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基于clic4/NLRP3炎症小体介导的焦亡探讨丹参素钠减轻脑微血管内皮细胞OGD/R损伤的机制

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基于CLIC4/NLRP3炎症小体介导的焦亡探讨丹参素钠减轻脑微血管内...

作者：张晓璐天津中医药大学

学位级别：硕士

背景脑缺血再灌注损伤常累及微血管内皮细胞,后者亦加重缺血再灌注损伤,二者形成恶性循环。NLRP3炎症小体激活介导的焦亡既是内皮细胞损伤的重要形式,也是炎症反应的主因。前期研究发现活血化瘀中药单体丹参素钠具有显著抗炎、改善脑缺... 详细信息

背景脑缺血再灌注损伤常累及微血管内皮细胞,后者亦加重缺血再灌注损伤,二者形成恶性循环。NLRP3炎症小体激活介导的焦亡既是内皮细胞损伤的重要形式,也是炎症反应的主因。前期研究发现活血化瘀中药单体丹参素钠具有显著抗炎、改善脑缺血再灌注损伤的作用。然其作用机制是否与抑制内皮细胞焦亡有关,尚未阐明。目的通过糖氧剥夺/复氧（OGD/R）干预脑微血管内皮细胞,体外模拟脑缺血再灌注损伤,诱导内皮细胞焦亡,明确丹参素钠抑制NLRP3炎症小体介导细胞焦亡的药效。在药效确切的基础上,通过蛋白芯片及细胞热位移分析确定丹参素钠的可能作用靶点;沉默候选基因以验证丹参素钠减轻细胞焦亡的作用机制及分子靶点,为丹参素钠的临床应用提供实验依据,拓展活血化瘀药物的作用内涵。方法1.复制OGD/R脑微血管内皮细胞模型,诱导焦亡发生并评价丹参素钠抑制其焦亡的药效通过OGD5h/R12h复制b End.3内皮细胞损伤模型,采用CCK8及LDH释放法评价模型;并通过Hoechst33342/PI染色、GSDMD免疫荧光染色观察该模型是否存在细胞焦亡现象;给予12.5、25、50μM的丹参素钠干预12h,通过CCK-8、LDH流出、Hoechst33342/PI双染、GSDMD荧光染色观察丹参素钠对脑微血管内皮细胞OGD/R损伤及细胞焦亡的影响,从而评价药效。2.丹参素钠基于NLRP3炎症小体抑制细胞焦亡的机制分析ELISA检测细胞上清液中促炎因子IL-1β、IL-18的分泌水平;蛋白印迹法检测NLRP3炎症小体蛋白（NLRP3、pro-Casp-1、Casp-1、ASC、IL-1β、IL-18）及细胞焦亡执行者（GSDMD-full、GSDMD-N）的蛋白表达水平。NLRP3+ASC免疫荧光双染评估细胞OGD/R损伤后NLRP3与ASC的共定位及表达情况,从而明确丹参素钠的抗焦亡作用是否与调控NLRP3炎症小体通路有关。3.丹参素钠抑制NLRP3炎症小体激活上游靶点的发现及验证采用人类蛋白质组芯片（Hu Prot?human protein microarray）检测丹参素钠与20000余种蛋白的结合力,并通过查阅文献确定clic4是丹参素钠抑制NLRP3炎症小体的潜在作用靶点。因此采用细胞热位移测定法（CETSA）验证clic4与丹参素钠的结合情况;RT-q PCR检测细胞中clic4的m RNA水平;蛋白印迹法检测clic4在全细胞、细胞质及细胞膜的蛋白表达水平;MQAE探针检测氯离子通道活性,评价丹参素钠对OGD/R诱导后,内皮细胞中clic4表达及氯离子流出的影响。并通过si RNA沉默clic4基因表达,观察沉默前后丹参素钠的药效及功能变化,从而明确丹参素钠减轻脑微血管内皮细胞OGD/R损伤的作用机制及分子靶点。结果1.OGD5h/R12h可诱导b End.3内皮细胞损伤,并存在明显的细胞焦亡CCK8实验观察细胞活力:b End.3内皮细胞经过OGD5h/R12h诱导后,OGD/R组的细胞存活率约为65%,较对照组比,其细胞活力降低（P＜0.01）;LDH流出实验观察细胞膜的损伤情况:b End.3内皮细胞经过OGD5h/R12h诱导后,OGD/R组的LDH流出量较对照组增加（P＜0.01）。综上发现,OGD5h/R12h可诱导b End.3内皮细胞损伤。通过采用hochest33342/PI双染结合GSDMD免疫荧光发现:b End.3内皮细胞经过OGD5h/R12h诱导后,OGD/R组的PI阳性细胞百分率及GSDMD荧光强度较对照组增加（P＜0.01）。说明b End.3内皮细胞OGD/R损伤模型中存在明显细胞焦亡现象。2.丹参素钠可抗焦亡且与调控NLRP3炎症小体有关在OGD/R诱导b End.3内皮细胞损伤后,12.5、25、50μM SDSS可增加细胞活力,且对细胞没有毒性,其中50μM SDSS较12.5μM SDSS相比有明显差异。12.5、25、50μM SDSS可减少PI/hochest33342阳性细胞的数量、GSDMD的荧光强度及LDH流出,50μM SDSS可抑制GSDMD-N蛋白表达,而对GSDMD-full无效。其中对于LDH流出量的检测,25、50μM SDSS较12.5μM SDSS相比有明显的差异。综上说明,丹参素钠有明显的抗焦亡作用,且以50μM为最佳剂量。在明确丹参素钠可以抗焦亡作用的前提下发现,12.5、25、50μM SDSS可减少IL-1β及IL-18的分泌,抑制NLRP3炎症小体相关蛋白NLRP3及ASC的表达。25、50μM SDSS可抑制NLRP3炎症小体相关蛋白IL-1β、IL-18及Casp-1的表达,且所有浓度的丹参素钠均对其前体无效。其中在ASC、IL-1β及IL-18的表达上,50μM SDSS较12.5μM SDSS相比有明显的差异;通过NLRP3与ASC免疫荧光双染发现,NLRP3与ASC

