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运用cfse和PKH26双染法快速鉴定细胞外囊泡

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中国组织化学与细胞化学杂志 2023年第3期32卷 282-289页

作者：郭春李艳伟王佳佳邢月婷黄莹莹宋兴辉叶小康浙江大学医学院公共技术平台杭州310058 浙江大学基础医学院杭州310058 浙江大学医学院附属妇产科医院杭州310000

目的细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)称为细胞间“信使”,通过传递物质和信息调控受体细胞的功能和表型,在生理状态维持及疾病进程中发挥重要作用。然而,亚微米直径、高异质性、低折射率等特性使EVs的分析鉴定严重受阻。本研究... 详细信息

目的细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)称为细胞间“信使”,通过传递物质和信息调控受体细胞的功能和表型,在生理状态维持及疾病进程中发挥重要作用。然而,亚微米直径、高异质性、低折射率等特性使EVs的分析鉴定严重受阻。本研究旨在探索一种准确、高效的EVs流式检测方案,为EVs的功能研究提供技术支撑。方法首先采用差速离心法分离获得EVs,用已知直径的聚苯乙烯微球作为标尺,对流式细胞仪检测EVs的各项参数进行调试和优化以达到最佳信噪比;梯度稀释EVs样本,优化其上样浓度以降低群检测效应(swarming effect),在此基础上进一步用PKH26和cfse两种荧光染料对EVs脂膜和蛋白进行双荧光标记,从而实现对EVs物理和生化特性的多参数分析,最后通过特异性抗体标记、电镜观察、纳米颗粒跟踪分析对EVs样本进行验证分析。结果参数优化后的流式细胞仪在散色光通道能将80 nm的微球信号与仪器背景噪音信号清楚分开;通过对样本的梯度稀释建立的浓度与稀释倍数之间的标准工作曲线的相关系数达0.99以上,说明仪器可以对EVs进行定量分析;荧光染色显示EVs呈cfse及PKH26双阳性,占比约5.46%,与抗体标记的结果相近;电镜和纳米颗粒跟踪分析验证其粒径及群体分布与流式结果一致。结论联合散射光与脂膜荧光染料标记是一种经济、高效的EVs流式检测方案,有利于EVs流式分析的标准化。

关键词：流式细胞术细胞外囊泡 cfse PKH26

cfse检测马传染性贫血病毒疫苗免疫马T细胞增殖方法的建立

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细胞与分子免疫学杂志 2008年第11期24卷 1044-1047页

作者：林跃智邓喜林沈楠吕晓玲赵立平孔宪刚邵一鸣周建华中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室大动物病研究室黑龙江哈尔滨150001 东北农业大学病毒免疫室黑龙江哈尔滨150030 中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心病毒免疫室北京100050

目的:以流式细胞术(FCM)检测马传染性贫血病毒(EIAV)抗原特异性的T淋巴细胞增殖。方法:将新鲜分离的马外周血单个核细胞(PBMC)进行cfse染色,经纯化病毒体外刺激并培养5d后,进行T淋巴细胞亚型标记,检测特异性增殖的CD4+和CD8+细胞比例。... 详细信息

目的:以流式细胞术(FCM)检测马传染性贫血病毒(EIAV)抗原特异性的T淋巴细胞增殖。方法:将新鲜分离的马外周血单个核细胞(PBMC)进行cfse染色,经纯化病毒体外刺激并培养5d后,进行T淋巴细胞亚型标记,检测特异性增殖的CD4+和CD8+细胞比例。结果:对马PBMC的染色浓度、特异性刺激物的种类及反应时间等条件进行了优化。可对马外周血抗原特异性T淋巴细胞不同亚型的增殖水平进行定量评价。结论:FCM检测方法为研究马传染性贫血病毒疫苗免疫保护机制提供了一个有效的手段;该法也可以为其他病毒的免疫学研究提供借鉴。

关键词： T细胞增殖 cfse 马传染性贫血病毒

cfse标记抗原特异性CD4^+CD25^+T细胞在胰岛移植体内归巢的研究

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细胞与分子免疫学杂志 2008年第12期24卷 1174-1176页

作者：张梅徐书杭徐瑜刘翠萍茅晓东徐宽枫刘超南京医科大学第一附属医院内分泌科江苏南京210029

目的:观察抗原特异性CD4+CD25+Treg细胞在小鼠同种异体胰岛移植后体内的分布特点,探讨抗原特异性CD4+CD25+Treg细胞免疫调节可能机制。方法:构建小鼠同种异体胰岛移植模型。cfse对抗原特异性CD4+CD25+Treg细胞标记,经尾静脉输注。用组... 详细信息

