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小鼠ctsk敲降重组腺相关病毒的构建及其功能研究

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安徽医科大学学报 2024年第6期59卷 1001-1005页

作者：何静禚鑫喆邹欣雨王梦凡王秀云安徽医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室合肥230032

目的构建小鼠组织蛋白酶K(ctsk)基因的敲降重组腺相关病毒(AAV-shctsk),检测AAV-shctsk在小鼠体内的敲降效率,及其对脂肪组织脂质储存的影响。方法设计阴性对照组(NC)及ctsk的shRNA引物,退火后插入到骨架载体中,挑选克隆并测序鉴定,重... 详细信息

目的构建小鼠组织蛋白酶K(ctsk)基因的敲降重组腺相关病毒(AAV-shctsk),检测AAV-shctsk在小鼠体内的敲降效率,及其对脂肪组织脂质储存的影响。方法设计阴性对照组(NC)及ctsk的shRNA引物,退火后插入到骨架载体中,挑选克隆并测序鉴定,重组质粒经纯化后,利用转染试剂PEI将构建好的腺相关病毒载体、包装质粒和辅助质粒共转染到293T细胞中,进行腺相关病毒包装与扩增,得到AAV-shNC以及AAV-shctsk。利用脂肪组织原位注射将AAV病毒注射入小鼠附睾脂肪组织,2周后免疫印迹实验检测小鼠脂肪组织中ctsk蛋白的表达量及HE染色检测脂肪组织中脂滴大小。结果成功获得AAV-shNC以及AAV-shctsk腺相关病毒。原位注射AAV-shctsk的小鼠脂肪组织中ctsk成功敲降,脂肪组织中白色脂肪细胞显著变小。结论小鼠ctsk的敲降腺相关病毒构建成功,脂肪组织ctsk敲降引起脂肪组织中脂质含量减少。

关键词： ctsk 腺相关病毒脂肪组织原位注射

蓉黄颗粒治疗非透析CKD-MBD肾虚湿热证患者的临床观察及其对血清OC、ctsk的影响

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蓉黄颗粒治疗非透析CKD-MBD肾虚湿热证患者的临床观察及其对血清O...

作者：胡军安徽中医药大学

学位级别：硕士

目的:通过观察蓉黄颗粒针对非透析CKD-MBD肾虚湿热证患者的临床疗效及其对血清中OC、ctsk的干预作用,评价验证蓉黄颗粒治疗此类型患者的显著优势和安全性,探明蓉黄颗粒调控CKD-MBD患者骨代谢的潜在作用靶点和机制,为蓉黄颗粒的理论研究... 详细信息

目的:通过观察蓉黄颗粒针对非透析CKD-MBD肾虚湿热证患者的临床疗效及其对血清中OC、ctsk的干预作用,评价验证蓉黄颗粒治疗此类型患者的显著优势和安全性,探明蓉黄颗粒调控CKD-MBD患者骨代谢的潜在作用靶点和机制,为蓉黄颗粒的理论研究和临床规范化应用提供确切证据。方法:自安徽省中医院肾内科CKD3a-5期且未透析患者中,选取出70例符合标准的CKD-MBD患者加入临床试验,按随机原则将其划分为对照组(35例)和观察组(35例);同时随机选取20例GFR正常的志愿者作为正常组。对照组给予CKD饮食、控制血压、纠正贫血、调节血清Ca、P、iPTH代谢异常以及中药保留灌肠等常规治疗,观察组在上述方案基础上联合蓉黄颗粒冲服,设定4周为一疗程,共观察3个疗程。动态观察两组患者治疗前后的中医证候积分、肾功能(Scr、e GFR、BUN)以及血清Ca、P、iPTH、OC、ctsk的变化情况,记录不良事件的发生情况;正常组仅检测血清OC、ctsk水平。临床试验结果通过SPSS 26.0软件进行检验分析。结果:1.疾病疗效比较:观察组治疗后的CKD-MBD疗效、中医证候疗效均显著优于对照组(P0.05)。和治疗前相比,对照组第一疗程、第二疗程、第三疗程的中医证候积分均无明显变化(P>0.05);而观察组每个疗程的中医证候积分均较治疗前显著下降(P0.05)。和治疗前相比,对照组第一疗程的血清Scr、e GFR、BUN均无明显变化(P>0.05),而第二疗程、第三疗程的肾功能各项指标均较治疗前显著改善(P0.05),而血清BUN显著优于对照组(P0.05)。和治疗前相比,对照组第一疗程的血清Ca、P均显著改善(P0.05);对照组第二疗程、第三疗程的各项指标均较治疗前显著改善(P0.05);观察组第二疗程、第三疗程的各项指标均显著优于对照组(Pctsk变化比较:治疗前两组患者的血清OC、ctsk比较均无明显差异(P>0.05);但和正常组相比,两组患者的血清OC、ctsk均显著上升(Pctsk均较治疗前显著下降(Pctsk均显著优于对照组(Pctsk的代谢水平紧密相关。

