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Co-transformation to tobacco of cre/lox site-specific recombination system and its precise recombination

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Chinese Science Bulletin 2000年第6期45卷 540-543页

作者： Lei Li Songmei Liu Yuanlei Hu Zhongping Lin Peking Univ Natl Lab Prot Engn & Plant Genet Engn Beijing 100871 Peoples R China

For the temporally and spatially regulated expression of the barnase gene in plant, two kinds of plasmids with ere gene and its directly repeat recognition sites lox from bacteriophage P1 were constructed and co-transformed into tobacco by agrobacterium mediated procedure. The transgenic plants were conformed by PCR analysis. The blocking fragment between the two lox directly repeat sites was excised by cre protein in the transgenic plant genome. Cloning and seguencing the DNA fragment from the co-transformed plant DNA showed that the precise DNA excision occurred in transgenic tobacco genome directed by cre//ox site-specif ic recombination .

关键词： cre/lox site-specific recombination system tobacco co-transformation precise recombination.

Marker gene excision in transgenic Brassica napus via Agrobacterium-mediated cre/lox transient expression system

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Oil Crop Science 2020年第2期5卷 96-103页

作者： Pandi Wang Xiaojuan Xiong Ping Fu Gang Wu Fang Liu Key Laboratory of Biology and Geneics Improvement of Oil Crops Ministry of Agriculture and Rural AffairsOil Crops Research InstituteChinese Academy of Agricultural SciencesWuhanChina

Oilseed rape(Brassica napus L.)is one of the most important oil crops in the ***,study on marker-free transgene of *** for bio-safety purpose is limited in this allotetraploid *** order to advance marker gene excision research,a newly designed cre/lox system combining crossing and auto-excision strategy was introduced into *** system consists of 2 sets of independent vectors including pC35 Spro::T7 RP carrying T7 RNA polymerase and pCT7 pro::cre carrying T7 promoter *** hybridization of 2 according types of transgenic ***,marker gene would be removed as T7 RNA polymerase facilitate T7 promoter to promote cre gene *** 52 and 46 positive To transgenic lines of these 2 vectors were obtained after identification by PCR and test trip.T1 plants from 3 T0 positive pC35 Spro::T7 RP lines and 2 T0 positive pC35 Spro::T7 RP lines were identified as single copy according to segregation ratio and were chosen for ***,expression of CP4 EPSPS(glyphosate resistance gene)and OXY(bromoxynil resistance gene)were not found in F1 progeny,which proved that the excision was not *** possible reasons for our limited success were investigated and detailed analyses were *** this system is not applicable for generating transgenic *** free from selectable marker gene,it provided valuable experience and clue for further improvement of this *** other advantages and further improvement will be progressed in future work.

关键词： Brassica napus Marker-free cre/lox Cross Auto-excision Herbicide resistance

利用cre／lox重组系统在转基因动物中筛选高效表达外源基因的“友好”基因座

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高技术通讯 2004年第12期14卷 43-49页

作者：桑璐郭英任立明安晓荣候健关宏陈永福中国农业大学生物学院农业生物技术国家重点实验室，北京100094

本实验的目的是利用cre／lox重组系统进行“友好”基因座的筛选，即利用一个两端带有lox位点的标记基因去转染动物细胞或生产转基因动物，获得可以高效表达外源基因的“友好”基因座。一旦筛选到好的基因座，就建成了一个可以在动物体... 详细信息

本实验的目的是利用cre／lox重组系统进行“友好”基因座的筛选，即利用一个两端带有lox位点的标记基因去转染动物细胞或生产转基因动物，获得可以高效表达外源基因的“友好”基因座。一旦筛选到好的基因座，就建成了一个可以在动物体稳定地高效表达外源基因的技术平台。为此，利用野生型loxP位点和含有一个点突变的lox511位点分别构建两个载体pSL-loxGFP和pSL-loxIFN。首先将含有GFP和新霉素基因的质粒pSL-loxGFP DNA转染牛胎儿成纤维细胞，并用G418筛选，挑选出发绿色荧光的细胞克隆。经增殖培养之后，再将含有鸡γ-干扰素基因的质粒pSL-loxIFN和含有cre重组酶基因的质粒pBS185 DNA共转染发荧光的细胞克隆，筛选出发生重组后不再发光的细胞克隆。用PCR法检测了两个不发荧光的细胞克隆及发荧光的细胞克隆，并使用质粒pSL-loxIFN、质粒pSL-loxGFP及牛基因组作为对照。检测结果显示，在cre重组酶的作用下，两个不发荧光的细胞克隆中，一个发生了基因置换，另一个发生了基因删除。以上实验表明，巧妙地用Cm／lox重组系统，可以构建一套使外源基因在动物体内定点地高效表达的技术体系。

