检索结果-南通市图书馆

作者：侯静兰州大学

学位级别：硕士

目的调节性T细胞(CD4CD25 regulatory T cell，Treg)是近年来鉴定的一种新型免疫抑制细胞，它具有免疫无能性和免疫抑制性两大特征，被认为是迄今为止所发现的最重要的免疫抑制细胞。多种肿瘤患者外周血和肿瘤局部Treg细胞明显增加，在... 详细信息

目的调节性T细胞(CD4CD25 regulatory T cell，Treg)是近年来鉴定的一种新型免疫抑制细胞，它具有免疫无能性和免疫抑制性两大特征，被认为是迄今为止所发现的最重要的免疫抑制细胞。多种肿瘤患者外周血和肿瘤局部Treg细胞明显增加，在肿瘤免疫耐受中发挥重要作用。树突状细胞(dendritic cell，DC)是目前已知的功能最强的抗原提呈细胞，因其强大的抗原递呈功能和激活抗原特异性的CTL(cytotoxic T lymphocytes CTL)反应，成为肿瘤生物免疫治疗的重要载体。但DC的上述作用依赖于其成熟、表达的MHC-Ⅰ、Ⅱ类分子及协同刺激分子B7-1、B7-2和CD40等，其中B7分子可与CD28和ctla-4结合，前者促使T细胞活化，而后者则使T细胞无能。本研究旨在探讨CD4CD25Treg细胞对DC免疫抑制的影响及可能机制。方法应用免疫磁珠分离获得CML患者和健康人Treg细胞。采集CML患者和健康人骨髓分离获得单个核细胞(BMMNC)，培养得到DC细胞。实验分组：实验组A：CML-Treg+CML-DC±ctla-4单抗，实验组B：CML-Treg+Normal-DC±ctla-4单抗;对照组C：Normal-Treg+Normal-DC，对照组D：Normal-Treg+CML-DC。应用流式细胞仪检测各组Treg细胞ctla-4的表达及DC表型CD1a、CD40、CD3、HLA-DR及CD80、CD86等。观察加入抗ctla-4单抗后实验组DC表面标志CD80、CD86表达的变化，应用酶联免疫吸附法(ELISA)检测Treg细胞因子IL-10和TGF-β水平。结果应用免疫磁珠分选所得CD4CD25Treg细胞，经流式细胞术检测其纯度为85％～94％。CML患者外周血Treg细胞ctla-4阳性表达率为52.4％，健康人为33.2％。与加入Treg前相比，实验组和对照组DC表型CD80、CD86均明显减低(P＜0.05)。当实验组(A、B)加入ctla-4单抗后，DC标志CD80、CD86表达又复上调(P＜0.05)。ELISA检测结果表明：IL-10和TGF-β水平在实验组表达最高，分别为629.22±124.04 pg／ml、581.47±109.21 pg／ml，明显高于对照组(p＜0.05)。结论CML患者外周血CD4CD25Treg的数量较健康人高，其ctla-4阳性表达率也较健康人高，说明Treg与CML免疫耐受机制有关，Treg可能参与了CML的发生发展。Treg细胞下调共刺激分子CD80、CD86的表达，ctla-4单抗能对抗这一作用。所以ctla-4与B7分子(CD80、CD86)通路可能是Treg影响DC的关键途径，选择性抑制ctla-4有望增强DC的功能。本研究为ctla-4作为抗肿瘤靶点提供了新的依据，为提高DC功能以及DC肿瘤疫苗的应用提供了一条新策略和新途径。

关键词：调节性T细胞树突状细胞 ctla-4

免疫检查点抑制剂致心脏毒性的研究进展及病例回顾

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免疫检查点抑制剂致心脏毒性的研究进展及病例回顾

作者：杨雨濛重庆医科大学

学位级别：硕士

恶性肿瘤发生率逐渐升高,肿瘤免疫治疗是近几年来癌症治疗领域的热点。但近年来,有相关动物实验及越来越多的临床数据表明免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitors,ICIs)治疗可能引起肿瘤患者心脏毒性,导致患者出现自身免疫的心... 详细信息

