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基于CRISPR/Cas系统的病原核酸检测技术研究进展

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浙江大学学报(农业与生命科学版) 2023年第5期49卷 618-632页

作者：李红招王浩尹睿乐敏李艳浙江大学海南研究院浙江大学动物科学学院动物预防医学研究所/浙江省动物预防医学重点实验室

作为一种古老的细菌和古菌免疫系统，规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白[clustered regularly interspaced short palindromic repeats (crispr)/crispr-associated protein (cas), crispr/cas]系统现已发展为新兴的热门基因编辑工具，极大地推动了其他多个生物学相关领域的发展。其中，通过结合CRISPR/Cas系统与核酸恒温扩增技术建立了一些新型的高效、灵敏、不依赖仪器设备的检测方法，如DNA内切酶靶向的crispr反式报告系统（DNA endonuclease-targeted crispr trans-reporter, DETECTR）、特异性高灵敏度的酶报告器系统（specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking, SHERLOCK）等，不但提高了CRISPR/Cas系统在不同应用场景下的检测性能，更进一步激发了其在现场检测中的应用潜力。本文基于近年来被广泛应用的3种CRISPR/Cas系统（crispr/cas9、crispr/cas12a以及crispr/cas13）的生物核酸检测方法，阐述了CRISPR/Cas系统的生物学意义及一般作用原理，并通过回顾以往开展的CRISPR/Cas系统相关的病原检测研究，比较分析了不同检测系统的特点以及在实际应用过程中可能存在的不足，为针对不同病原在不同应用场景下建立更加高效、合理的CRISPR/Cas系统检测方法提供了有益参考。

关键词： CRISPR/Cas系统 cas蛋白病原核酸检测方法

CRISPR/Cas系统在抗细菌感染领域的应用现状与进展

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药学学报 2023年第9期58卷 2560-2568页

作者：孙宗倜孙琅游雪甫中国医学科学院、北京协和医学院医药生物技术研究所抗感染药物研究北京市重点实验室北京100050

crispr/cas基因编辑技术是21世纪分子生物学领域的一次重大突破,该技术的便捷性、通用性、靶向性将其应用的范围推向各个领域。在目前细菌耐药形势严峻、耐药菌检测手段局限、抗感染药物研发缓慢的全球大背景下,crispr/cas基因编辑技术... 详细信息

crispr/cas基因编辑技术是21世纪分子生物学领域的一次重大突破,该技术的便捷性、通用性、靶向性将其应用的范围推向各个领域。在目前细菌耐药形势严峻、耐药菌检测手段局限、抗感染药物研发缓慢的全球大背景下,crispr/cas基因编辑技术为抗细菌感染领域的发展提供了一些新的思路。一方面,crispr/cas基因编辑技术有助于对细菌功能研究的展开,起到工具箱的作用,如利用cas蛋白和外源修复系统实现高效、精准的基因编辑,ncas蛋白和脱氨酶系统实现无模板、单碱基精准编辑,dcas蛋白和反转录酶实现免修复基因编辑,以及dcas蛋白和改造后的sgRNA实现基因表达水平调控、基因功能解析。另一方面,它特异性识别基因、靶向切割DNA的特点可用于病原体检测、消除耐药菌及耐药基因,有望成为临床诊断和治疗的新策略。

关键词： CRISPR/Cas系统基因编辑细菌耐药治疗

CRISPR/Cas系统对金黄色葡萄球菌耐药及毒力基因的影响

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华南农业大学学报 2023年第2期44卷 179-186页

作者：谢龙飞肖丹瑜常依张旭财李小申熊文广广东省兽药研制与安全评价重点实验室/国家兽药安全评价(环境评估)实验室/国家兽医微生物耐药性风险评估实验室/华南农业大学兽医学院/岭南现代农业科学与技术广东省实验室广东广州510642

【目的】了解金黄色葡萄球菌(以下简称“金葡菌”)Staphylococcus aureus中成簇的规律间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,crispr)的分布情况,分析其对抗生素耐药基因和毒力基因水平转移的... 详细信息