关键词：缺血再灌注损伤氧糖剥夺/复氧（OGD/R） NLRP3炎症小体丹参素钠焦亡 clic4

人胃癌组织中clic4基因表达与微卫星不稳定性的关系

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肿瘤防治研究 2016年第7期43卷 572-576页

作者：王秋兰薛永杰韩涛甘肃中医药大学临床医学院兰州730000 三爱堂医院病理科兰州730000

目的探讨微卫星DNA不稳定性在胃癌发生中的作用及其与clic4基因表达的关系。方法采用PCR、非变性聚丙烯酰凝胶电泳及银染法检测40例胃癌组织及其相应的手术切缘正常组织中D1S234、D1S199、D1S507的微卫星不稳定性（MSI）;同时用免疫组... 详细信息

目的探讨微卫星DNA不稳定性在胃癌发生中的作用及其与clic4基因表达的关系。方法采用PCR、非变性聚丙烯酰凝胶电泳及银染法检测40例胃癌组织及其相应的手术切缘正常组织中D1S234、D1S199、D1S507的微卫星不稳定性（MSI）;同时用免疫组织化学检测该40例及另外55例胃癌组织中clic4的表达。结果 D1S234、D1S199和D1S507阳性率分别为25%（10/40）、27.5%（11/40）和5%（2/40）。各组织病理类型之间差异无统计学意义（P〉0.05）。40例胃癌组织中,clic4在肿瘤实质阳性率为25%（10/40）,肿瘤间质阳性率为67.5%（27/40）,同时阳性率为15%（6/40）,同时阴性率为12.5%（5/40）。Spearman等级相关分析显示D1S199与clic4肿瘤实质阳性率呈正相关（r=0.137,P=0.042）,D1S507与clic4肿瘤间质阳性率呈负相关（r=-4.22,P=0.009）。95例胃癌组织中,clic4在肿瘤间质阳性率为72.6%（69/95）,肿瘤实质阳性率为51.6%（49/95）,同时阳性率为24.2%（23/95）。肿瘤间质阳性率明显高于肿瘤实质阳性率（χ^2=8.945,P=0.003）,肿瘤间质阳性病例主要为低分化及黏液腺癌,肿瘤实质阳性病例主要为高-中分化腺癌。随着肿瘤分化程度的降低,clic4间质阳性率增加。结论 D1S199与D1S507的MSI可能与胃癌的发生密切相关;clic4可能与胃癌的肿瘤间质成纤维化有关,促进了胃癌的演进。