恶性肿瘤发生率逐渐升高,肿瘤免疫治疗是近几年来癌症治疗领域的热点。但近年来,有相关动物实验及越来越多的临床数据表明免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitors,ICIs)治疗可能引起肿瘤患者心脏毒性,导致患者出现自身免疫的心肌炎、心肌纤维化、心脏骤停、心肌病和充血性心力衰竭等心脏疾患,影响患者预后情况。对于这一新型抗肿瘤治疗手段所致心脏毒副作用,有越来越多的研究者开始关注。本文就ICIs在抗肿瘤治疗中的心脏毒性发生机制及目前诊治管理策略的研究现状作一综述,并结合临床实际应用中的具体病例,总结其经验教训,我们认为ICIs所致心脏毒性是一严重并发症,应提高认识、全程监测、早期诊断、及时治疗。

关键词：免疫检查点抑制剂 ctla-4 PD-1/PD-L1 心脏毒性免疫性心肌炎

哮喘患儿CD4+T细胞CD28家族部分受体表达相关研究

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哮喘患儿CD4+T细胞CD28家族部分受体表达相关研究

作者：许雪梅皖南医学院

学位级别：硕士

目的:研究哮喘患儿血清IgE、25(OH)D、T淋巴细胞亚群、B淋巴细胞及CD4+T细胞CD28家族部分受体表达情况,分析其与患儿哮喘发病的相关性,推测其作用机制,为临床预防和治疗哮喘提供进一步的依据。方法:选取我院儿科2015年06月至2017年01月... 详细信息

目的:研究哮喘患儿血清IgE、25(OH)D、T淋巴细胞亚群、B淋巴细胞及CD4+T细胞CD28家族部分受体表达情况,分析其与患儿哮喘发病的相关性,推测其作用机制,为临床预防和治疗哮喘提供进一步的依据。方法:选取我院儿科2015年06月至2017年01月3-6岁住院哮喘患儿16例(哮喘组),同期一般细菌感染患儿13例(感染组)及门诊体检健康学龄前儿童13例(对照组)。三组受试对象在性别、年龄及体重上未见明显差异,均无统计学意义(P>0.05)。哮喘患儿诊断符合第8版褚福堂实用儿科学,一般细菌感染患儿有感染指标异常,均无其它合并症;哮喘患儿及一般细菌感染患儿入院前均未接受治疗。在住院后24小时内收集清晨空腹外周静脉血2.0-2.5ml分别置于含EDTA-K2抗凝管(紫头)保存,使用散射比浊法测定IgE,放射免疫分析法测定25(OH)D,T淋巴细胞亚群及B淋巴细胞的比例和CD4+T细胞CD28、ctla-4、BTLA的表达,采用流式细胞术检测。结果:1.25(OH)D:三组间未见明显差异,无统计学意义(p>0.05)。***:哮喘组明显高于对照组、感染组(P0.05)。3.T淋巴细胞亚群及B淋巴细胞百分比在三组之间的比较均具有统计学意义:(1)CD3+T细胞、CD3+CD8+T细胞:哮喘组、感染组较对照组显著下降(P0.05)。(2)CD3+CD4+T细胞:哮喘组较感染组、对照组明显升高(P0.05)。(3)CD4+/CD8+比值:哮喘组较感染组、对照组显著升高(P4)CD3-CD19+B细胞:哮喘组较感染组、对照组明显升高(P0.05)。4.哮喘组、感染组CD4+T细胞表面CD28的表达明显高于对照组(P0.05)。5.哮喘组CD4+T细胞表面BTLA表达较感染组、对照组明显升高(P0.05)。6.对照组、感染组、哮喘组三组受试对象CD4+T细胞表面均未检测到ctla-4。结论:共刺激分子参与哮喘的发病:(1)CD28在哮喘患儿CD4+T细胞表达上调,促进T细胞活化,建立有效免疫应答,参与哮喘的免疫调控;(2)ctla-4介导负性信号传递,在三组受试对象CD4+T细胞均未检测到,但不能因此否认其参与哮喘的发病,可能与哮喘患儿自身抑制信号的产生不足而未能及时上调有关;(3)BTLA在哮喘患儿CD4+T细胞表达上调,抑制T细胞活化,参与免疫应答的负性调控。

关键词：哮喘 IgE 维生素D 淋巴细胞 CD28 ctla-4 BTLA

CD80共刺激分子单独表达诱导免疫耐受机理初探

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CD80共刺激分子单独表达诱导免疫耐受机理初探

作者：柯能文四川大学

学位级别：硕士

研究背景：特异性抑制排斥反应，诱导免疫耐受是器官移植面临的主要挑战之一。T细胞作为免疫反应的主要细胞，无论对免疫排斥还是免疫耐受都起到关键作用。T细胞活化需要MHC复合体提供第一信号及共刺激分子提供第二信号。CD80／CD86是... 详细信息