关键词： CKD-MBD 蓉黄颗粒肾虚湿热证中医证候积分肾功能 OC ctsk

龟板联合阿伦磷酸钠对激素性骨质疏松大鼠腰椎Runx2、ctsk表达的影响

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中华中医药杂志 2017年第5期32卷 2181-2185页

作者：沈耿杨任辉张志达丘婷招文华余翔梁德姚珍松杨志东江晓兵广州中医药大学广州510405 广州中医药大学第一附属医院广州510405

目的:观察龟板联合阿伦磷酸钠(ALN)对激素性骨质疏松(GIOP)大鼠腰椎Runx2、ctsk表达的影响。方法:40只3月龄雌性SD大鼠随机分为4组:空白组、模型组、ALN组、龟板联合ALN组(联合组)。模型组、ALN组及联合组皮下注射地塞米松造模,成功后... 详细信息

目的:观察龟板联合阿伦磷酸钠(ALN)对激素性骨质疏松(GIOP)大鼠腰椎Runx2、ctsk表达的影响。方法:40只3月龄雌性SD大鼠随机分为4组:空白组、模型组、ALN组、龟板联合ALN组(联合组)。模型组、ALN组及联合组皮下注射地塞米松造模,成功后分别用0.9%氯化钠溶液、ALN和龟板联合ALN进行灌胃。12周后取大鼠腰椎进行:micro-CT检测腰椎骨微细结构、HE染色观察骨组织形态学,qPCR及Western blot分别检测腰椎Runx2、ctsk mRNA和蛋白表达。结果:与空白组比较,模型组Tb.N、***明显下降(Pctsk mRNA和蛋白表达明显升高(Pctsk mRNA和蛋白表达明显下调(Pctsk的表达密切相关。

关键词：激素性骨质疏松龟板阿伦磷酸钠协同作用 ctsk Runx2

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汉防己甲素诱导自噬抑制破骨细胞的分化

中国组织工程研究 2023年第28期27卷 4473-4479页

作者：张博文李美张晋宁杨天翔程萌旗陈德胜宁夏医科大学临床医学院宁夏回族自治区银川市7500042 宁夏医科大学少数民族医药现代化教育部重点实验室宁夏回族自治区银川市750004 上海交通大学附属第六人民医院关节外科上海市200233 宁夏回族自治区人民医院骨科宁夏回族自治区银川市750004

背景:已有研究表明汉防己甲素可以通过激活AMPK信号通路诱导细胞自噬从而抑制肿瘤细胞增殖,但目前汉防己甲素诱导破骨细胞自噬和分化的相关研究甚少。目的:探究汉防己甲素在不同浓度下对破骨细胞分化和自噬的影响,并分析诱导破骨细胞自... 详细信息