关键词：胃癌 clic4 微卫星不稳定性

氙气对脑白质损伤新生大鼠脑组织clic4 mRNA表达的影响

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中华实用儿科临床杂志 2019年第7期34卷 542-545页

作者：张美艳尹向云姜红殷晓航王倩卞春晖张俏俏青岛大学附属医院新生儿科山东青岛266003 青岛市妇女儿童医院儿科山东青岛266000

目的探讨早产儿脑白质损伤(WMD)的发病机制及氙气的神经保护作用机制。方法将3日龄SD新生大鼠96只按照出生时间编号后采用随机数字表法随机分为空白对照组(24只)、WMD对照组(24只)、氙气干预A组(24只)和氙气干预B组(24只)。WMD对照组及... 详细信息

目的探讨早产儿脑白质损伤(WMD)的发病机制及氙气的神经保护作用机制。方法将3日龄SD新生大鼠96只按照出生时间编号后采用随机数字表法随机分为空白对照组(24只)、WMD对照组(24只)、氙气干预A组(24只)和氙气干预B组(24只)。WMD对照组及氙气干预2组予腹腔注射脂多糖(LPS)0.05mg/kg,并结扎右侧颈总动脉联合缺氧1h处理,建立WMD新生大鼠模型;空白对照组仅腹腔注射9g/L盐水(0.05mg/kg),不给予颈动脉结扎和缺氧处理。氙气干预A组和B组分别在模型建立后0、2h予500mL/L氙气吸入处理3h。各组分别于干预处理后0、24、48、72h采用随机数字表法随机各选取6只大鼠进行断头取脑,给予HE染色,髓鞘碱性蛋白(MBP)免疫荧光染色,实时定量聚合酶链反应检测脑组织中clic4mRNA的表达水平。结果1.脑组织病理:与空白对照组比较,WMD对照组右侧脑白质结构疏松、紊乱,可见核固缩、胞质疏松等改变;氙气干预2组也均可见上述表现,但较WMD对照组明显减轻,A、B2组间无明显差异。2.MBP测定:WMD对照组右侧脑白质MBP阳性细胞数量较空白对照组明显减少,但氙气干预2组MBP阳性细胞数量较WMD对照组明显增加。3.clic4mRNA表达水平:除了氙气干预A组的24h外,WMD对照组及氙气干预A组和B组右侧脑白质clic4mRNA的表达水平在其余时间点均高于空白对照组,差异均有统计学意义(均Pclic4mRNA的表达水平均明显降低,差异均有统计学意义(均Pclic4mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论WMD新生大鼠脑白质clic4mRNA表达水平明显升高,表明线粒体途径是WMD的病理过程之一;氙气早期干预可通过降低clic4mRNA的表达,减轻WMD,从而发挥神经保护作用。

关键词：脑白质损伤氙气大鼠,新生 clic4 少突胶质细胞前体细胞

clic4介导的成纤维细胞向肌成纤维细胞转化与结直肠癌转移关系的研究

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CLIC4介导的成纤维细胞向肌成纤维细胞转化与结直肠癌转移关系的...