研究背景：特异性抑制排斥反应，诱导免疫耐受是器官移植面临的主要挑战之一。T细胞作为免疫反应的主要细胞，无论对免疫排斥还是免疫耐受都起到关键作用。T细胞活化需要MHC复合体提供第一信号及共刺激分子提供第二信号。CD80／CD86是重要的共刺激分子，通过与受体CD28／ctla-4结合，调控T细胞活化及分化。CD80／CD86作为同源分子，一直被认为功能相似。但最近研究发现，二者功能不尽相同。对CD80／CD86与CD28／ctla-4系统的生物物理学研究表明，CD80能与ctla-4形成更稳定的结合，有体内外实验证实CD80能抑制T细胞增殖，而CD86不能，提示CD80很可能主要通过ctla-4传递抑制信号，抑制免疫反应。皮肤作为免疫原性最强的器官，常规异基因移植很难避免排斥反应。但有研究显示，培养的小鼠皮肤角朊细胞同种异体移植后急性排斥反应不明显，角朊细胞能被CD8T细胞识别，但不被排斥。另有研究发现少量自体角朊细胞与同种异体甚至异种角朊细胞混合培养后移植，不发生明显的急性排斥，慢性排斥也不明显，移植皮片能长期存活，机理不明。我们前期实验从基因和蛋白两个层面证实培养的小鼠角朊细胞能单独表达CD80蛋白，不表达CD86蛋白。实验中还发现培养的小鼠心肌细胞也能单独表达CD80蛋白。本研究进一步探讨培养的近交系小鼠角朊细胞膜片诱导免疫低反应现象与角朊细胞单独表达CD80共刺激分子的关系，并对同样单独表达CD80分子的小鼠心肌细胞也进行了免疫学相关检测，用两个不同细胞模型来验证CD80单独表达诱导免疫耐受的可能性。研究方法：分别培养乳鼠角朊细胞及心肌细胞，通过免疫荧光、RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)检测培养细胞CD80／CD86表达情况。将培养的角朊细胞和心肌细胞分别与预活化同种异体细胞毒性淋巴细胞(cytotoxicity Tlymphocyte，CTL)共培养，检测杀伤率，另用不表达CD80分子或表达CD80但加入anti-CD80抗体的相同细胞作对照。为检测自体角朊细胞在免疫耐受中有何作用，以培养的角朊细胞为调节细胞，以不同比例加入同基因和同种异基因脾细胞混合培养体系中，用MTT法测淋巴细胞增殖率。同样用不表达CD80分子或表达CD80但加入anti-CD80抗体的相同细胞作对照。为检测CD80是否通过ctla-4途径影响免疫反应，在上述表达CD80的细胞反应体系中，均加入anti-ctla-4抗体，封闭ctla-4通路。结果：乳鼠角朊细胞培养1天后检测，抗CD80抗体未显色。培养7天后，抗CD80抗体显色明显加强，形态规则，胞核明显。相同条件下检测CD86表达，在培养1、7天时均未发现抗CD86抗体着色。乳鼠心肌细胞培养10天后增殖心肌细胞高表达CD80蛋白，而CD86蛋白检测不到。RT-PCR显示培养10天心肌细胞CD80 mRNA表达强度与β-actin相似，但CD86 mRNA表达很低。 CTL杀伤实验中，培养7天同种异体角朊细胞杀伤率在各个E：T比时均低于培养1天角朊细胞。用anti-CD80抗体封闭CD80与anti-ctla-4抗体封闭ctla-4后，CTL杀伤率均上升，7天和1天培养的角朊细胞杀伤率相近。培养10天的同种异体心肌细胞在E：T从3：1到30：1时，杀伤率为6．36％到39．66％，加入anti-CD80和anti-ctla-4抗体后，杀伤率几乎增加了1倍。单向混合淋巴细胞增殖实验结果显示，培养7天自体角朊细胞能抑制单向混合淋巴细胞增殖反应(mixed lymphacyte reaction，MLR)，并随自体角朊细胞的增加，抑制增强，在E：T：auto-KC=1：1：1．5时到达最大效应。同种异体角朊细胞则不能抑制MLR，相反有促进作用。培养1天的角朊细胞也不能抑制MLR，其MLR增殖程度与未加角朊细胞MLR增殖程度相似略有增加。用抗体封闭培养7天角朊细胞CD80后，抑制作用消失，但仍低于培养1天角朊细胞。anti-ctla-4阻断CD80与ctla-4结合，培养7天自体角朊细胞抑制作用也消失，甚至随自体角朊细胞数量增加，有促进MLR的趋势。结论：本实验结果提示，角朊细胞和心肌细胞等实体细胞在一定条件下能单独表达CD80，与自身MHC分子配合，可成为一种有效的调节性抗原提呈细胞(regulatory antigen present cell，rAPC)，对免疫反应产生影响。CD80分子通过ctla-4可抑制抗原特异性CTL杀伤。自体细胞还能通过ctla-4抑制淋巴细胞的增殖反应。这种抑制涉及MHC分子。但本实验尚未证实CD80是通过那一类细胞上的ctla-4产生效应，同时还需进一步研究CD80与自身MHC分子共