背景:已有研究表明汉防己甲素可以通过激活AMPK信号通路诱导细胞自噬从而抑制肿瘤细胞增殖,但目前汉防己甲素诱导破骨细胞自噬和分化的相关研究甚少。目的:探究汉防己甲素在不同浓度下对破骨细胞分化和自噬的影响,并分析诱导破骨细胞自噬能否起到抑制其分化的作用。方法:(1)第一部分:使用重组小鼠巨噬细胞集落刺激因子和核因子κB受体活化因子配体两种细胞因子对小鼠RAW264.7巨噬细胞进行诱导,使其向破骨细胞转化。细胞诱导及药物干预分组如下:空白对照组(完全培养基),阳性对照组(含两种细胞因子),低、中、高剂量汉防己甲素干预组(阳性对照组分别添加0.1,0.5,1.0μmol/L汉防己甲素)。抗酒石酸酸性磷酸酶染色法观察成熟破骨细胞数量变化;Western blot法检测组织蛋白酶K(ctsk)、自噬微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)和自噬底物泛素结合蛋白(p62)的蛋白相对表达量;RT-PCR检测ctsk、LC3-Ⅱ和p62的mRNA相对表达量;丹酰尸胺(MDC)染色观察诱导过程中破骨细胞中自噬小体的数量变化。(2)第二部分:选取抑制破骨细分化效果最明显的汉防己甲素浓度(1.0μmol/L)进行回复性验证。各组处理如下:阳性对照组(含两种细胞因子),自噬抑制剂组(巴佛洛霉素处理),药物干预组(汉防己甲素干预),药物干预+自噬抑制剂组。抗酒石酸酸性磷酸酶染色法观察成熟破骨细胞数量变化;Western blot法检测ctsk的蛋白相对表达量。结果与结论:(1)一定浓度汉防己甲素能够对破骨细胞的分化起抑制作用,并且抑制作用随药物浓度升高而提升;(2)汉防己甲素在一定浓度下能够激发破骨细胞分化过程中自噬标志物的表达及减少自噬特异性底物累积,并在破骨细胞分化过程中可刺激自噬小体形成;(3)使用自噬抑制剂后,汉防己甲素抑制破骨细胞分化的作用受到显著影响;(4)综上,一定浓度的汉防己甲素能够通过激活自噬抑制破骨细胞的分化。

关键词：汉防己甲素破骨细胞自噬骨溶解微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ ctsk

m6A甲基化酶METTL3在FSH促进绝经后骨质疏松发生中的作用及其机制研究

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m6A甲基化酶METTL3在FSH促进绝经后骨质疏松发生中的作用及其机制...

作者：范超广州医科大学

学位级别：硕士

研究背景骨质疏松症(Osteoporosis,OP)的患病率在过去30年中显著增加。由OP继发的骨折及相关并发症正在严重威胁老年人的健康和生活质量。随着人口老龄化的进一步加剧,OP的患病率也将继续增加,对社会经济和公共卫生造成巨大的负担和挑战... 详细信息