【目的】了解金黄色葡萄球菌(以下简称“金葡菌”)Staphylococcus aureus中成簇的规律间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,crispr)的分布情况,分析其对抗生素耐药基因和毒力基因水平转移的影响。【方法】从公共数据库获取组装完整的金葡菌基因组575个,利用生物信息学方法,统计crispr结构的携带情况,菌株多位点序列分型(Multi-locus sequence typing,MLST)型别分布和菌株耐药基因、毒力基因的分布情况;对crispr结构阳性(crispr+)和crispr结构阴性(crispr-)的金葡菌耐药基因和毒力基因携带数目进行差异显著性分析。同时对实验室60株金葡菌二代测序数据进行分析,验证公共数据库分析结果。对实验室60株金葡菌中原噬菌体、接合质粒的携带情况进行统计,讨论crispr结构对菌株原噬菌体和接合质粒的影响。【结果】基因组组装完整的575株金葡菌中,有62株携带crispr结构(crispr+),513株不携带crispr结构(crispr-);crispr+金葡球菌携带耐药基因、毒力基因的数目显著小于crispr-金葡菌。实验室60株金葡菌中,有14株为crispr+,46株为crispr-;crispr+金葡菌携带更少的耐药基因和毒力基因,与公共数据库分析结果一致。对原噬菌体和接合质粒的分析结果显示,crispr-菌株携带更多的原噬菌体序列,与crispr+菌株之间差异显著(Pcrispr-和crispr+菌株无显著性差异。【结论】crispr结构可能限制了金葡菌中耐药基因和毒力基因的水平转移,crispr-菌株更容易受到噬菌体和可移动质粒的干扰。本研究为进一步研究金葡菌耐药基因和毒力基因的传播提供了参考。

关键词：金黄色葡萄球菌 CRISPR/Cas系统耐药基因毒力基因

CRISPR/Cas系统在新型冠状病毒分子检测中的应用研究进展

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中华实验和临床病毒学杂志 2023年第1期37卷 112-119页

作者：罗美惠王文玲谭文杰中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所北京102206

新型冠状病毒(2019 novel coronavirus, 2019-nCoV)引发的新型冠状病毒肺炎(Coronavirus Disease 2019, COVID-19)疫情已造成全球严重的公共卫生问题。2019-nCoV变异株不仅毒力发生变化, 传播力增强, 这些特性的改变已引发持续关注。快... 详细信息

新型冠状病毒(2019 novel coronavirus, 2019-nCoV)引发的新型冠状病毒肺炎(Coronavirus Disease 2019, COVID-19)疫情已造成全球严重的公共卫生问题。2019-nCoV变异株不仅毒力发生变化, 传播力增强, 这些特性的改变已引发持续关注。快速、准确、有效的检测方法对于COVID-19疫情防控至关重要。基于成簇规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, crispr)及相关蛋白(crispr-associated, cas)的核酸检测方法具有特异性强、灵敏度高、快速、便携、价廉的特点, 在2019-nCoV分子检测中显示出较好的应用前景。本文对CRISPR/Cas系统在2019-nCoV检测中的应用进行了综述, 以期为疫情防控提供参考。

关键词：新型冠状病毒新型冠状病毒肺炎 CRISPR/Cas系统检测

空肠弯曲菌CRISPR/Cas系统的研究进展

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微生物学报 2022年第7期62卷 2455-2465页

作者：吕泓玥臧筱琦黄萍瑜焦新安黄金林扬州大学江苏省人兽共患病学重点实验室江苏扬州225009 农业农村部农产品质量安全生物性危害因子(动物源)控制重点实验室江苏扬州225009

多数细菌都存在发挥免疫防御机制作用的CRISPR/Cas系统,在不同种属间呈现多态性。空肠弯曲菌是全球范围内重要的食源性病原菌,所致疾病也是典型的自限性疾病,其复杂的致病机制并未得到明确的解析,而空肠弯曲菌CRISPR/Cas系统的结构呈现... 详细信息