作者：王宏伟南方医科大学

学位级别：硕士

研究背景与意义结直肠癌(colorectal cancer)是常见的消化道恶性肿瘤,世界每年新发病例102万,死亡约53万。90%以上的患者最终死于肿瘤转移,结直肠癌转移是导致结直肠癌患者低治愈率、高死亡率的主要原因,是结直肠癌防治的关键环节。阐... 详细信息

研究背景与意义结直肠癌(colorectal cancer)是常见的消化道恶性肿瘤,世界每年新发病例102万,死亡约53万。90%以上的患者最终死于肿瘤转移,结直肠癌转移是导致结直肠癌患者低治愈率、高死亡率的主要原因,是结直肠癌防治的关键环节。阐明结直肠癌转移机制,干预和治疗转移是有效提高结直肠癌患者生存率和治愈率的重要措施。肿瘤细胞要完成转移过程,必须经历从原发瘤脱落、进入血管和／或淋巴管、在循环中生存、黏附于继发器官微血管、渗出血管和／或淋巴管、进入继发器官组织、形成微转移瘤并诱发血管发生,最终形成转移瘤。肿瘤干细胞(cancer stem cells, CSC)是肿瘤内能够自我更新并能产生构成肿瘤全部细胞系的细胞亚群。针对CSC的起源和治疗策略研究已成为当今肿瘤研究热点。 CSC的分化、增殖形成肿瘤,除了CSC自身的生物学特性以外,还依赖于肿瘤原发部位微环境和转移靶器官微环境。维持CSC不对称分裂、避免向终末细胞分化的微环境,称为“niche",包括微环境中的内皮细胞、成纤维细胞、炎症细胞、平滑肌细胞、神经细胞和脂肪细胞等支持细胞及它们所产生细胞因子。2003年Fidler修正的“种子与土壤”假说已经明确提出了转移瘤的形成是靶器官微环境相关因子与转移细胞协同作用的产物,抗转移治疗不仅要靶向阻断肿瘤细胞的高转移特性,而且应该对抗微环境中适应肿瘤细胞生长、血管发生、侵袭和转移的多种细胞与细胞因子。因此,干预播散“种子”和“土壤”(包括原发部位微环境和转移部位微环境)必须二者兼顾,才可能防止和对抗恶性肿瘤转移。本研究为CSC和微环境协同作用研究中的一个子课题。在前期的研究中我们应用单细胞源性细胞亚系筛选策略,发现了由单一细胞起源的细胞亚系,侵袭和转移潜能不同,转移相关分子标签预示结直肠癌转移的不良预后;细胞亚系高转移特性与CD133表达增强有关,提示结直肠癌CSC转移潜能的异质性。我们还分离和鉴定出结直肠癌系HT29、SW480、SW620和LoVo细胞系的CSC克隆,并已成功的获得了22例结直肠癌患者新鲜原发癌组织中的CSC克隆,通过裸鼠盲肠原位移植实验性转移模型,共获得了176个MCSC和非转移CSC(non-metastatic cancer stem cells, non-MCSC)。通过2D-质谱分析这两类克隆表达蛋白谱的差异,鉴定出clic4(chlorideintracellular channel protein4)等9种蛋白质表达与MCSC相关。前期用免疫组化检测了clic4在413例具有10年完整临床随访资料的结直肠癌患者原发癌组织中的表达情况,发现仅有少量癌细胞表达(与CSC占肿瘤细胞群的1/1000-1/100相一致)clic4,且clic4的表达水平与术后转移有关,不表达clic4的患者预后明显好于表达clic4患者。 clic4调节肿瘤间质成纤维细胞转化为肌成纤维细胞,并且与肿瘤的进展有关,还通过调节肿瘤微环境促进肿瘤的侵袭和转移。肿瘤组织间质内成纤维细胞高表达clic4时,成纤维细胞胞浆内aSMA表达增高,细胞转分化为肌成纤维细胞,抑制卵巢癌间质成纤维细胞clic4的表达,肌成纤维细胞转分化率降低。将乳腺癌细胞与高表达clic4的成纤维细胞共同移植时,肿瘤细胞生长迅速。肿瘤生长过程中,间质内成纤维细胞、肌成纤维细胞及其所分泌的细胞因子是肿瘤局部微环境中的重要成分,癌细胞的外泌体(exosomes)中含有的TGFp可促进间质中肌成纤维细胞的转化,肌成纤维细胞分泌的细胞因子SDF-1能够诱导癌细胞的迁移。癌组织内的肌成纤维细胞参与肿瘤细胞的侵袭与血管重塑,clic4也可促进内皮细胞增生及诱导其演变成管状结构,通过提高细胞内液泡的酸化程度促进毛细血管形成。clic4可能是肿瘤浸润和转移过程中介导肿瘤细胞-间质相互作用信号轴的重要成分,但其具体机制仍需深入研究。综上所述,clic4参与调节肿瘤细胞的生长与分化,抑制肿瘤细胞的凋亡,还可能通过促进肿瘤间质内的成纤维细胞向肌成纤维细胞转化、促进肿瘤血管发生,维持肿瘤局部微环境的稳定性而影响肿瘤的侵袭和转移。因此,本研究拟通基因过表达和RNA干扰、不同clic4表达水平的肿瘤细胞诱导成纤维细胞的转分化、肿瘤细胞-成纤维细胞适应性侵袭和转移模型等系列研究,明确clic4调节结直肠癌的生长、分化、侵袭和转移的分子机制,使clic4成为对抗结直肠癌转移特性和对抗肿瘤微环境两个方面的重要靶向治疗候选分子,为实验性抗转移方案的建立和临床应用提供新靶标。针对clic4的靶向治疗,可能达到对抗结直肠癌转移特性和抗肿瘤微环境的双重目的,这正是当代抗肿瘤治疗／抗转移治疗的全新理念方法 1.结直肠癌肿瘤相关成纤维细胞的的分离、培养及其鉴定利用原代培养法从人结直肠癌手术标本中分离培养人结直肠癌相关成纤维细胞,取临床手术切除的肠癌标本剪取小块粘膜组织,剪碎冲洗后剪成1

