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中国免疫学杂志 2013年第11期29卷 1155-1160页

作者：黄新新陆承平孔繁德蔡强浙江清华长三角研究院生态环境研究所嘉兴314006 南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室南京210095 厦门出入境检验检疫局厦门361012

目的：克隆表达出桃拉综合征病毒（TSV）主要衣壳蛋白cp2蛋白,并通过对噬菌体随机肽库的淘选,得到与cp2蛋白结合的相关多肽,以探讨cp2蛋白与配体作用的特异位点。方法：根据重组质粒pMD-cp2的核苷酸序列,设计并合成了一对引物,扩增TSV ... 详细信息

目的：克隆表达出桃拉综合征病毒（TSV）主要衣壳蛋白cp2蛋白,并通过对噬菌体随机肽库的淘选,得到与cp2蛋白结合的相关多肽,以探讨cp2蛋白与配体作用的特异位点。方法：根据重组质粒pMD-cp2的核苷酸序列,设计并合成了一对引物,扩增TSV cp2基因高变区376~1 371 bp,扩增片段插入pET-32构建成原核表达载体pET-cp2。该重组载体在IPTG诱导下进行可溶性表达,SDS-PAGE电泳检测表达的cp2蛋白。以纯化的cp2蛋白作为筛选分子,对噬菌体展示12肽库进行亲和淘选。结果：原核表达出56 kD大小的cp2蛋白,对噬菌体12肽库4轮＂吸附-洗脱-扩增＂淘洗后,所得的噬菌体回收率逐步提高,由6.4×10-5上升到2.8×10-2,显示淘选过程对随机肽库有很好的富集效果。随机挑选第4轮淘筛后的36个单克隆噬菌体,ELISA鉴定有24个单克隆（66.6%）为强阳性。将这24个阳性克隆扩增、测序,推导随机多肽的氨基酸序列。分析发现,有7个克隆（克隆号2、6、7、9、18、20、33）完全一致,序列为HTSFCSTHLCLI,其它的几个克隆如克隆3及28序列为HCSNLFCSLDLP;克隆5为HCSHTLCALHVM;克隆26为HCNSWLcpLITD也与该7个克隆有相似的序列,经比对核心序列为HCS及LCL。结论：首次用重组的TSV cp2蛋白从噬菌体随机12肽库中筛选到特异结合的肽序列,其共有结构特征为明确cp2与结合蛋白的相互作用位点提供支持。

关键词：桃拉综合征病毒(TSV) cp2蛋白克隆表达噬菌体展示肽库配体

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十二指肠贾第虫cp1、cp2基因的原核表达及间接ELISA方法的建立

十二指肠贾第虫CP1、CP2基因的原核表达及间接ELISA方法的建立

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作者：陈明辉河南农业大学

学位级别：硕士

十二指肠贾第虫病是全球最流行的肠道寄生虫病之一,其罪魁祸首是以粪-口为传播途径的肉鞭门,动鞭纲,双滴虫目,六鞭科的贾第虫属的十二指肠贾第虫。该病的症状主要有以由腹泻引起的生长不良、体重减轻、生产力下降为主,肠外并发症还包括... 详细信息