关键词： CD80 CD86 ctla-4 免疫耐受皮肤移植角朊细胞心肌细胞

CD4～+CD25～+调节性T细胞涉及日本血吸虫感染免疫调节的细胞学证据

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CD4～+CD25～+调节性T细胞涉及日本血吸虫感染免疫调节的细胞学证...

作者：蔡晓萍南京医科大学

学位级别：硕士

当前，血吸虫病防治面临的棘手问题之一是宿主缺乏有效的抗再感染免疫力而造成再感染率居高不下。因此，能否控制化疗后再感染问题已经成为血吸虫病防治中的核心问题。人群流行病学和动物模型研究均提示，随着日本血吸虫感染的慢性化进... 详细信息

当前，血吸虫病防治面临的棘手问题之一是宿主缺乏有效的抗再感染免疫力而造成再感染率居高不下。因此，能否控制化疗后再感染问题已经成为血吸虫病防治中的核心问题。人群流行病学和动物模型研究均提示，随着日本血吸虫感染的慢性化进程，宿主出现免疫下调现象。除了血吸虫病外，很多慢性感染性疾病，如利什曼病，结核病等，也存在免疫下调现象。近几年，一些研究者将这种持续慢性感染状态与CD4CD25调节性T细胞诱导的抑制性免疫应答联系起来。对曼氏血吸虫慢性感染的研究已经开始涉及CD4CD25调节性T细胞的免疫调节作用，但迄今为止，在日本血吸虫感染的研究中尚无有关报道。基于日本血吸虫病慢性期的免疫下调现象，结合其它慢性感染性疾病的研究资料，设计本研究，旨在通过对日本血吸虫慢性感染小鼠体内CD4CD25调节性T细胞抑制功能的了解，进而探讨CD4CD25调节性T细胞随日本血吸虫感染进程，在细胞表型和功能相关基因上的变化规律，为进一步研究CD4CD25调节性T细胞在日本血吸虫慢性化过程中的免疫下调机理和血吸虫感染后宿主高再感染率的成因提供实验资料。首先建立日本血吸虫慢性自然感染小鼠模型，运用免疫磁珠分离纯化获得日本血吸虫慢性感染小鼠肠系膜淋巴结和脾脏组织的CD4CD25调节性T细胞，在有丝分裂原ConA(刀豆蛋白A)和特异性抗原SEA(日本血吸虫可溶性虫卵抗原)刺激下，采用同位素H-TdR掺入细胞增殖实验分析CD4CD25调节性T细胞对其它细胞(包括肠系膜淋巴结或脾脏中除CD4CD25调节性T细胞外的所有单个核细胞)增殖的抑南京医科大学硕士学位论文制作用。再以双色流式细胞术检测不同感染时期(虫卵沉积前期、感染急性期、感染慢性期卜J、鼠肠系膜淋巴结和脾脏组织中，cD4+CD25十调节性T细胞相对比例上的变化规律，同时运用实时荧光定量PCR方法检测各个感染时期相关基因CD25在CD4+T细胞mRNA中的变化;为初步探索CD4℃D25斗调节性T细胞的作用机制，我们再以实时荧光定量 PcR方法检测cD4+cD25+调节性T细胞特异性转录基因FoxP3的 mRNA 水平，并结合现有的基因芯片结果，检测cD4℃D25+调节性T细胞相关负调控分子ctla一4的基因在CD4+T细胞中的变化规律。所有实验均设同期未感染小鼠为正常对照组。本实验获得如下主要实验结果: 1.日本血吸虫慢性感染小鼠体内的CD4+CD25+调节性T细胞受抗原利激后具有抑制其它细胞增殖的功能.在日本血吸虫慢性感染小鼠和正常小鼠体内，分离高纯度的CD4+CD25+调节性T细胞，在有丝分裂原ConA刺激下，均表现出对其它细胞显著的抑制效率。受特异性杭原SEA的作用，感染慢性期小鼠体内获得的CD4+CD25+调节性T细胞对其它免疫细胞增殖的抑制率可达65%，而正常小鼠CD4+CD25+ 调节性T细胞对其它细胞的抑制率仅达到20%。在无抗原刺激下，细胞增殖甚微。而且无论有无抗原刺激，单纯CD4+CD25十调节性T细胞培养均无明显增殖现象。这种慢性感染后的cD4+CD25千调节性T 细胞，可能由于受日本血吸虫杭原尤其是SEA的激活，通过抑制其它细胞增殖而参与日本血吸虫免疫下调作用。 2.在日本血吸虫感染慢性期，CD4十CDZ犷调节性T细胞数量占琳巴结和脾脏组织单个核细胞的比例，尤其CD旷T细胞的相对比例上调，同时CD25基因的mRNA水平上调.在日本血吸虫感染急性期，相对于正常小鼠:CD4+CD25+调节性T细胞在淋巴结和脾脏组织单个核细胞和CD4+T细胞中的比例均显著下降;而在感染慢性期该细胞比例回升，甚至在CD4+T细胞中的比例高于正常小鼠。同时CD25 基因在CD旷T细胞mRNA中的转录水平随感染进展不断上调。述其原因可能由于CD4+CD25+调节性T细胞活化后，抑制其它细胞增殖，导致CD4+CD25十调节性T细胞数量比例的相对上调;或者可能由于南京医科大学硕士学位论文 CD25基因表达增加后CD4+CD25斗调节性T细胞的生成增加;或许两者共同发挥作用。 3.在日本血吸虫感染慢性期，cD4+CD25+调节性T细胞特异性转录基因Fox户的mRNA显著增加.在日本血吸虫感染过程中，与同期正常组刁、鼠相比，感染组小鼠肠系膜淋巴结和脾脏组织内CD4+T细胞中转录基因Foxp3的mRNA在感染急性期已经上调，至感染慢性期显著高于正常小鼠(p<0.01);尽管转录因子仅存在于转录过程中，但是它们相对于功能基因的表达具有至关重要的作用。在日本血吸虫感染慢性期，可能通过转录因子Foxp3的高表达，激活cD旷c