关键词：结直肠癌转移 clic4 成纤维细胞

胃癌中clic4蛋白表达及白花蛇舌草总黄酮对其表达的影响

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临床与实验病理学杂志 2016年第6期32卷 681-684页

作者：王秋兰薛永杰韩涛甘肃中医药大学临床医学院兰州730000 三爱堂医院病理科兰州730000

目的探讨胃癌组织中clic4蛋白表达及白花蛇舌草总黄酮对其表达的影响。方法乙醇回流法提取白花蛇舌草总黄酮,标准曲线法测定其含量,AB-8大孔吸附树脂进行纯化,然后作用于胃癌细胞株BGC-823,Western blot法检测clic4蛋白表达,同时应用... 详细信息

目的探讨胃癌组织中clic4蛋白表达及白花蛇舌草总黄酮对其表达的影响。方法乙醇回流法提取白花蛇舌草总黄酮,标准曲线法测定其含量,AB-8大孔吸附树脂进行纯化,然后作用于胃癌细胞株BGC-823,Western blot法检测clic4蛋白表达,同时应用免疫组化法检测95例胃癌组织中clic4蛋白表达。结果 95例胃癌组织中,clic4在肿瘤间质阳性69例,阳性率为72.6%,肿瘤实质阳性49例,阳性率为51.6%,同时阳性者23例,阳性率为24.2%。肿瘤间质clic4阳性率明显高于肿瘤实质阳性率（χ2=8.945,P=0.003）,肿瘤间质阳性病例主要为低分化及黏液腺癌,肿瘤实质阳性病例主要为高~中分化腺癌。随着肿瘤分化程度的降低,clic4间质阳性率增加。对照组胃癌细胞株BGC-823clic4蛋白的相对含量为0.282±0.047,实验组9.375μg/ml白花蛇舌草总黄酮作用于胃癌BGC-823细胞24h及48h,clic4蛋白的相对含量分别为0.205±0.022和0.164±0.032,均明显低于对照组（P=0.001,P=0.000）;实验组24hclic4蛋白的相对含量明显高于48h（P=0.000）。结论clic4可能与恶性肿瘤间质的形成有关,促进胃癌的演进;白花蛇舌草总黄酮可能通过抑制clic4的表达,减少恶性肿瘤间质的形成,阻止肿瘤的浸润与转移。

