-7细胞和T47-D细胞中过表达FOXF2,ctsk和PLAU蛋白水平没有变化。4.沉默FOXF2表达,MDA-MB-231细胞向经诱导成熟的成骨细胞MC-3T3E1模拟的骨微环趋化迁移能力增强,向肺上皮细胞BEAS-2B模拟的肺微环境趋化迁移趋化能力减弱;过表达FOXF2后沉默ctsk或PLAU表达,MDA-MB-231细胞向经诱导成熟的成骨细胞MC-3T3E1模拟的骨微环趋化迁移能力减弱,向肺上皮细胞BEAS-2B模拟肺微环境的趋化迁移趋化能力没有明显改变。5.沉默FOXF2表达,MDA-MB-231细胞对成骨细胞和骨基质蛋白的粘附能力减弱,沉默FOXF2表达后过表达ctsk,MDA-MB-231细胞对成骨细胞和骨基质蛋白的粘附能力没用明显改变;沉默FOXF2表达后过表达PLAU,MDA-MB-231细胞对成骨细胞和骨基质蛋白的粘附增强;过表达FOXF2,MDA-MB-231细胞对成骨细胞和骨基质蛋白的粘附能力增强;过表达FOXF2后沉默ctsk表达,MDA-MB-231细胞对成骨细胞和骨基质蛋白的粘附没有明显变化;过表达FOXF2后沉默PLA

关键词： FOXF2 ctsk PLAU 骨转移乳腺癌

Coronin 3在胃癌侵袭和转移中的作用及相关分子机制研究

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Coronin 3在胃癌侵袭和转移中的作用及相关分子机制研究

作者：田启飞第四军医大学

学位级别：硕士

【背景】胃癌的发病率居世界第四位，死亡率居世界第二位。在我国，胃癌严重影响着人类健康，绝大多数患者在就诊时已处于晚期胃癌且发生转移。转移是实体瘤最终造成患者死亡的关键因素。随着分子生物学的发展，越来越多的研究致力于... 详细信息

【背景】胃癌的发病率居世界第四位，死亡率居世界第二位。在我国，胃癌严重影响着人类健康，绝大多数患者在就诊时已处于晚期胃癌且发生转移。转移是实体瘤最终造成患者死亡的关键因素。随着分子生物学的发展，越来越多的研究致力于找出肿瘤转移中的关键分子，并试图干预这些分子遏制肿瘤的转移。Coronin3属于短冠蛋白，广泛存在于真核生物中。Coronin3作为F-actin结合和相互作用蛋白，参与并调节肌动蛋白依赖的多种生物学进程，如细胞运动、迁移、吞噬体的形成、胞质分离和轴突的生长等。除此之外，在囊泡的运输中也有重要作用。近年来的研究发现Coronin3除具有冠蛋白共有的生理功能外，还参与多种恶性肿瘤的进展和转移。研究显示Coronin3的表达水平与人弥散型神经胶质瘤的恶性程度相关，下调Coronin3的表达可以显著抑制肿瘤的增殖、迁移、侵袭;研究还发现Coronin3可作为肝细胞癌和黑色素瘤进展的标志物。本研究发现Coronin3在多种胃癌细胞系中表达升高，尤其是在我科建立的高转移细胞系MKN28-M中表达较低转移细胞系MKN28-NM及亲本细胞系MKN28明显增高。通过体外功能学实验和体内实验我们发现Coronin3可以促进胃癌细胞的迁移，因此我们推断Coronin3可能在胃癌的转移中发挥重要作用。【目的】 1、研究Coronin3在胃癌淋巴结转移灶和原发灶中的表达情况;检测Coronin3在胃癌细胞系，尤其是胃癌高转移细胞系中的表达情况;2、研究Coronin3在胃癌侵袭和转移等恶性生物学行为中的作用;3、进一步研究Coronin3促进胃癌侵袭和转移的分子机制。【方法】 1、Western Blot和qPCR检测多种胃癌细胞系中Coronin3的表达;2、免疫组织化学观察Coronin3在胃癌淋巴结转移灶和原发灶中的表达，共聚焦显微镜观察Coronin3在胃癌细胞中的亚细胞定位;3、设计Coronin3的shRNA序列并包装慢病毒载体，对高表达Coronin3的胃癌细胞系进行感染，建立稳定细胞系;4、流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期的变化，MTT实验检测细胞增殖能力的改变，平板集落形成实验检测细胞克隆形成能力;5、利用划痕实验、Transwell侵袭实验及裸鼠尾静脉注射体内肝肺脏转移等实验研究Coronin3对胃癌迁移、侵袭以及体内转移能力的影响;6、利用肿瘤转移PCR芯片技术检测下调Coronin3后转移相关基因的表达变化;7、利用qPCR和Western Blot方法验证肿瘤转移PCR芯片结果，寻找Coronin3促进胃癌转移的下游分子。【结果】 1、 Coronin3在高转移潜能的胃癌细胞及胃癌淋巴结转移灶中表达上调。利用免疫组织化学检测40例胃癌原发灶和对应的淋巴结转移灶中Coronin3的表达，发现Coronin3在原发灶胃癌中阳性率为53.8％（21/39）,而在转移灶中达85％（34/40）。在胃癌淋巴结转移灶中的表达显著高于原发灶。另外，在胃癌高转移细胞系MKN28-M中，Coronin3的表达显著高于胃癌低转移细胞系MKN28-NM和亲本细胞MKN28。 2、下调Coronin3可抑制胃癌细胞的体外迁移、侵袭能力和裸鼠体内肝转移能力。通过构建Coronin3shRNA慢病毒载体，感染细胞后，成功建立了两株稳转细胞系SGC7901-Coronin3-shRNA和MKN45-Coronin3-shRNA。同时用阴性对照慢病毒载体NC-GFP-LV感染细胞后，获得两株对照细胞系SGC7901-NC和MKN45-NC。感染效率均达到90％以上。Western blot和qPCR验证结果显示Coronin3的表达明显被抑制。划痕实验结果显示细胞划痕后的愈合率分别为：MKN45-Coronin3-shRNA（15.5%）、MKN45-NC（54.2%）、MKN45(50.3%);Transwell侵袭实验显示下调Coronin3的表达后，SGC7901-Coronin3-shRNA和MKN45-Coronin3-shRNA侵袭能力明显下降。裸鼠体内转移瘤实验发现，下调Coronin3后，肝转移灶明显减少。上述结果提示，胃癌细胞中的Coronin3的高表达可能通过促进胃癌细胞的迁移和侵袭，进而促进了胃癌的转移。 3、 Coronin3通过调节MMP-9和cathepsin K促进胃癌转移。利用肿瘤转移PCR芯片技术检测MKN45-Coronin3-shRNA、MKN45-NC中84个转移相关基因的表达差异。结果显示下调Coronin3表达，相对差异大于两倍的基因有11个，其中9个基因（CDH11、CDH6、ctsk、CXCR2、ITGA7、MMP-9、SMAD4、TIMP3、VEGFA）表达下调;两个基因（CTS

关键词：胃癌转移 Coronin3 MMP-9 ctsk TIMP2