关键词：细胞克隆 IFN 质粒筛选基因座动物体内共转染高效表达 cre/lox 外源基因

一种新的用于删除选择标记基因的cre／lox系统

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Acta Botanica Sinica 2004年第7期46卷 862-866页

作者：袁媛刘允军王涛中国农业大学农业生物技术国家重点实验室，北京100094

设计了一种新的诱导型cre/lox似系统，并在转基因烟草(Mcofiana tabacum L.)中进行了验证。在诱导剂的作用下，位于同向lox位点之间的选择标记基因(hpt)和重组酶基因(cre)在烟草愈伤组织中被删除。在该系统中，cre基因在玉米乙酰苯胺类... 详细信息

设计了一种新的诱导型cre/lox似系统，并在转基因烟草(Mcofiana tabacum L.)中进行了验证。在诱导剂的作用下，位于同向lox位点之间的选择标记基因(hpt)和重组酶基因(cre)在烟草愈伤组织中被删除。在该系统中，cre基因在玉米乙酰苯胺类化合物诱导启动：(In5-2)的控制下表达。对转基因后代的分子检测结果表明，不论是否加入了诱导剂，目的基因(gus)均被整合到烟草基因组中；在诱导剂处理的48株转基因烟草T0代中，45株的hpt基因被删除了。该系统只使用一个载体，克服了二次转化系统带来的问题。

关键词：乙酰苯胺类化合物诱导启动子(In5-2) cre/lox 无标记转基因烟草

cre/lox定位重组系统共转化烟草及其精确重组

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科学通报 1999年第21期44卷 2291-2295页

作者：李雷刘松梅胡鸢雷林忠平北京大学蛋白质工程及植物基因工程国家重点实验室北京100871

将噬菌体P1的cre/lox定位重组系统的cre基因和含lox识别位点的两种结构通过土壤农杆菌介导的共转化方法导入烟草 ,得到双抗阳性苗 .经PCR检测表明 ,共转化苗中已包含上述两种结构 ,实验证明cre/lox定位重组系统在共转化烟草中已进行cre... 详细信息

将噬菌体P1的cre/lox定位重组系统的cre基因和含lox识别位点的两种结构通过土壤农杆菌介导的共转化方法导入烟草 ,得到双抗阳性苗 .经PCR检测表明 ,共转化苗中已包含上述两种结构 ,实验证明cre/lox定位重组系统在共转化烟草中已进行cre酶介导的DNA删除 .对重组后的有关DNA片段进行再克隆 ,序列分析表明 ,cre/lox定位重组系统在烟草基因组中进行了精确的DNA重组反应 .

关键词： cre/lox 定位重组系统烟草共转化精确重组

cre/lox位点特异重组系统在植物基因工程中的应用

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生物技术通报 2012年第5期28卷 25-30页

作者：陈广东崔继哲付寅生弭晓菊哈尔滨师范大学生命科学与技术学院哈尔滨150025

cre/lox位点特异重组系统是植物基因工程中的重要工具,利用其可以在转基因植物中对目的基因实现精确删除和定点整合。概述cre/lox系统的基本结构及作用方式,并以基因删除和定点整合为重点,详细介绍该系统在这两方面的应用。

关键词： cre/lox 位点特异重组删除整合转基因植物

利用CRISPR/Cas9和cre/lox系统构建伪狂犬病毒双基因缺失活疫苗

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利用CRISPR/Cas9和Cre/lox系统构建伪狂犬病毒双基因缺失活疫苗

作者：梁勋华中农业大学

学位级别：硕士

伪狂犬病毒是α-疱疹病毒属成员,基因组由150kb左右的DNA双链构成。伪狂犬病毒感染猪只后会诱发宿主严重的传染性疾病,给全世界生猪养殖产业带来了巨大经济损失。虽然长期以来伪狂犬病毒疫苗得到了广泛应用并很好地控制了该病的流行,但... 详细信息