研究背景骨质疏松症(Osteoporosis,OP)的患病率在过去30年中显著增加。由OP继发的骨折及相关并发症正在严重威胁老年人的健康和生活质量。随着人口老龄化的进一步加剧,OP的患病率也将继续增加,对社会经济和公共卫生造成巨大的负担和挑战。OP在绝经后的妇女中尤为普遍。在女性围绝经期及绝经后,骨骼的含量与密度都出现了显著的下降。传统观念认为雌激素(17β-Estradiol,E2)的缺乏是导致绝经后骨质疏松(Postmenopausal osteoporosis,PMOP)发生的主要原因。但后来人们发现围绝经期间卵泡刺激素(Follicle stimulating hormone,FSH)水平显著升高,并且可以独立于E2影响骨代谢而导致骨质疏松。相关研究也已经证实,围绝经期和绝经后早期妇女的骨转换标记物和骨密度与血清E2无关,但与FSH呈强负相关。由此人们逐渐认识到,FSH也是导致绝经后骨质疏松高发的重要原因。但FSH影响绝经后骨质疏松发生发展的作用机制尚未完全明确。N6-腺苷酸甲基化(N6-methyladenosine,m6A)作为真核生物RNA中最常见的一种表观遗传修饰,已被报道广泛地参与多种生物过程,并在机体发育和疾病控制过程中对多种RNA加工过程至关重要。与此同时越来越多的研究表明m6A修饰在骨骼的代谢和发育过程中具有重要的作用,也是OP发生的潜在机制。甲基转移酶3(Methyltransferase Like 3,METTL3)作为其中最重要的m6A修饰酶之一,已被证明可调节成骨细胞分化,进而影响骨形成及骨质疏松的进展。然而,关于m6A甲基化对破骨细胞的作用机制的研究却为数不多。那么FSH是否能够通过m6A修饰作用而影响骨质疏松的进程,这也是我们接下来将要探讨的问题。研究目的探究FSH通过对破骨细胞m6A甲基化修饰促进破骨细胞增殖、迁移导致绝经后骨质疏松的作用机制。阐明m6A甲基化修饰在绝经后骨质疏松进展中的重要作用。研究方法:第一部分:FSH对破骨细胞m6A水平和m6A修饰相关基因表达量的影响在破骨细胞诱导因子RANKL的作用下,RAW264.7细胞被诱导成为破骨细胞。FSH(50m IU/ml)处理破骨细胞72h,用Epi Quik m6A RNA甲基化比色法定量试剂盒检测破骨细胞m6A水平的变化情况。接下来用Western Blot检测m6A修饰相关基因的蛋白表达,q RT-PCR检测相关m RNA水平变化。第二部分:METTL3对破骨细胞增殖和迁移的影响不同浓度FSH处理破骨细胞,免疫荧光Ki67检测破骨细胞增殖、Transwell实验检测破骨细胞迁移能力。同时为了进一步观察METTL3对破骨细胞具体作用,分别在破骨细胞中敲低和过表达METTL3,检测METTL3对破骨细胞增殖和迁移的影响。第三部分:METTL3介导FSH促进绝经后骨质疏松的机制上述实验证明FSH可以促进破骨细胞增殖和迁移,并且METTL3在其中起着重要作用,于是我们进行了METTL3作用于破骨细胞靶基因的筛选,运用m6A甲基化测序技术与KEGG通路数据库筛选下游靶基因。接下来敲低与过表达METTL3后通过Western Blot及q RT-PCR检测靶基因的表达情况。随后对该靶基因进行了功能挽救回补实验,免疫荧光与Transwell迁移实验分别检测其对破骨细胞增殖和迁移能力的影响。为了进一步探究METTL3通过m6A甲基化修饰上调ctsk的机制,在敲低METTL3后分别用转录抑制剂Act D与翻译抑制剂CHX处理破骨细胞,分别检测ctsk的蛋白表达及m RNA水平。此外,我们还预测了ctsk上的甲基化位点。最后在各种相关通路相关抑制剂的作用下通过Western Blot筛选FSH作用于METTL3信号通路,并通过荧光素酶报告基因实验检测CREB对METTL3转录活性的影响。研究结果第一部分:FSH对破骨细胞m6A水平和m6A修饰相关基因表达量的影响***上调破骨细胞m6A水平结果显示:在使用FSH处理之后,与对照组相比,破骨细胞m6A水平显著上升,具有统计学差异。***上调破骨细胞中METTL3蛋白和m RNA水平结果显示:与对照组相比,FSH(50m IU/ml)可显著上调破骨细胞METTL3的蛋白表达和m RNA水平,而对METTL14、FTO、ALKBH5蛋白表达和m RNA水平无明显影响,无统计学差异。并且FSH可浓度(5m IU/ml、10m IU/ml、50m IU/ml、100m IU/ml)和时间(12h、24h、48h、72h)依赖性地上调METTL3蛋白表达和m RNA水平,且具有统计学差异。第二部分:METTL3对破骨细胞增殖和迁移的影响***促进破骨细胞增殖和迁移结果显示:与对照组相比,不同浓度的F

关键词：卵泡刺激素骨质疏松 m6A METTL3 ctsk

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艾司氯胺酮对破骨细胞分化的影响

山西医科大学学报 2023年第4期54卷 486-492页

作者：郭晓霞马智聪崔荞荞卢蒙恩山西医科大学麻醉学院附属第二医院麻醉教研室太原030001 山西医科大学第二临床医学院麻醉科

目的研究艾司氯胺酮在体外对核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of NF-κB ligand,RANKL)诱导的破骨细胞分化的影响及机制。方法从C57BL/6小鼠骨髓中分离获得骨髓源性巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages,BMMs),采用... 详细信息

目的研究艾司氯胺酮在体外对核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of NF-κB ligand,RANKL)诱导的破骨细胞分化的影响及机制。方法从C57BL/6小鼠骨髓中分离获得骨髓源性巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages,BMMs),采用巨噬细胞集落刺激因子(macrophages colony-stimulating factor,M-CSF)和RANKL诱导BMMs向破骨细胞分化。采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测不同浓度艾司氯胺酮(0,3.125,6.25,12.5,25,50,100,200μmol/L)分别作用0,24,48,72 h对BMMs的毒性作用,并筛选出合适浓度,然后将诱导分化的破骨细胞分为3组:对照组、RANKL组和RANKL+艾司氯胺酮组。通过抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)染色法观察艾司氯胺酮对破骨细胞分化的影响;采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测艾司氯胺酮对破骨细胞分化相关基因NFATc1、c-Fos和ctsk mRNA表达水平的影响。结果CCK-8检测结果显示,艾司氯胺酮在0~200μmol/L对BMMs无明显的毒性作用(P>0.05)。TRAP染色结果显示,与对照组比较,RANKL组和RANKL+艾司氯胺酮组中TRAP染色阳性的破骨细胞数量增加(Pctsk mRNA表达升高(Pctsk mRNA表达降低(Pctsk mRNA的表达水平有关。