关键词：胃肿瘤 clic4 白花蛇舌草总黄酮

14-3-3和clic4蛋白在U251细胞自噬中的相互作用

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中风与神经疾病杂志 2015年第5期32卷 449-451页

作者：袁兆新金笛张宏宇长春医学高等专科学校吉林长春130031 温州医科大学药学院浙江温州325035

目的通过饥饿诱导神经胶质瘤U251细胞发生自噬,探讨细胞clic4和14-3-3蛋白在饥饿条件下诱导自噬过程中的相互作用。方法通过Hoechst、14-3-3 epsilon、clic4染色于共聚焦显微镜下观察抑制clic4表达对于饥饿条件下,14-3-3 epsilon蛋白与C... 详细信息

目的通过饥饿诱导神经胶质瘤U251细胞发生自噬,探讨细胞clic4和14-3-3蛋白在饥饿条件下诱导自噬过程中的相互作用。方法通过Hoechst、14-3-3 epsilon、clic4染色于共聚焦显微镜下观察抑制clic4表达对于饥饿条件下,14-3-3 epsilon蛋白与clic4共定位的影响。通过Western Blot技术检测Beclin 1及14-3-3蛋白表达。免疫共沉淀技术检测14-3-3 epsilon蛋白与clic4蛋白的结合水平。结果共聚焦显微镜观察14-3-3 epsilon和clic4荧光染色结果显示,饥饿条件下,14-3-3 epsilon蛋白与clic4共定位显著增加,并广泛分布于胞浆及细胞核中。同时Western Blot结果表明抑制clic4表达能够引起14-3-3蛋白以及自噬相关蛋白Beclin1表达增加。饥饿条件下,14-3-3 epsilon蛋白与clic4共沉淀增强,而抑制clic4表达能够降低两者结合水平。结论 14-3-3epsilon蛋白与clic4的相互作用由于RNA干扰而减弱,促进了14-3-3蛋白水平上调,进而增强了14-3-3蛋白对Beclin1信号通路的调节,引起Beclin1表达增加,进一步激活饥饿条件下U251细胞自噬过程。

关键词： U251细胞自噬 14-3-3蛋白 clic4

谷氨酸与SAS对神经胶质瘤细胞clic4及凋亡相关基因的影响

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谷氨酸与SAS对神经胶质瘤细胞CLIC4及凋亡相关基因的影响

作者：白日壮延边大学

学位级别：硕士

目的:观察谷氨酸与SAS对神经胶质瘤细胞的影响,并探讨线粒体氯通道蛋白/clic4及凋亡相关基因的变化。方法:应用四氮唑（MTT）比色法检测神经胶质瘤细胞的活性;紫外分光光度法检测细胞内还原型谷胱甘肽含量及培养液上清LDH释放率;... 详细信息