伪狂犬病毒是α-疱疹病毒属成员,基因组由150kb左右的DNA双链构成。伪狂犬病毒感染猪只后会诱发宿主严重的传染性疾病,给全世界生猪养殖产业带来了巨大经济损失。虽然长期以来伪狂犬病毒疫苗得到了广泛应用并很好地控制了该病的流行,但近年来伪狂犬病突然在我国经过疫苗免疫的猪场爆发并在全国范围内流行,成为目前我国生猪养殖业面临的最大危害之一,这表明传统疫苗失去了对伪狂犬病的免疫保护作用,更多研究报道也进一步说明该病毒的基因组或主要抗原基因已经发生变异。传统制备伪狂犬病毒多基因缺失活疫苗的方法需要逐步敲除多个毒力基因,并经过共几十轮的低熔点琼脂糖空斑纯化,耗时耗力。因此亟需更高效经济的病毒疫苗制备策略来应对变异毒株的爆发和流行等问题。本课题构建了基于CRISPR/Cas9和cre/lox基因编辑系统的快速制备伪狂犬病毒双基因缺失活疫苗的新方法,同步敲除伪狂犬病毒变异毒株PRV-HNX的TK和gE两个毒力基因,成功制备了伪狂犬病毒双基因缺失活疫苗侯选株,对当下流行的伪狂犬病有较好的免疫保护作用。主要步骤概括如下:1,利用CRISPR/Cas9和同源重组修复机制同时将绿色荧光蛋白(GFP)和红色荧光蛋白(mCherry)分别重组到PRV-HNX基因组gE和TK基因位点。2,利用单细胞流式分选和低熔点琼脂糖挑斑纯化得到PRV-ΔgE-ΔTK-GFP-mCherry重组毒。提取重组毒基因组DNA,PCR鉴定重组病毒是否纯化。3,再利用cre/lox重组系统将重组病毒基因组中GFP和mCherry基因敲除。再利用低熔点琼脂糖噬斑纯化PRV-HNX-ΔTK-ΔgE双基因缺失毒株,并提取病毒基因组DNA进行PCR鉴定是否为所需重组病毒。4,分别用小鼠和仔猪进行PRV-HNX-ΔTK-ΔgE毒株免疫保护实验。表明PRV-HNX-ΔgE-ΔTK毒株对我国新近流行的伪狂犬病毒有很好的免疫保护作用,可以作为防控伪狂犬疫苗侯选株。

关键词：伪狂犬病毒 CRISPR/Cas9 cre/lox 基因缺失活疫苗

cre/lox P系统介导的基因重组研究进展

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生物技术通报 2001年第5期17卷 8-12页

作者：屈彦纯邓昌彦刘建忠刘桂兰华中农业大学畜牧兽医学院武汉430070

由于具有时间、组织和位点特异性 ,cre重组酶介导的DNA重组已成为基因靶位操作的一个重要工具。概述了cre/loxP系统的作用特点 ,cre重组酶的结构和重组机制 ,表达载体构建及重组个体检测等方面的问题 ,重点介绍了cre/loxP系统在基因重... 详细信息

由于具有时间、组织和位点特异性 ,cre重组酶介导的DNA重组已成为基因靶位操作的一个重要工具。概述了cre/loxP系统的作用特点 ,cre重组酶的结构和重组机制 ,表达载体构建及重组个体检测等方面的问题 ,重点介绍了cre/loxP系统在基因重组研究中的应用及近来的发展与成就。

关键词： cre/lox P系统基因重组基因靶位操作介导

cre/lox系统介导的位点特异性重组技术及其应用

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生物技术通报 2000年第1期16卷 33-37页

作者：李卫郭光沁郑国锠兰州大学细胞生物学研究所兰州730000

　Ｃｒｅ／ｌｏｘ系统是源于Ｐ１噬菌体的一个ＤＮＡ重组体系，它能导致在特定的ＤＮＡ序列（ｌｏｘＰ位点）处发生定点重组。该系统可以将外源基因定点整合到染色体上或将特定ＤＮＡ片段删除；这种定位重组系统在遗传操作中发挥了重要... 详细信息

　Ｃｒｅ／ｌｏｘ系统是源于Ｐ１噬菌体的一个ＤＮＡ重组体系，它能导致在特定的ＤＮＡ序列（ｌｏｘＰ位点）处发生定点重组。该系统可以将外源基因定点整合到染色体上或将特定ＤＮＡ片段删除；这种定位重组系统在遗传操作中发挥了重要的作用。

关键词： cre/lox 定点整合特定基因删除基因克隆重组