关键词：艾司氯胺酮破骨细胞细胞分化 NFATc1 c-Fos ctsk

IL-17和牙周膜成纤维细胞对体外诱导破骨样细胞生成的影响

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IL-17和牙周膜成纤维细胞对体外诱导破骨样细胞生成的影响

作者：吴凯广西医科大学

学位级别：硕士

目的:牙根吸收是正畸治疗过程中常见的并发症,而IL-17和牙周膜成纤维细胞可能通过诱导牙周膜微环境中的破骨细胞前体生成具有骨吸收功能的破骨细胞从而引发牙根吸收。本实验拟探讨IL-17作用的牙周膜成纤维细胞和RANKL对人外周血单核细... 详细信息

目的:牙根吸收是正畸治疗过程中常见的并发症,而IL-17和牙周膜成纤维细胞可能通过诱导牙周膜微环境中的破骨细胞前体生成具有骨吸收功能的破骨细胞从而引发牙根吸收。本实验拟探讨IL-17作用的牙周膜成纤维细胞和RANKL对人外周血单核细胞生物学行为的影响,检测不同浓度IL-17刺激下的牙周膜成纤维细胞条件培养液和RANKL不同时间作用下,PBMC中ctsk、MMP-9和CAⅡmRNA表达的影响,以及共培养体系下,观察破骨样细胞的形态与特征标记物,探讨IL-17和牙周膜成纤维细胞在正畸牙根吸收中可能的作用及其作用机制。方法:1.采用密度梯度离心法法培养人外周血单核细胞,接种于48孔板,倒置显微镜观察细胞生长状态,采用组织块培养法培养牙周膜组织,建立HPDLF和PBMC间接共培养体系;2.取第4-6代生长良好的HPDLF,分别加入己经配制的含IL-17浓度为0或20ng/ml的DMEM培养基作用42h,换用含10%FBS的DMEM培养基作用12小时,收集HPDLF细胞上清液,加入50ng/ml的RANKL,作为条件培养液;3.以不同HPDLF条件培养液分别作用于PBMC 3天,5天,7天,10天,采用RT-qPCR法检测外周血单核细胞诱导生成破骨样细胞ctsk、MMP-9、CAⅡImRNA的表达水平;4.不同条件培养液作用于外周血单核细胞后,间接共培养诱导破骨样细胞生成14d,鬼笔环肽染色观察和计数破骨样细胞的细胞骨架中纤维肌动蛋白环的形态、数目。结果:1.所培养外周血单核细胞为圆形,疏松贴壁生长,作为破骨细胞前体细胞。牙周膜成纤维细胞为长梭形,呈放射状或漩涡状生长,生长状态稳定。2.经RT-qPCR检测,在共培养体系下,与对照组相比,IL-17(+)条件培养液和RANKL作用于PBMC后,可上调ctsk、MMP-9、CAⅡmRNA的表达,其中,以IL-17(+)、RANKL(+)组和10d组的表达变化量最明显,组间差别有统计学意义(Pctsk、MMP-9、CAⅡmRNA的破骨样细胞。***-17作用的牙周膜成纤维细胞条件培养液和RANKL能促进PBMC对ctsk、MMP-9、CAⅡmRNA的表达。3.在与人牙周膜成纤维细胞直接共培养的前提下,人外周血单个核细胞可分化为具有纤维肌动蛋白环形态的破骨样细胞。***-17和人牙周膜成纤维细胞在体外能够诱导破骨细胞前体生成破骨样细胞,可能的机制是通过牙周膜微环境中的人牙周膜成纤维细胞表达RANKL介导破骨细胞分化与成熟。

