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基于TMT蛋白组学的硝酸铀酰诱导CHO-K1细胞损伤研究

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陕西科技大学学报 2023年第1期41卷 66-71,87页

作者：尹晶晶刘欢高洁王志鹏袁慧李建华李建国中国辐射防护研究院放射医学与环境医学研究所药物毒理与放射损伤药物山西省重点实验室中核集团放射毒理与放射性药物临床前评价重点实验室山西太原030006

应用蛋白组学技术筛选硝酸铀酰暴露诱导CHO-K1细胞损伤的差异表达蛋白,为铀毒性机制研究提供数据.CHO-K1细胞经500μmol/L硝酸铀酰染毒24 h,以差异倍数大于1.5倍,差异显著性小于0.05为标准,采用串联质谱标签(tandem mass tag,TMT)标记... 详细信息

应用蛋白组学技术筛选硝酸铀酰暴露诱导CHO-K1细胞损伤的差异表达蛋白,为铀毒性机制研究提供数据.CHO-K1细胞经500μmol/L硝酸铀酰染毒24 h,以差异倍数大于1.5倍,差异显著性小于0.05为标准,采用串联质谱标签(tandem mass tag,TMT)标记蛋白组学技术筛选差异表达蛋白,应用生物信息学技术对差异表达蛋白进行聚类分析、基因本体(Gene Ontology,GO)分析、京都基因与基因组百科全书(kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,kEGG)分析及蛋白相互作用分析.共鉴定出蛋白4772个,硝酸铀酰染毒组筛选出差异表达1.5倍以上的蛋白309个,其中164个表达上调,145个表达下调.GO分析结果显示差异表达的蛋白主要参与1086种生物过程、282种细胞成分以及377类分子功能.kEGG分析结果显示差异表达蛋白主要富集于40条信号转导通路,参与核糖体生物合成、RNA运输、辅因子代谢、Notch信号通路、吞噬体、染色体及相关蛋白、蛋白质外排、生理节律、IL-17信号通路、类脂物代谢等信号通路.差异蛋白相互作用网络分析结果显示蛋白RPS3A和RPS17的关联度最高.研究结果表明,CHO-K1细胞经500μmol/L硝酸铀酰染毒24 h后,蛋白发生差异表达,核糖体生物合成、RNA运输等多条信号通路发生改变,蛋白RPS3A和RPS17可能是硝酸铀酰暴露致CHO-K1细胞损伤的关键蛋白.

关键词：硝酸铀酰 CHO-K1细胞蛋白质组学生物信息学差异蛋白

长效重组人生长激素纯化液中CHO-K1细胞残留DNA实时荧光定量PCR检测方法的建立及验证

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中国生物制品学杂志 2019年第6期32卷 688-693页

作者：刘莹刘玉林俞露刘涵刘云南王莹刘琳琳王宇长春生物制品研究所有限责任公司

目的建立检测CHO-K1细胞表达长效重组人生长激素(Fc-recombinant human growth hormone,Fc-rhGH)纯化液中残留DNA的实时荧光定量PCR方法,并进行验证。方法提取CHO-K1细胞基因组DNA,特异性PCR扩增后,克隆至pMD18-T载体,构建重组质粒,以... 详细信息

目的建立检测CHO-K1细胞表达长效重组人生长激素(Fc-recombinant human growth hormone,Fc-rhGH)纯化液中残留DNA的实时荧光定量PCR方法,并进行验证。方法提取CHO-K1细胞基因组DNA,特异性PCR扩增后,克隆至pMD18-T载体,构建重组质粒,以其为标准品,建立实时荧光定量PCR检测方法;并对方法进行灵敏度、线性、准确度、精密度、特异性及耐用性验证。结果建立的方法灵敏度可达2. 6×10~1 copies/μL。标准曲线的回归方程为y=-3. 487 x+30. 201,R^2=0. 999;检测样品中DNA回收率在73. 56%~101. 87%范围内,RSD均小于10%;该方法可特异性扩增CHO-K1细胞的基因组DNA,而Vero细胞、MDCk细胞、Wish细胞及大肠埃希菌等基因组DNA均未见明显的扩增;样品精密度测定Ct的RSD在0. 4%~2. 95%之间;于两种不同PCR仪器上检测标准品,扩增效率分别为98%、99%,相关系数R^2均为0. 999。结论成功建立了一种检测CHO-K1细胞表达Fc-rhGH纯化液的残留DNA的实时荧光定量PCR方法,该方法具有较好的灵敏度、线性、准确度、精密度、特异性和耐用性。

