利用CRISPR/Cas9和Cre/lox系统构建伪狂犬病毒双基因缺失活疫苗

作     者：梁勋 

作者单位：华中农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：曹罡

授予年度：2016年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：伪狂犬病毒 CRISPR/Cas9 Cre/lox 基因缺失活疫苗 

摘      要：伪狂犬病毒是α-疱疹病毒属成员,基因组由150kb左右的DNA双链构成。伪狂犬病毒感染猪只后会诱发宿主严重的传染性疾病,给全世界生猪养殖产业带来了巨大经济损失。虽然长期以来伪狂犬病毒疫苗得到了广泛应用并很好地控制了该病的流行,但近年来伪狂犬病突然在我国经过疫苗免疫的猪场爆发并在全国范围内流行,成为目前我国生猪养殖业面临的最大危害之一,这表明传统疫苗失去了对伪狂犬病的免疫保护作用,更多研究报道也进一步说明该病毒的基因组或主要抗原基因已经发生变异。传统制备伪狂犬病毒多基因缺失活疫苗的方法需要逐步敲除多个毒力基因,并经过共几十轮的低熔点琼脂糖空斑纯化,耗时耗力。因此亟需更高效经济的病毒疫苗制备策略来应对变异毒株的爆发和流行等问题。本课题构建了基于CRISPR/Cas9和Cre/lox基因编辑系统的快速制备伪狂犬病毒双基因缺失活疫苗的新方法,同步敲除伪狂犬病毒变异毒株PRV-HNX的TK和gE两个毒力基因,成功制备了伪狂犬病毒双基因缺失活疫苗侯选株,对当下流行的伪狂犬病有较好的免疫保护作用。主要步骤概括如下:1,利用CRISPR/Cas9和同源重组修复机制同时将绿色荧光蛋白(GFP)和红色荧光蛋白(mCherry)分别重组到PRV-HNX基因组gE和TK基因位点。2,利用单细胞流式分选和低熔点琼脂糖挑斑纯化得到PRV-ΔgE-ΔTK-GFP-mCherry重组毒。提取重组毒基因组DNA,PCR鉴定重组病毒是否纯化。3,再利用Cre/lox重组系统将重组病毒基因组中GFP和mCherry基因敲除。再利用低熔点琼脂糖噬斑纯化PRV-HNX-ΔTK-ΔgE双基因缺失毒株,并提取病毒基因组DNA进行PCR鉴定是否为所需重组病毒。4,分别用小鼠和仔猪进行PRV-HNX-ΔTK-ΔgE毒株免疫保护实验。表明PRV-HNX-ΔgE-ΔTK毒株对我国新近流行的伪狂犬病毒有很好的免疫保护作用,可以作为防控伪狂犬疫苗侯选株。