多数细菌都存在发挥免疫防御机制作用的CRISPR/Cas系统,在不同种属间呈现多态性。空肠弯曲菌是全球范围内重要的食源性病原菌,所致疾病也是典型的自限性疾病,其复杂的致病机制并未得到明确的解析,而空肠弯曲菌CRISPR/Cas系统的结构呈现多态性,研究两者关系仍存在诸多限制。本文从CRISPR/Cas系统在空肠弯曲菌中的结构、机制及技术应用等方面的研究进展进行综述,为探索空肠弯曲菌致病机制提供新思路。

关键词：空肠弯曲菌 CRISPR/Cas系统结构免疫防御

CRISPR/Cas系统在基因修饰植物及其产品检测应用中的原理和进展

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中国稻米 2023年第6期29卷 21-27页

作者：王渭霞朱廷恒赖凤香万品俊魏琪傅强中国水稻研究所/水稻生物育种全国重点实验室杭州310006 浙江工业大学生物工程学院杭州310014

转基因及基因编辑的基因修饰植物发展迅猛,相关的检测技术也面临更多挑战,尤其是对于无外源DNA引入的基因编辑产品,其检测难度更高,传统的检测技术已无法满足。基于crispr/cas检测系统中不同cas蛋白所具有的附属非特异切割活性被广泛应... 详细信息

转基因及基因编辑的基因修饰植物发展迅猛,相关的检测技术也面临更多挑战,尤其是对于无外源DNA引入的基因编辑产品,其检测难度更高,传统的检测技术已无法满足。基于crispr/cas检测系统中不同cas蛋白所具有的附属非特异切割活性被广泛应用于分子检测领域,它与LAMP和RPA等温扩增相结合可实现准确快速的现场检测,甚至是对单核苷酸突变的基因编辑产品识别和检测。但是,该检测系统在植物基因修饰产品检测中的应用才刚刚起步,本文对该检测系统的原理及其在基因修饰的植物及其产品中的应用进行了评述。

关键词： CRISPR/Cas系统分子检测转基因基因编辑基因修饰植物

基于CRISPR/Cas系统的黑曲霉基因组编辑技术

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生物工程学报 2021年第3期37卷 980-990页

作者：郑小梅郑平孙际宾中国科学院天津工业生物技术研究所天津300308 中国科学院系统微生物工程重点实验室天津300308 中国科学院大学北京100049 国家合成生物技术创新中心天津300308

黑曲霉Aspergillus niger是有机酸与酶制剂的重要工业生产菌株,以极端环境耐受性、高生产经济性、强发酵鲁棒性与高食品安全性等优势成为不可多得的细胞工厂。合成生物学与系统生物学的快速发展,不仅拉开了全面揭示黑曲霉细胞工厂高效... 详细信息

黑曲霉Aspergillus niger是有机酸与酶制剂的重要工业生产菌株,以极端环境耐受性、高生产经济性、强发酵鲁棒性与高食品安全性等优势成为不可多得的细胞工厂。合成生物学与系统生物学的快速发展,不仅拉开了全面揭示黑曲霉细胞工厂高效运转机制的序幕,而且为高效黑曲霉细胞工厂的创建优化提供了新技术体系。作为新一代的基因组编辑技术,基于CRISPR/Cas系统的基因组编辑技术为黑曲霉基因组定向改造与基因表达调控带来了革命性突破。本文重点综述该技术在黑曲霉中的最新进展及其在黑曲霉基因编辑与表达调控中的应用,并对其未来发展方向进行展望。

关键词：黑曲霉细胞工厂 CRISPR/Cas系统基因组编辑

细菌中CRISPR/Cas系统的应用和优化

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生物工程学报 2019年第3期35卷 341-350页

作者：傅俊豪杨发誉谢海华谷峰温州医科大学眼视光学院眼视光学和视觉科学国家重点实验室浙江温州325027

成簇规律间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,crispr)系统在近年来得到越来越广泛的应用。相比传统的基因组编辑技术,CRISPR/Cas系统具有编辑效率高、特异性强、花费低、对实验技术要求低... 详细信息