关键词：实时荧光定量PCR 重组人生长激素 CHO-K1细胞残留DNA

重组绵羊FSH在CHO-K1细胞中的表达及其应用

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生物技术通报 2019年第12期35卷 112-117页

作者：王兴陇李倩马瑞仙李生军李向茸冯若飞西北民族大学生物医学研究中心生物工程与技术国家民委重点实验室兰州730030 西北民族大学生命科学与工程学院兰州730030

在CHO-K1细胞中分泌表达重组绵羊FSH及其生物活性初探。构建重组表达质粒pcDNA3.1-FSHβα,转染至全悬浮CHO-K1细胞中,经过G418加压筛选出表达量高的单克隆细胞,于生物反应器中扩大培养,并进行超滤浓缩,将浓缩后的重组绵羊FSH免疫小鼠,... 详细信息

在CHO-K1细胞中分泌表达重组绵羊FSH及其生物活性初探。构建重组表达质粒pcDNA3.1-FSHβα,转染至全悬浮CHO-K1细胞中,经过G418加压筛选出表达量高的单克隆细胞,于生物反应器中扩大培养,并进行超滤浓缩,将浓缩后的重组绵羊FSH免疫小鼠,测定小鼠卵巢重量并分析血清中黄体生成素和孕酮含量。成功构建了重组质粒pcDNA3.1-FSHβα,并成功在全悬浮CHO-K1细胞中实现分泌表达,表达量为297.97 ng/mL,注射重组绵羊FSH的小鼠卵巢重量显著增加,黄体生成素和孕酮含量均显著上调。重组绵羊FSH蛋白在CHO-K1细胞中成功表达,并具有一定的生物活性。

关键词：促卵泡激素 CHO-K1细胞生物反应器

rTNSALP-FcD10重组表达质粒的构建及在CHO-K1细胞的稳定表达

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中国生物制品学杂志 2019年第5期32卷 521-526页

作者：徐颖付加芳唐超韩金祥王世立济南大学山东省医学科学院医学与生命科学学院山东济南250022 山东省医药生物技术研究中心国家卫生部生物技术药物重点实验室山东省罕少见病重点实验室山东济南250062

目的构建重组表达质粒pcDNA3. 1-rTNSALP-FcD10及p EF1-rTNSALP-FcD10,获得能够稳定表达rTNSALP-FcD10蛋白的CHO-K1细胞株。方法去除重组人非组织特异碱性磷酸酶(tissue-nonspecific alkaline phosphatase,TNSALP)多钛链C端氨基酸连接IgG1的Fc片段及10个天冬氨酸,构建目的基因rhALP-FcD10,将基因分别克隆至pcDNA3. 1及p EF1/Myc-His B载体上,均转化E. coli DH5α细胞;将签定正确的两组重组质粒均转染CHO-K1细胞,进行G418压力筛选,建立稳定转染的CHO-K1细胞系,采用RT-qPCR及Western blot方法检测细胞中rTNSALPFcD10 mRNA转录水平及蛋白表达量。结果重组质粒pcDNA3. 1-rTNSALP-FcD10及pEF1-rTNSALP-FcD10经双酶切鉴定证明构建正确;G418最低致死浓度确定为800μg/m L;CHO-K1细胞中rTNSALP-FcD10 m RNA转录及蛋白水平均高于空白对照组,差异均有统计学意义(P CHO-K1细胞系,成功表达目的蛋白rTNSALP-FcD10,为蛋白进一步纯化奠定了良好的实验基础。

关键词：重组人非组织特异碱性磷酸酶 CHO-K1细胞转染稳定表达

淀粉微载体的制备及对CHO-K1细胞培养的初步应用

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天然产物研究与开发 2017年第3期29卷 454-460,516页

作者：张磊李明生郑荣张健靳冬武马忠仁冯玉萍西北民族大学生命科学与工程学院西北民族大学生物工程与技术国家民委重点实验室甘肃省动物细胞工程技术研究中心兰州730030

以普通市售马铃薯淀粉为原材料,在常温下利用W/O乳化方法制备了交联淀粉微球,并以二乙胺基乙基修饰了微球的表面电荷。同时研究了制备淀粉微球的制备工艺和改性工艺,成功制备了适合细胞培养用的淀粉微载体。利用扫描电镜(SEM)、红外(FT-... 详细信息