目的:观察谷氨酸与SAS对神经胶质瘤细胞的影响,并探讨线粒体氯通道蛋白/clic4及凋亡相关基因的变化。方法:应用四氮唑（MTT）比色法检测神经胶质瘤细胞的活性;紫外分光光度法检测细胞内还原型谷胱甘肽含量及培养液上清LDH释放率;用RT-PCR法测定C6细胞Bcl-2、Bax、clic4、EAAT-3、mGlu4、mGlu6的mRNA的表达;用Western blotting法测定C6细胞Bcl-2、Bax、clic4、p38、EAAT-3的蛋白表达。结果:1.SAS及谷氨酸可分别引起C6细胞生存率降低,SAS和谷氨酸联合添加细胞与单独添加组比较,细胞生存率降低更明显;2.SAS添加细胞LDH释放率明显增高,而谷氨酸组没有变化;3.谷氨酸和SAS分别添加细胞GSH含量均降低,合加组降低更加明显;4.加药后SAS1.5mmol/L添加C6细胞Bcl-2mRNA水平低于对照组,Bax无明显趋势,谷氨酸30mmol/L和合加组添加C6细胞的clic4mRNA水平低于对照组,SAS添加C6细胞的EAAT-3mRNA表达降低,谷氨酸30mmol/L添加C6细胞的mGlu4和mGlu6的mRNA表达均降低;5.SAS添加C6细胞clic4、Bax和p38的蛋白表达高于对照组,而Bcl-2低于对照组,其它组无变化,SAS添加C6细胞组EAAT-3蛋白表达降低。结论:1.谷氨酸和SAS均可引起C6细胞损伤,谷氨酸与SAS合加细胞损伤更为明显;2.氧化应激造成的GSH耗竭可能是谷氨酸和SAS引起C6细胞损伤的主要机制之一;3.LDH升高,Bcl-2表达降低,Bax表达增高,提示SAS可能诱导细胞凋亡为主,而谷氨酸引起细胞损伤过程中,以上指标无明显变化,提示谷氨酸可能诱导细胞坏死为主;4.SAS上调了clic4表达,clic4可能与凋亡有关,p38表达增高,提示p38MAPK信号通路可能参与了SAS导致细胞损伤及凋亡过程的传导通路;5.SAS引起EAAT-3和谷氨酸引起mGlu4、mGlu6表达降低可能也参与了上述细胞损伤调节过程,SAS和谷氨酸分别降低了其转运体及代谢型谷氨酸受体的保护作用,但其具体机制有待于进一步研究。

关键词： C6细胞谷氨酸柳氮磺吡啶（SAS） clic4 Bcl-2 Bax p38 EAAT-3 mGlu4 mGlu6

氙气对3日龄新生大鼠脑白质损伤脑组织clic4 mRNA、Bcl-2蛋白表达的影响

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氙气对3日龄新生大鼠脑白质损伤脑组织CLIC4 mRNA、Bcl-2蛋白表达...

作者：赵吉秀青岛大学

学位级别：硕士

目的腹腔内注射脂多糖联合缺氧缺血制作3日龄新生大鼠脑白质损伤模型,并对脑白质损伤新生大鼠给予氙气干预。通过检测其脑组织中clic4 m RNA、Bcl-2蛋白的表达,探讨氙气对新生大鼠脑白质损伤的神经保护作用机制。方法将3日龄SD新生大鼠... 详细信息