关键词：白介素-17 人牙周膜成纤维细胞 ctsk MMP-9 破骨样细胞

龟鹿二仙胶及其拆方对体外培养破骨细胞骨吸收功能的影响

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龟鹿二仙胶及其拆方对体外培养破骨细胞骨吸收功能的影响

作者：杨树华福建中医药大学

学位级别：硕士

目的：观察龟鹿二仙胶对体外培养破骨细胞骨吸收功能的影响,并按君臣配伍原则,拆分为龟鹿组、龟鹿参组及龟鹿杞组,实施荧光定量PCR检测其对TRAP、CTR、ctsk基因表达的影响,比较龟鹿二仙胶及其拆方含药血清干预体外培养破骨细胞骨吸收功... 详细信息

目的：观察龟鹿二仙胶对体外培养破骨细胞骨吸收功能的影响,并按君臣配伍原则,拆分为龟鹿组、龟鹿参组及龟鹿杞组,实施荧光定量PCR检测其对TRAP、CTR、ctsk基因表达的影响,比较龟鹿二仙胶及其拆方含药血清干预体外培养破骨细胞骨吸收功能的差异,进一步探讨龟鹿二仙胶治疗骨质疏松症的作用机制及其君臣配伍的科学意义。方法：1.龟鹿二仙胶及其拆方含药血清的制备。2. RAW264.7细胞系诱导形成破骨细胞。3.各组含药血清干预体外培养破骨细胞。4. RTF-QPCR检测鹿二仙胶及其拆方含药血清干预后体外培养破骨细胞TRAP、CTR、ctsk基因表达结果。结果：对TRAP基因表达检测结果为：龟鹿二仙胶组ctsk基因表达检测结果为：龟鹿二仙胶组龟鹿杞组>龟鹿参组>生理盐水组;与生理盐水对照组比较：各实验组皆有显著差异(Pctsk基因表达,龟鹿二仙胶组最优。各实验组能够不同程度提高体外培养破骨细胞CTR基因的表达,龟鹿二仙胶组最优。龟鹿二仙胶及其拆方含药血清可通过抑制体外培养破骨细胞TRAP和ctsk基因的表达,提高CTR基因的表达,来抑制破骨细胞的骨吸收作用,这可能是其治疗骨质疏松症的机制,龟鹿二仙胶全方的效果最优。

关键词：龟鹿二仙胶骨质疏松破骨细胞 TRAP ctsk CTR

骨巨细胞瘤单细胞测序方法的建立及数据分析初步探索

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骨巨细胞瘤单细胞测序方法的建立及数据分析初步探索

作者：刘新月天津医科大学

学位级别：硕士

目的骨巨细胞瘤作为亚洲人群多发的一种骨肿瘤,其对骨组织破坏能力强、致侵袭能力强、易复发、残率高且具有一定的转移性,寻找其骨侵蚀破坏的机制及新的治疗靶点成为该肿瘤的研究重点。目前关于骨巨细胞瘤的研究多为临床方面对术式的探... 详细信息