以普通市售马铃薯淀粉为原材料,在常温下利用W/O乳化方法制备了交联淀粉微球,并以二乙胺基乙基修饰了微球的表面电荷。同时研究了制备淀粉微球的制备工艺和改性工艺,成功制备了适合细胞培养用的淀粉微载体。利用扫描电镜(SEM)、红外(FT-IR)、X射线衍射仪(XRD)对微球进行了表征。结果表明,最佳制备条件为:淀粉溶液浓度为7%,搅拌速度为500 rpm,交联剂用量为8%,水油相体积比1∶6;微球表面修饰最佳条件为:加入微球质量2倍体积的3.5 mol/L NaOH溶液和2.5 mol/L DEAE-HCl溶液,60℃密闭反应4 h。对比Cytodex-1微载体,培养CHO-K1细胞至144 h时,淀粉微载体表面细胞密度达到1.8×10~6cells/mL,且两者培养效果相似,表明了自制淀粉微载体是一种潜在的贴壁细胞培养用高分子材料。

关键词：马铃薯淀粉淀粉微球二乙氨基乙基 CHO-K1细胞细胞培养

猪圆环病毒2型Cap蛋白在CHO-K1细胞系中的真核表达及鉴定

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猪圆环病毒2型Cap蛋白在CHO-K1细胞系中的真核表达及鉴定

作者：武乐祎郑州大学

学位级别：硕士

猪圆环病毒2型(PCV2)流行于世界各国猪群中,主要与断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、猪呼吸道疾病综合征(PRDC)、猪皮炎与肾病综合征(PDNS)、仔猪先天性震颤(CT)以及猪繁殖系统障碍等多种疾病密切相关,这些疾病被统称为猪圆环病毒相关疾... 详细信息

猪圆环病毒2型(PCV2)流行于世界各国猪群中,主要与断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、猪呼吸道疾病综合征(PRDC)、猪皮炎与肾病综合征(PDNS)、仔猪先天性震颤(CT)以及猪繁殖系统障碍等多种疾病密切相关,这些疾病被统称为猪圆环病毒相关疾病(PCVD),严重影响着世界养猪业的健康发展。目前,已知的猪圆环病毒包括三种,猪圆环病毒1型(PCV1)、2型(PCV2)和3型(PCV3)。其中,PCV2核衣壳蛋白Cap含有抗原中和表位,可产生针对PCV2的特异性抗体,是PCV2亚单位疫苗和血清诊断的主要目标蛋白,被大量应用于实际生产中。PCV2的抗体检测方法主要有ELISA、IPMA和IFA等,其中ELISA抗体检测方法具备操作简便,可同时检测大量样品等优点,得到科研机构和养殖场的普遍应用。本研究基于cho-k1真核表达系统,构建重组质粒pEE12.4-PCV2-Cap,转染CHO-K1细胞,通过加压筛选,有限稀释,得到能够高效表达Cap蛋白的单克隆细胞株,并对该细胞株进行悬浮驯化、发酵、纯化,得到目的蛋白通过Western blot以及动物免疫实验验证其免疫原性。结果表明PCV2-Cap蛋白能够在CHO-K1细胞中稳定表达;发酵过程中活细胞密度高达6.0×10个/mL,细胞活力在80%以上,PCV2-Cap蛋白表达量约为370 mg/L;并通过Western blot验证和间接ELISA检测方法的建立,证明了该蛋白具备良好的免疫原性。本研究成功构建了表达PCV2-Cap蛋白的cho-k1悬浮稳转细胞系,并初步建立了间接ELISA检测方法,为猪圆环病毒2型血清学检测方法的建立奠定了基础。

关键词：猪圆环病毒 Cap蛋白真核表达 CHO-K1细胞

CHO-K1细胞簇集法检测百日咳毒素毒性的优化及验证

同方学位论文库评论

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同方学位论文库

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中国生物制品学杂志 2015年第12期28卷 1344-1346页

作者：曹方刘海昌王磊马伟潘玲玲李强王良超胡文龙浙江卫信生物药业有限公司浙江宁波315600

目的对CHO-K1细胞簇集法检测百日咳毒素(pertussis toxin,PT)毒性进行优化及验证。方法以国家PT标准品为参考品,将PT标准品倍比稀释后与CHO-K1细胞混合培养,显微镜观察PT能引起CHO-K1细胞簇集的程度。对细胞浓度、孵育时间进行优化,并... 详细信息