目的腹腔内注射脂多糖联合缺氧缺血制作3日龄新生大鼠脑白质损伤模型,并对脑白质损伤新生大鼠给予氙气干预。通过检测其脑组织中clic4 m RNA、Bcl-2蛋白的表达,探讨氙气对新生大鼠脑白质损伤的神经保护作用机制。方法将3日龄SD新生大鼠120只随机分为空白对照组(n=24),脑损伤组(n=24)和氙气干预组(n=72)。空白对照组腹腔注射生理盐水(0.05mg/kg),仅游离右侧颈总动脉不做低氧处理;脑损伤组腹腔注射脂多糖(lipopolysaccharide,LPS,0.05mg/kg),游离并结扎右侧颈总动脉并进行低氧处理,但不进行氙气处理;氙气干预组腹腔注射LPS(0.05mg/kg),游离并结扎右侧颈总动脉并进行低氧处理及氙气吸入处理(50%氙气+30%氧气+20%氮气的充满20L恒温密闭箱,0.5L/min缓慢维持,持续处理3小时)。根据脑损伤后氙气延迟干预的时间(0小时、2小时和5小时),将氙气干预组分为C1、C2、C3三个亚组(n=24)。各组大鼠分别于0h、24h、48h、72h各取6只行多聚甲醛灌注后断头取脑组织,进行脑组织病理检测、蛋白质印迹法(Western Blot,WB)检测B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)蛋白含量、逆转录-聚合酶链反应(reverse transcriotion-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测氯离子通道蛋白4(Chloride Intracellular Channel 4,clic4)m RNA的表达。采用独立样本t检验、单因素方差分析和Bonferroni法进行统计学分析。结果(1)实验新生鼠行为学监测:腹腔注射脂多糖及缺氧缺血处理后,脑损伤组和氙气干预组的新生鼠出现肢体抖动、烦躁、紫绀、呼吸急促等行为学异常;在氙气处理之后,C1组新生鼠的症状在约2小时后消失;而脑损伤组、C2组和C3组的症状约在5小时后消失;空白对照组新生鼠未出现明显异常反应。(2)HE染色观察脑组织病理变化:脑损伤组新生鼠可见脑白质苍白,结构疏松,细胞肿胀,核膜不清楚,细胞核固缩,可检测到细胞变性和坏死,神经纤维无序,胶质细胞数量增加;氙气干预组脑白质染色淡染,结构相对较完整,较少细胞变性坏死,各亚组之间无明显差异;而空白对照组脑组织结构正常,染色清晰,细胞排列整齐。(3)WB检测Bcl-2蛋白含量:在相同时间点,各组Bcl-2蛋白的表达量相比较,差异有统计学意义(P48h和72h与脑损伤组比较差异无统计学意义(P>0.05);与C1组相比,C2组和C3组Bcl-2蛋白表达在48h和72h显著降低,差异有统计学意义(P4)RT-PCR检测clic4 m RNA含量:与空白对照组相比较,在各时间点脑损伤组中新生鼠脑室周围白质clic4 m RNA的表达水平增加,差异有统计学意义(Pclic4 m RNA表达均明显减少,差异有统计学意义(P4)氙气干预可下调clic4基因的表达,表明氙气可能通过抑制clic4基因的表达作用于Bcl-2蛋白相关途径抑制神经元凋亡而发挥神经保护作用;(5)氙气治疗脑白质损伤的时间窗至少有5小时,且越早干预效果越好。

关键词：氙气 clic4 LPS Bcl-2 缺氧缺血

氯离子通道CLC-2及clic4在糖尿病脑损伤中的作用及机制研究

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氯离子通道CLC-2及CLIC4在糖尿病脑损伤中的作用及机制研究

作者：王伟伟吉林大学

学位级别：硕士

目的:通过观察糖尿病时脑皮质水通道AQP4 mRNA、氯离子通道蛋白CLC-2和clic4、凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2水平表达变化,探讨糖尿病时脑损伤的机制。方法:将大鼠随机分为非糖尿病组和糖尿病组。50mg/kg链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)行左... 详细信息

目的:通过观察糖尿病时脑皮质水通道AQP4 mRNA、氯离子通道蛋白CLC-2和clic4、凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2水平表达变化,探讨糖尿病时脑损伤的机制。方法:将大鼠随机分为非糖尿病组和糖尿病组。50mg/kg链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)行左下腹腔一次性注射复制糖尿病模型。注射STZ后第72h,监测血糖,血糖大于16.7mmol/L,且有多饮、多食、多尿现象者,确定为糖尿病大鼠模型复制成功。模型建立成功后,常规饲养,每周称量体重,隔周检测血糖,共监测8周。第九周再次检测血糖,达到16.7mmol/L或以上者进入分组,未达到血糖指标者不进入分组。HE染色法观察大脑皮质的形态学改变;RT-PCR检测大脑皮质中水通道AQP4 mRNA的表达;Western blotting检测大脑皮质中Bax、Bcl-2、CLC-2和clic4的蛋白表达。结果:与非糖尿病组大鼠相比,糖尿病组大鼠血糖升高;神经元出现核质浓缩着色较深,胞体固缩等形态学改变;脑皮质水通道AQP4 mRNA水平下降;Bax/Bcl-2的比值明显升高;CLC-2、clic4的蛋白表达明显增强。结论:糖尿病时脑皮质出现损伤,水通道AQP4 mRNA表达下调,使脑内水分的清除受阻,加重糖尿病脑损伤。糖尿病时脑皮质CLC-2、clic4蛋白的表达增高通过线粒体途径引起大脑皮质神经细胞凋亡,造成脑损伤。

关键词：糖尿病脑损伤 AQP4 CLC-2 clic4