目的骨巨细胞瘤作为亚洲人群多发的一种骨肿瘤,其对骨组织破坏能力强、致侵袭能力强、易复发、残率高且具有一定的转移性,寻找其骨侵蚀破坏的机制及新的治疗靶点成为该肿瘤的研究重点。目前关于骨巨细胞瘤的研究多为临床方面对术式的探索或病例回顾性研究,基础研究方面也多集中于破骨细胞的RNAK信号通路等,因此本研究将重点关注于剖析骨巨细胞瘤肿瘤组织细胞构成以实现对组织内细胞间异质性的分析,结合基因测序技术实现对肿瘤组织中造成骨侵蚀的多核破骨细胞样巨细胞与破骨细胞的分离,并对两者的差异表达基因进行生物学分析,探索对骨巨细胞瘤诊断治疗、预后评估及侵袭转移有重要影响的基因及其机制。方法本研究采用的测序方法为单细胞转录组测序技术,作为在二代测序技术上发展起来的新一代测序技术,单细胞测序可以实现组织内不同细胞单独分离、单独测序、单独建库的目标,同时也提高了基因表达水平测序的精确度,弥补了传统转录组测序方法中信号呈均值、易忽略少数细胞的不足之处,真正达到了在单个细胞水平上解析瘤内细胞异质性,为肿瘤的发生发展机制研究和诊疗方面开辟了新方向,提供了新思路。本研究将骨巨细胞瘤组织通过组织处理-组织解离-过滤检测的步骤将肿瘤组织处理至数量与活性均合格的细胞悬液并进行测序建库,对数据进行标准化过滤、线性转化、降维等处理,进行细胞聚类分析,将所有细胞按基因表达分类为12个细胞群。由于目前并没有关于单细胞测序技术在定义细胞类型上的明确方法,因此本研究在查询多个数据库及相关资料后,首次使用了在定义每个细胞群类型时,调取细胞差异表达基因并一一查询基因信息,同时通过采集数据库中细胞标记基因再对照本数据的查询定义方法,将12个不同细胞群分别进行定义命名,两种方向互相验证共同作用提高了严谨性及准确度,并填补了骨巨细胞瘤单细胞测序技术在定义细胞方法上的空白。在确定破骨细胞样巨细胞群和破骨细胞群后,本研究提取了这两个细胞群相比于其他细胞群中高表达的差异表达基因,并对这些基因进行GO基因注释(分子功能+生物学功能)查询,寻找破骨细胞样巨细胞的过度骨吸收特性有关的重要基因。结果通过单细胞测序技术和生物学分析技术将肿瘤组织内细胞分群聚类后,确定了本研究所选取的骨巨细胞瘤中具有的细胞类型包括:NKT细胞、成骨细胞、浆细胞、B细胞、巨细胞、巨噬细胞、T细胞、基质细胞、单核细胞、破骨细胞、少量肌细胞、破骨细胞前体细胞、血管内皮细胞和成纤维细胞。在确定细胞类型后,提取了破骨细胞样巨细胞和破骨细胞群相比于其他细胞群中高表达的差异表达基因各50个,通过韦恩图比对发现两细胞群的差异表达基因中重合部分超过半数(27个),对这些功能同表达基因进行热图展示分析后,发现破骨细胞表达较高的基因包括CA2、ATP6V1E1、CKB、SPP1、ATP6V1C1、ATP6V1G1、GLRX、CSTB、ATP6V0E1、MATK、RAC2、SLC9B2、ATP6V1B2、CHCHD10、TCIRG1、ATP6V1H、ATP6V1F、RALA、ACP5、CTSD、CD68,而相比之下,共同基因中(50),巨细胞表达较高的基因包括TKT、SNX10、MMP9、CD84、RGS10、ctsk。对每个基因进行GO基因注释及查询后发现,在破骨细胞表达较高的基因中,基因SPP1除了正性调控骨吸收外,还参与了成骨细胞分化和骨化的过程,这是维持骨组织中成骨沉积-骨吸收稳态的重要环节,而巨细胞内SPP1的表达却较低。基因MATK参与了Erb B2(HER2基因)信号通路,而在研究中报道过骨肿瘤中的基因Erb B2的过表达伴有患者肺转移,也标志了较差的预后。在巨细胞表达较高的基因中,基因ctsk参与了负调控膜内骨化、骨吸收和软骨发育的生物学过程,这些功能可能是造成巨细胞骨破坏的机制,在研究中也报道过AKT/NFATc1/ctsk轴在颅骨发育过程中促进破骨细胞生成和骨吸收,而在骨巨细胞瘤中ctsk对于破骨细胞和骨吸收的机制并没有阐明。另一巨细胞表达较高的基因为基因SNX10,其生物学功能包括调节骨矿化、破骨细胞分化、骨吸收等与破骨细胞类功能,而且有研究显示基因SNX10参与破骨细胞激活,SNX10突变将造成破骨细胞功能障碍,进而影响骨质硬化,但基因SNX10在骨巨细胞瘤中对破骨细胞的作用机制并没有相应研究阐述。结论本研究通过对单细胞技术实验方法、数据的处理分析,定义细胞方法的探索和掌握,达到了对骨巨细胞瘤单个细胞层面和基因层面的剖析,分析定义了该肿瘤的所含细胞类型并初步确定了四个最可能造成肿瘤骨侵蚀特性的基因SPP1、MATK、ctsk和SNX10,弥补了当前骨巨细胞瘤研究领域的缺陷。

关键词：骨巨细胞瘤单细胞测序破骨细胞样巨细胞 SPP1 MATK ctsk SNX10