基于CRISPR/Cas系统的新型荧光传感器构建及其应用于癌症标志物检测

作     者：朱志学 

作者单位：济南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：黄加栋

授予年度：2022年

学科分类：0710[理学-生物学] 1002[医学-临床医学] 07[理学] 071007[理学-遗传学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：CRISPR/Cas系统 荧光生物感器 癌症标志物 逻辑门 蛋白图谱 

摘      要：全球每天有上万人饱受癌症折磨,癌症是当前人类健康最大的威胁,同时也是当今医学与科学界亟需攻克的难题。由于发病早期的隐蔽性,多数癌症发现即为中晚期,阻碍了疾病的治疗、给患者家庭带来了极大的精神负担和物质负担。目前癌症的早期诊断主要通过对癌症标志物进行检测,但是多数癌症标志物含量较少,且检测单个癌症标志物不能明确判断疾病的种类,传统的检测方法在检测癌症标志物时有着很大局限性。因此,开发高灵敏度、高特异性、通用的新型快速检测方法对疾病预防以及早期诊断有重要意义。CRISPR/Cas系统是生物传感领域新兴的识别和信号放大方法,其在灵敏度、特异性和反应速率方面具有显著优势。本论文主要利用CRISPR/Cas系统的激活特点,设计了不同的激活方式,从而实现对三磷酸腺苷（ATP）、谷胱甘肽（GSH）、Fpg糖基化酶以及癌细胞外泌体表面蛋白的超灵敏检测。本论文的主要内容概括如下:第一部分,构建了一种向导RNA（cr RNA）回路用于激活CRISPR/Cas12a活性的通用型荧光生物传感器实现对ATP、GSH、Fpg糖基化酶的检测。通过设计三种cr RNA锁,由不同的目标物解锁释放cr RNA,最终激活Cas12a蛋白的反式切割活性,产生荧光。同时为了进一步扩展该通用型荧光生物传感器在生物运算中的应用,三种cr RNA锁被用于构建逻辑门,对多种目标物进行同时检测。这种通用性荧光生物传感器的意义在于大大增加了检测的准确性,只需修改不同的适配体即可实现不同物质的检测,为CRISPR/Cas系统在荧光生物传感中的应用开辟了新思路。第二部分,开发了一种基于CRISPR/Cas12a系统的外泌体表面蛋白图谱构建方法。通过适配体识别一种通用蛋白CD63和某种特异性细胞表面蛋白进行双绑定,起始催化发夹自组装反应（CHA）进而激活CRISPR/Cas12a-cr RNA1的一级信号放大,同时释放被封闭的cr RNA2,激活二级信号放大,由此构成协同增强的信号放大反应。这种协同增强反应比只存在一级信号放大的反应所需检测时间少,双绑定的方法减少背景信号,提高检测的准确性,同时为不同癌细胞的检测提供了参考方法。