长效重组人生长激素纯化液中CHO-K1细胞残留DNA实时荧光定量PCR检测方法的建立及验证

作     者：刘莹 刘玉林 俞露 刘涵 刘云南 王莹 刘琳琳 王宇 LIU Ying;LIU Yu-lin;YU Lu;LIU Han;LIU Yun-nan;WANG Ying;LIU Lin-lin;WANG Yu

作者机构：长春生物制品研究所有限责任公司 

出 版 物：《中国生物制品学杂志》 (Chinese Journal of Biologicals)

年 卷 期：2019年第32卷第6期

页      面：688-693页

学科分类：0710[理学-生物学] 0831[工学-生物医学工程（可授工学、理学、医学学位）] 1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 1002[医学-临床医学] 1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 0703[理学-化学] 0836[工学-生物工程] 10[医学] 

基　　金：吉林省科技发展计划项目 重点科技攻关项目(20160204034YY) 

主　　题：实时荧光定量PCR 重组人生长激素 CHO-K1细胞 残留DNA 

摘      要：目的建立检测CHO-K1细胞表达长效重组人生长激素(Fc-recombinant human growth hormone,Fc-rhGH)纯化液中残留DNA的实时荧光定量PCR方法,并进行验证。方法提取CHO-K1细胞基因组DNA,特异性PCR扩增后,克隆至pMD18-T载体,构建重组质粒,以其为标准品,建立实时荧光定量PCR检测方法;并对方法进行灵敏度、线性、准确度、精密度、特异性及耐用性验证。结果建立的方法灵敏度可达2. 6×10~1 copies/μL。标准曲线的回归方程为y=-3. 487 x+30. 201,R^2=0. 999;检测样品中DNA回收率在73. 56%~101. 87%范围内,RSD均小于10%;该方法可特异性扩增CHO-K1细胞的基因组DNA,而Vero细胞、MDCK细胞、Wish细胞及大肠埃希菌等基因组DNA均未见明显的扩增;样品精密度测定Ct的RSD在0. 4%~2. 95%之间;于两种不同PCR仪器上检测标准品,扩增效率分别为98%、99%,相关系数R^2均为0. 999。结论成功建立了一种检测CHO-K1细胞表达Fc-rhGH纯化液的残留DNA的实时荧光定量PCR方法,该方法具有较好的灵敏度、线性、准确度、精密度、特异性和耐用性。