十二指肠贾第虫病是全球最流行的肠道寄生虫病之一,其罪魁祸首是以粪-口为传播途径的肉鞭门,动鞭纲,双滴虫目,六鞭科的贾第虫属的十二指肠贾第虫。该病的症状主要有以由腹泻引起的生长不良、体重减轻、生产力下降为主,肠外并发症还包括认知功能低下、眼部病变、关节炎、过敏、低血钾性肌病、癌症等。据统计,每年约有1.84亿人受其影响,约10亿人面临疾病风险,在一些发展中国家,甚至有超过30%的人被感染。其包囊形式有一层厚厚的外壳,对各种消毒剂(如氯)具有中等的抵抗力,故更容易通过水传播发生大流行。目前该病没有疫苗,甲硝唑对其的有较好的治疗效果。根据以往研究,在滋养体阶段,Cat B基因表达量最高,而其表达的分泌型蛋白cp1、cp2更是发挥主要作用,因此推测cp1、cp2蛋白具有潜在开发抗原的价值。1、十二指肠贾第虫cp1、cp2基因的原核表达及蛋白纯化首先通过生物学分析了解cp1、cp2蛋白特点为后续试验奠定基础,再将构建成功的表达载体p ET-32a-cp1和p ET-32a-cp2转入Rosetta(DE3)感受态细胞进行原核表达,按照优化后的诱导浓度和诱导时间大量表达目的蛋白,再使用Ni-NTA亲和层析纯化带有His标签的重组蛋白,最终得到浓度0.52 mg/m L、0.48 mg/m L和纯度91.27%、93.33%的cp1、cp2重组蛋白。2、十二指肠贾第虫cp1、cp2蛋白的多克隆抗体的制备及鉴定设置合理的免疫程序免疫新西兰大白兔,ELISA法检测效价合格后颈动脉采血收取血清制备多克隆抗体,对多克隆抗体进行Western blot验证和免疫荧光定位验证,最终得到效价均达到128000以上、同时具备良好的免疫原性和反应原性的cp1、cp2蛋白多克隆抗体。3、十二指肠贾第虫cp1、cp2蛋白间接ELISA检测方法的建立使用抗cp1、cp2蛋白血清建立和优化间接ELISA的检测方法,并根据最佳优化条件检验其敏感性、特异性和重复性。抗cp1蛋白血清敏感性更强,最低可以检测到5μg/m L抗原,抗cp2蛋白血清最低可以检测到100μg/m L抗原;两者特异性均表现良好,重复性均表现良好,变异系数均小于10%。本实验以cp1、cp2基因作为研究对象,通过生物信息学对其进行分析,通过原核诱导表达和纯化得到cp1、cp2重组蛋白,并制备相应的多克隆抗体,然后以该抗体作为一抗建立检测抗原的间接ELISA方法,为以后更好的十二指肠贾第虫检测奠定基础。

关键词：十二指肠贾第虫 cp1蛋白 cp2蛋白原核表达 ELISA

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桃拉综合征病毒中国株ZHZC3全基因测序及分子结构预测

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中国病毒学 2006年第3期21卷 267-272页

作者：黄新新陆承平南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室江苏南京210095

设计8对引物分片段扩增桃拉综合征病毒中国分离株ZHZC3全基因组,病毒两末端序列采用末端快速扩增方法(RACE)获取。扩增产物克隆到pMD18-T载体并测序,用DNAstar软件拼接全序列及同源性比较。结果显示ZHZC3全序列除去3′poly(A)尾,由1020... 详细信息

设计8对引物分片段扩增桃拉综合征病毒中国分离株ZHZC3全基因组,病毒两末端序列采用末端快速扩增方法(RACE)获取。扩增产物克隆到pMD18-T载体并测序,用DNAstar软件拼接全序列及同源性比较。结果显示ZHZC3全序列除去3′poly(A)尾,由10202个碱基组成,有两个开放阅读框,分别编码2107和1011个氨基酸的聚蛋白。与美国参考株HI94相比,在编码区没有核苷酸的缺失和插入,但在5′UTR缺失3个A,两者整体核酸同源性达97.9%。ORF1中ZHZC3与HI94及巴西株(BLZ01)的核酸同源性分别为97.6%、97.7%,在ORF2中ZHZC3与HI94、BLZ01的核酸同源性则分别为98.3、97%。与国外株ORF2的部分序列比较发现:ZHZC3和中国台湾株均与美国株HI94同源性最高。克隆分析6株TSV中国大陆株主要结构蛋白cp2基因,发现其编码的氨基酸存在三个高变区,中国大陆株更有其独特的氨基酸变异模式,312(S),449(A),451(Q)和468(H)。表明该病毒的整体变异性不高,但中国的流行株已形成其自己的遗传演变特征。在此基础上,利用生物学软件对cp2蛋白功能域和三维结构进行了预测,为进一步分析cp2蛋白结构与功能关系奠定了基础。ZHZC3株是第一个测定全序列的TSV中国株。

关键词：桃拉综合征病毒(TSV) 基因组 cp2蛋白同源建模

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