关键词：日本血吸虫慢性感染 CD4+CD25+ 调节性T细胞免疫抑制 Foxp3 ctla-4

转化生长因子β1抑制T淋巴细胞功能及其相关机制的体外研究

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转化生长因子β1抑制T淋巴细胞功能及其相关机制的体外研究

作者：陈昊安徽医科大学

学位级别：硕士

目前治疗器官移植排斥反应的方法主要是应用各种免疫抑制剂以及抗CD3、CD4等免疫活性细胞和活性分子的单克隆抗体,临床效果较为满意,但存在严重的全身性免疫抑制,已诱发感染和肿瘤发生。因此诱导机体产生特异性免疫耐受是克服移植排斥... 详细信息

目前治疗器官移植排斥反应的方法主要是应用各种免疫抑制剂以及抗CD3、CD4等免疫活性细胞和活性分子的单克隆抗体,临床效果较为满意,但存在严重的全身性免疫抑制,已诱发感染和肿瘤发生。因此诱导机体产生特异性免疫耐受是克服移植排斥的理想途径,始终是免疫学研究的热点。近年来,应用细胞因子及其单克隆抗体治疗器官移植排斥反应受到广泛的重视,其中以转化生长因子β(TGF-β)尤为引人关注。TGF-β是一种多向性的细胞因子,对免疫系统具有广泛的抑制作用,极微量就具有很强的免疫抑制作用。一系列动物体内和体外实验证实TGF-β可以抑制T淋巴细胞增殖,并诱导出免疫耐受,本实验试图通过观察TGF-β1对人外周血T淋巴细胞增殖的影响,对其可能的作用机制进行初步研究,以期为日后临床应用的可能性提供实验依据。目的通过TGF-β对T细胞的抗增殖作用及其可能机制的研究,试图为移植排斥反应的治疗提供一条新的途径。本实验观察TGF-β1在混合淋巴细胞反应中对T细胞增殖的影响,并进一步探讨其作用机理。方法分离不同个体健康成年人外周血淋巴细胞进行初次及再次混合淋巴细胞培养(MLC),设TGF-β1组和对照组,在不同时间点以MTT法检测T细胞增殖率,用乳酸脱氢酶法测定细胞毒活性,以ELISA法测定培养上清中IFN-γ及IL-2水平,并用流式细胞仪检测T细胞表面CD4CD25及ctla4抗原表达。结果初次及再次MLC均显示,TGF-β1组细胞增殖反应明显低于对照组,CTL的细胞毒性受到明显抑制,初次MLC中TGF-β1组培养上清内IFN-γ及IL-2水平明显低于对照组。初次MLC 5天后反应体系中CD4CD25T细胞比例及ctla4抗原表达明显高于对照组。在再次MLC中,TGF-β1作用过的反应细胞对来自第三者的刺激细胞无反应。结论 ① TGF-β1在人外周血混合淋巴细胞培养中对T细胞增殖有显著抑