目的对CHO-K1细胞簇集法检测百日咳毒素(pertussis toxin,PT)毒性进行优化及验证。方法以国家PT标准品为参考品,将PT标准品倍比稀释后与CHO-K1细胞混合培养,显微镜观察PT能引起CHO-K1细胞簇集的程度。对细胞浓度、孵育时间进行优化,并对方法的特异性、敏感度、重复性进行验证。结果方法的最佳细胞浓度为2.5×105个/ml,最佳孵育时间为24 h。只有PT活性成分能使CHO-K1细胞发生簇集,最低检测限为10 pg/ml;2名试验员6次检测结果表明,该方法重复性良好。结论 CHO-K1细胞簇集法可及时、准确地检测出生产过程中PT含量,适用于百日咳发酵过程监测。

关键词： CHO-K1细胞百日咳毒素簇集

人凝血因子Ⅶ在CHO-K1细胞中的表达与鉴定

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中国生物制品学杂志 2013年第6期26卷 822-824页

作者：肖薇赵睿李长清边国慧肖小璞林方昭中国医学科学院北京协和医学院输血研究所四川成都610052

目的在CHO-K1细胞中表达人凝血因子Ⅶ(human coagulation factorⅦ,hFⅦ)。方法利用脂质体转染法,将表达质粒pcDNA3.1-FⅦ和空载体pcDNA3.1分别转染CHO-K1细胞,经900μg/ml G418筛选抗性细胞株。收集细胞培养上清,采用ELISA法检测细胞... 详细信息

目的在CHO-K1细胞中表达人凝血因子Ⅶ(human coagulation factorⅦ,hFⅦ)。方法利用脂质体转染法,将表达质粒pcDNA3.1-FⅦ和空载体pcDNA3.1分别转染CHO-K1细胞,经900μg/ml G418筛选抗性细胞株。收集细胞培养上清,采用ELISA法检测细胞培养上清中rhFⅦ的水平;PT法检测细胞培养上清的凝血时间;Westernblot法检测细胞培养上清中rhFⅦ的表达。结果共获得3株抗性细胞,分别命名为cho-FⅦ01～03,空载体转染的细胞命名为cho-Ck;cho-FⅦ01～03细胞培养上清中均检测到了rhFⅦ,但含量均低于阳性对照;cho-Ck细胞培养上清的凝血时间分别为cho-FⅦ01～03细胞培养上清的2.4、2.1和3.1倍;cho-FⅦ01～03细胞培养上清中含目的蛋白rhFⅦ,相对分子质量约为50 000。结论成功在CHO-K1细胞中表达了hFⅦ,为下一步hFⅦ的深入研究及应用奠定了基础。

关键词：人凝血因子Ⅶ CHO-K1细胞稳定转染基因表达

稳定表达犬细小病毒VP2结构蛋白的CHO-K1细胞系的建立

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中国兽医学报 2010年第5期30卷 588-592页

作者：王微李秀锦王幸兴韩冬梅潘素敏仲飞河北农业大学动物科技学院基础兽医系河北保定071001

为构建犬细小病毒VP2基因分泌性表达细胞系,通过酶切将人CD5信号肽序列从质粒中切出,将其连接到真核表达载体pcDNA3.1A的多克隆位点上,构建成pcDNA3.1-CD5sp质粒。然后再通过PCR方法扩增犬细小病毒VP2基因,并将其插入到pcDNA3.1-CD5sp... 详细信息

为构建犬细小病毒VP2基因分泌性表达细胞系,通过酶切将人CD5信号肽序列从质粒中切出,将其连接到真核表达载体pcDNA3.1A的多克隆位点上,构建成pcDNA3.1-CD5sp质粒。然后再通过PCR方法扩增犬细小病毒VP2基因,并将其插入到pcDNA3.1-CD5sp载体中CD5信号肽的下游,使其与CD5信号肽序列融合,构建成VP2基因的真核分泌型表达载体pcDNA-CD5sp-VP2。经脂质体介导转染细胞,后通过G418筛选,建立出稳定表达VP2蛋白的CHO-K1细胞系。测序结果表明,构建的犬细小病毒VP2基因的分泌型表达载体结构正确,表达载体经脂质体介导转染CHO-K1细胞,通过G418加压,筛选出稳定转染VP2基因的细胞株,经PCR检测证明VP2基因已经整合到细胞的染色体中;经RT-PCR、Westernblot分别检测VP2基因表达的mRNA和VP2蛋白,证明犬细小病毒VP2基因能够在CHO-K1细胞进行稳定性表达。这为下一步研究犬细小病毒VP2蛋白与宿主细胞的相互作用及VP2DNA疫苗奠定了基础。

关键词：犬细小病毒 VP2蛋白 CHO-K1细胞稳定表达