成簇规律间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,crispr)系统在近年来得到越来越广泛的应用。相比传统的基因组编辑技术,CRISPR/Cas系统具有编辑效率高、特异性强、花费低、对实验技术要求低等优势。其中Ⅱ型和Ⅴ型CRISPR/Cas系统分别仅需要单个cas9蛋白和单个Cpf1蛋白作为切割双链DNA的工具,因此特别受到研究者们的青睐。目前crispr/cas9技术已成功应用于斑马鱼、小鼠、人类细胞等真核生物的基因组编辑中,并取得一系列重要成果,但在细菌领域进行的相关研究并不多。文中将简单描述CRISPR/Cas系统及其作用机制,重点介绍该系统的优化以及近年来其在细菌学领域所取得的进展。

关键词： CRISPR/Cas系统细菌基因组编辑优化

基于CRISPR/Cas系统的新型荧光传感器构建及其应用于癌症标志物检测

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基于CRISPR/Cas系统的新型荧光传感器构建及其应用于癌症标志物检...

作者：朱志学济南大学

学位级别：硕士

全球每天有上万人饱受癌症折磨,癌症是当前人类健康最大的威胁,同时也是当今医学与科学界亟需攻克的难题。由于发病早期的隐蔽性,多数癌症发现即为中晚期,阻碍了疾病的治疗、给患者家庭带来了极大的精神负担和物质负担。目前癌症的早期... 详细信息

全球每天有上万人饱受癌症折磨,癌症是当前人类健康最大的威胁,同时也是当今医学与科学界亟需攻克的难题。由于发病早期的隐蔽性,多数癌症发现即为中晚期,阻碍了疾病的治疗、给患者家庭带来了极大的精神负担和物质负担。目前癌症的早期诊断主要通过对癌症标志物进行检测,但是多数癌症标志物含量较少,且检测单个癌症标志物不能明确判断疾病的种类,传统的检测方法在检测癌症标志物时有着很大局限性。因此,开发高灵敏度、高特异性、通用的新型快速检测方法对疾病预防以及早期诊断有重要意义。CRISPR/Cas系统是生物传感领域新兴的识别和信号放大方法,其在灵敏度、特异性和反应速率方面具有显著优势。本论文主要利用CRISPR/Cas系统的激活特点,设计了不同的激活方式,从而实现对三磷酸腺苷（ATP）、谷胱甘肽（GSH）、Fpg糖基化酶以及癌细胞外泌体表面蛋白的超灵敏检测。本论文的主要内容概括如下:第一部分,构建了一种向导RNA（cr RNA）回路用于激活crispr/cas12a活性的通用型荧光生物传感器实现对ATP、GSH、Fpg糖基化酶的检测。通过设计三种cr RNA锁,由不同的目标物解锁释放cr RNA,最终激活cas12a蛋白的反式切割活性,产生荧光。同时为了进一步扩展该通用型荧光生物传感器在生物运算中的应用,三种cr RNA锁被用于构建逻辑门,对多种目标物进行同时检测。这种通用性荧光生物传感器的意义在于大大增加了检测的准确性,只需修改不同的适配体即可实现不同物质的检测,为CRISPR/Cas系统在荧光生物传感中的应用开辟了新思路。第二部分,开发了一种基于crispr/cas12a系统的外泌体表面蛋白图谱构建方法。通过适配体识别一种通用蛋白CD63和某种特异性细胞表面蛋白进行双绑定,起始催化发夹自组装反应（CHA）进而激活crispr/cas12a-cr RNA1的一级信号放大,同时释放被封闭的cr RNA2,激活二级信号放大,由此构成协同增强的信号放大反应。这种协同增强反应比只存在一级信号放大的反应所需检测时间少,双绑定的方法减少背景信号,提高检测的准确性,同时为不同癌细胞的检测提供了参考方法。

关键词： CRISPR/Cas系统荧光生物感器癌症标志物逻辑门蛋白图谱