关键词：转化生长因子β 免疫耐受调节性T细胞 ctla-4

原发性非家族性乳腺癌分子发病机制及临床病理因素的相关性研究

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原发性非家族性乳腺癌分子发病机制及临床病理因素的相关性研究

作者：毕晔山东省医学科学院

学位级别：硕士

目的乳腺癌是威胁女性健康的主要恶性肿瘤之一。探索非家族性乳腺癌的发病机制以及肿瘤免疫逃逸、机体免疫耐受间的关系对乳腺癌的深入研究十分重要。以往有关乳腺癌基因发病机制的研究多集中于家族性乳腺癌及其相关的BRCA1和BRCA2基因... 详细信息

目的乳腺癌是威胁女性健康的主要恶性肿瘤之一。探索非家族性乳腺癌的发病机制以及肿瘤免疫逃逸、机体免疫耐受间的关系对乳腺癌的深入研究十分重要。以往有关乳腺癌基因发病机制的研究多集中于家族性乳腺癌及其相关的BRCA1和BRCA2基因缺陷,但约90%的乳腺癌属于与其无关的非家族性乳腺癌,其基因发病机制研究较少。乳腺癌的发生发展是多因素共同作用的结果,仅用基因的变异并不能解释疾病发展的过程。机体自身免疫功能低下,肿瘤细胞通过特殊的通路逃逸免疫系统的监视亦是非常重要的因素。2002年,美国学者发现了一种新的乳腺癌抑制基因RhoBTB2 (rho-related BTB domain-containing 2 ,RhoBTB2),并推测其在大多数乳腺癌中表达缺失或处于失活状态[1],更重要的是,它是与非家族性乳腺癌相关的少数基因之一,可能成为乳腺癌的主要候选抑癌基因。有关RhoBTB2基因的研究国外刚刚起步,国内尚未开展。研究多数限于乳腺癌细胞系体外实验模型,对乳腺癌组织研究甚少。Fas也称Apo-l,CD95,属于TNF超家族的跨膜糖蛋白。Fas广泛分布于活化的T细胞、B细胞和单核细胞等免疫细胞表面,在免疫调节中具有重要意义。Fas系统与乳腺癌的关系在国内已有一定的研究,但多仅限于基础理论研究,尚无与患者临床病理因素及预后相关的分析,而且众多学者的研究结论并不一致。ctla-4 (cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4,细胞毒T淋巴细胞相关抗原-4)蛋白属于免疫球蛋白超家族,在激活的CD4+和CD8+T淋巴细胞及激活的B淋巴细胞表面表达。ctla-4与T细胞介导的自身免疫性疾病、移植排斥反应以及机体肿瘤、抗感染、抗过敏能力有关。有关ctla-4信号传导的国内外研究多集中于自身免疫病,少见关于肿瘤方面的报道。本研究从山东省自然科学基金项目原发性非家族性乳腺癌发病及免疫逃逸分子机制的研究(Y2004C17)中选取子课题,将填补国内同类研究的空白。本课题的完成将探索乳腺癌发病及免疫逃逸的机制,为乳腺癌的基因及生物治疗提供新的靶位。材料与方法选取1999年1月～2004年5月山东省肿瘤医院乳腺病中心单个治疗组收治的女性首诊可手术的散发性乳腺癌患者60例,对照组为30例女性良性乳腺疾病患者。癌组织均于术中在原发灶取材,良性病变者选取病变旁正常乳腺组织,组织离体后迅速置于液氮中,并保存于-196℃备用。采用TRI Zol试剂,按试剂说明书提取总RNA,以提取的RNA为模板,按试剂盒说明书进行逆转录及PCR。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳,Gel Dos1000凝胶图像分析仪分析扫描各条带,以各样本β-actin作为内参照,各目的基因条带与β-actin条带扫描所得灰度值的比值表示该基因的相对表达量。Fas以β-actin2作为内参照,ctla-4及Rhobtb2以β-actin1作为内参照。使用SPSS 13.0软件进行统计分析。结果1. RhoBTB2基因乳腺癌组织中RhoBTB2基因表达显著低于正常乳腺组织中的表达,乳腺癌组织中Rhobtb2基因表达的相对定量均数分别为0.625±0.160,而正常腺体组织为0.843±0.218,P45,P46,P4个组及腋淋巴结转移≥4个组比较,Fas表达也有差异,均Pctla-4乳腺癌组织中ctla-4的基因表达显著高于正常乳腺组织中的表达,Pctla-4表达的相对定量平均秩次为60.030,而正常腺体组织为16.430,Pctla-4表达有显著性差异,其均数分别为0.978±0.330和1.134±0.2

关键词：乳腺癌 RhoBTB2 Fas ctla-4 RT-PCR 肿瘤标志物

Ipilimumab体外活性检测方法的建立、优化及验证

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Ipilimumab体外活性检测方法的建立、优化及验证

作者：邵文琦华东理工大学

学位级别：硕士

Ipilimumab是全球首个也是目前唯一获批上市的抗ctla-4的单克隆抗体。作为肿瘤免疫检查点抑制剂,Ipilimumab已获准单药或联合给药用于多种实体瘤的免疫治疗,并在临床上获得了显著的疗效,为广大肿瘤患者带来了新的希望。本研究建立了多... 详细信息

Ipilimumab是全球首个也是目前唯一获批上市的抗ctla-4的单克隆抗体。作为肿瘤免疫检查点抑制剂,Ipilimumab已获准单药或联合给药用于多种实体瘤的免疫治疗,并在临床上获得了显著的疗效,为广大肿瘤患者带来了新的希望。本研究建立了多种可用于检测Ipilimumab体外活性的方法:ELISA法检测Ipilimumab与rhctla-4结合活性的方法、FACS法检测Ipilimumab竞争抑制B7-1与细胞膜ctla-4结合活性的方法,以及通过检测PBMC细胞中T细胞增殖与活化所表达的IL-2浓度,从而评价Ipilimumab活性的方法。对ELISA法检测Ipilimumab与rhctla-4结合活性和FACS法检测Ipilimumab竞争抑制B7-1与细胞膜ctla-4结合活性的方法进行了验证,验证结果显示:两种方法的专属性和耐用性良好,模拟相对结合活性50%～200%的Ipilimumab供试品,多次活性测定的回收率在90～104%的范围内,精密度的重复性和中间精密度均小于15.0%,线性关系系数均大于0.98,说明这两种分析方法均能够真实、准确、稳定地反映Ipilimumab活性。Ipilimumab体外活性方法的研究与建立,可为国内外Ipilimumab生物类似药开发,以及以ctla-4为靶点的创新型抗体或双特异性抗体等产品研究,提供体外活性检测方法的基础和参考。

关键词： Ipilimumab ctla-4 活性检测方法方法验证

CD4～+CD25～+T细胞与异基因造血干细胞移植后aGVHD关系的研究

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CD4～+CD25～+T细胞与异基因造血干细胞移植后aGVHD关系的研究

作者：闫蓓中国人民解放军军医进修学院

学位级别：硕士

移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)是异基因造血干细胞移植(allogeneic haematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT)最严重的并发症之一。近年来研究发现CD4CD25调节性T细胞能抑制致死性GVHD的发生,同时保留移植物抗白血病(graft versus leukemia,GVL)效应。由于该类细胞高表达IL-2受体α链即CD25分子,因此被称为CD4CD25调节性T细胞(Treg细胞)。那么该类细胞在人类aGVHD发生中起何种作用呢?另外,CD25分子亦表达于激活的T细胞表面,在CD4CD25T细胞中,并非都是Treg细胞,还包括效应性T细胞。因此本实验中我们在探讨allo-HSCT患者重建外周血中CD4CD25T细胞与aGVHD关系的同时,又检测了Treg细胞几种具有代表意义的标志物CD62L、CD28、ctla-4(CD152)及Foxp3的表达,分析了它们与aGVHD的关系。我们采用三色流式细胞仪技术检测allo-HSCT后+21、31、41、51、61天时患者重建外周血中CD4CD25T细胞含量及其表面标志物CD62L、CD28、ctla-4的表达;并采用RT-PCR方法比较allo-HSCT患者移植后+21、31、41天重建外周血中该类细胞Foxp3 mRNA的表达水平,统计分析该类细胞及这几种标志物与aGVHD发生的关系。通过实验我们发现:①aGVHD组患者allo-HSCT后重建外周血中CD4CD25T细胞表达较未发生aGVHD组显著增高(P4CD25T细胞表面CD62L表达较未发生aGVHD组明显降低(P4CD25T细胞表面CD28、ctla-4表达无显著性差异(P>0.05)。④aGVHD组患者allo-HSCT后PBMCs中Foxp3 mRNA表达较未发生aGVHD组明显降低(P4CD25T细胞表达

关键词： CD4+CD25+调节性T细胞 CD62L CD28 ctla-4 Foxp3

骨骼肌原位基因表达技术在黑色素瘤免疫治疗中的探索性研究

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骨骼肌原位基因表达技术在黑色素瘤免疫治疗中的探索性研究

作者：黄倩四川大学

学位级别：硕士

目的:探索在小鼠体内骨骼肌细胞中表达免疫检查点抑制剂PD-1单抗及/或ctla-4单抗对小鼠黑色素瘤治疗的安全性及有效性,以分析其潜在的临床应用价值。材料和方法:实验动物选取6周龄近交系C57BL/6J雄性小鼠,体质量范围为16～18 g。用鼠源... 详细信息

目的:探索在小鼠体内骨骼肌细胞中表达免疫检查点抑制剂PD-1单抗及/或ctla-4单抗对小鼠黑色素瘤治疗的安全性及有效性,以分析其潜在的临床应用价值。材料和方法:实验动物选取6周龄近交系C57BL/6J雄性小鼠,体质量范围为16～18 g。用鼠源性B16F0细胞系来探索及建立适宜的黑色素瘤肿瘤模型。通过基因工程技术构建在骨骼肌细胞中特异且高效表达PD-1及ctla-4的单链抗体可变区(single chain fragment variable,sc Fv)的质粒,分组进行骨骼肌肌注,通过L/E/G传递体系把其递送到肌肉细胞中,让其在小鼠体内表达PD-1及/或ctla-4的sc Fv。定期测量小鼠体重及成瘤后肿瘤体积并绘制对应曲线。经小鼠内眦从眼球后静脉丛采血,测量抗体浓度,观察半衰期,测量血常规及生化观察安全性。在接种B16F0细胞后第22天处死所有小鼠,依次取下小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肿瘤及注射质粒处肌肉和对侧未注射质粒的肌肉,经甲醛固定、HE染色,进行组织病理学评估。通过免疫组化方式检测肿瘤组织CD3T细胞及肿瘤和骨骼肌中的His蛋白标签,通过Tunel法检测肿瘤细胞的凋亡程度。结果:建立了稳定可靠的黑色素瘤小鼠模型,体内外试验证实治疗质粒在体内外都能够正常表达并分泌出胞。实验组小鼠成瘤体积较对照组更小,肿瘤生长速度较对照组相对缓慢,差异存在统计学意义。相较对照组,实验组的血常规指标更靠近正常值范围,且生化指标中的肝酶及乳酸脱氢酶也较对照组明显减少,对照组出现明显的贫血、血白细胞升高、乳酸脱氢酶升高及肝功能异常。通过免疫组化可以发现实验组肿瘤组织有更多的CD3T细胞浸润,肿瘤组织及骨骼肌有更多的His标签蛋白出现,而对照组肿瘤有更多的FOXP3浸润,凋亡检测可发现实验组有更多肿瘤细胞发生凋亡。结论:通过肌注质粒使骨骼肌细胞原位表达PD-1和ctla-4单链抗体来治疗小鼠黑色素瘤,显示良好的治疗效果和可控的安全性,且免疫联合治疗效果最佳,用该体系来治疗黑色素瘤,是一个全新的策略和探索性的工作,该研究在理论和应用方面均有很好的创新性。

关键词：免疫治疗 PD-1 ctla-4 骨骼肌原位基因表达