目的:观察抗原特异性CD4+CD25+Treg细胞在小鼠同种异体胰岛移植后体内的分布特点,探讨抗原特异性CD4+CD25+Treg细胞免疫调节可能机制。方法:构建小鼠同种异体胰岛移植模型。cfse对抗原特异性CD4+CD25+Treg细胞标记,经尾静脉输注。用组织冰冻切片和流式细胞术动态了解cfse标记的抗原特异性CD4+CD25+Treg细胞在受体内的分布和增殖变化。结果:抗原特异性CD4+CD25+Treg细胞联合胰岛移植组胰岛移植物平均生存期为(34.57±17.15)d,较胰岛移植组生存时间(10.6±1.82)d,差异有统计学意义(P<0.01)。抗原特异性CD4+CD25+Treg细胞在各级淋巴结均有能定居,但是胰腺淋巴结定居的细胞数量明显多于其他淋巴结。结论:抗原特异性Treg细胞抑制STZ诱导的糖尿病小鼠的急性移植排斥反应,细胞抑制功能与细胞在体内淋巴结的归巢有关。

关键词： CD4^+CD25^+ 调节性T细胞胰岛/移植 cfse

荧光染料cfse标记大鼠间充质干细胞的体外研究

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南方医科大学学报 2009年第1期29卷 148-150页

作者：李艳菊邓兰黄睿郭坤元南方医科大学珠江医院血液科广东广州510282

目的探究荧光染料cfse对大鼠间充质干细胞细胞(MSCs)标记的理想条件及跟踪时限。方法采用终浓度分别为2.5、5.0、10.0、20.0、40.0μmol/L的cfse在1、5、10min三个不同的时间点标记MSCs,用流式细胞仪和荧光显微镜检测细胞的转染率和荧... 详细信息

目的探究荧光染料cfse对大鼠间充质干细胞细胞(MSCs)标记的理想条件及跟踪时限。方法采用终浓度分别为2.5、5.0、10.0、20.0、40.0μmol/L的cfse在1、5、10min三个不同的时间点标记MSCs,用流式细胞仪和荧光显微镜检测细胞的转染率和荧光强度,以此来筛选cfse标记MSCs的理想条件;采用MTT方法检测在此理想条件下cfse对MSCs的增殖是否有影响;用流式细胞仪和荧光显微镜检测在此理想条件下cfse跟踪MSCs的最大时限。结果终浓度为20.0μmol/Lcfse作用5min为cfse标记MSCs细胞的理想条件,在此理想条件下MSCs细胞的荧光强度能跟踪到第21天时与未标记细胞的荧光强度相接近,并且此理想条件下的cfse对MSCs细胞的增殖无影响(P>0.05)。结论在体外正常的培养条件下终浓度为20.0μmol/Lcfse作用5min为其标记MSCs细胞的理想条件,在此理想条件下的cfse能够跟踪MSCs细胞的最大时限为21d。

关键词：荧光染料间充质干细胞细胞 MTT法 cfse

IDO修饰的成纤维细胞培养上清对小鼠T淋巴细胞增殖的影响

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细胞与分子免疫学杂志 2007年第12期23卷 1122-1125页

作者：罗璐曾耀英王箴王青赵莉杨冬梓中山大学附属第二医院妇产科广东广州510120 暨南大学组织移植与免疫中心广东广州510632 深圳市南山区蛇口人民医院广东深圳518067

目的:检测吲哚胺2-3双加氧酶(IDO)基因修饰的细胞对T淋巴细胞的免疫抑制作用。方法:将pEGFP-Nl-mIDO真核表达载体转染至小鼠NIH3T3成纤维细胞系。体外检测mIDO修饰的成纤维细胞培养液中色氨酸水平的变化;使用cfse标记技术,检测mIDO修饰... 详细信息

目的:检测吲哚胺2-3双加氧酶(IDO)基因修饰的细胞对T淋巴细胞的免疫抑制作用。方法:将pEGFP-Nl-mIDO真核表达载体转染至小鼠NIH3T3成纤维细胞系。体外检测mIDO修饰的成纤维细胞培养液中色氨酸水平的变化;使用cfse标记技术,检测mIDO修饰的成纤维细胞培养液对ConA刺激的小鼠T淋巴细胞增殖的影响。结果:将pEGFP-NI-mIDO转入NIH3T3成纤维细胞,流式细胞术(FCM)检测到EGFP的表达;体外实验表明,成纤维细胞培养上清和转染pEGFP-N1的成纤维细胞培养上清可检测到一定量的色氨酸水平,而转染pEGFP-N1-mIDO的成纤维细胞培养上清未检测到色氨酸,提示pEGFP-NI-mIDO转染的成纤维细胞表达了具有活性的mIDO;使用cfse标记技术,检测mIDO修饰的成纤维细胞培养上清对小鼠T淋巴细胞增殖的影响,发现ConA刺激的IDO组,72h后亲代细胞占各代细胞的百分率明显高于对照组。结论:IDO基因修饰的成纤维细胞可抑制T淋巴细胞的增殖。

关键词： IDO基因 T细胞增殖免疫抑制 cfse

流式细胞术三种染色方法检测体外纯化扩增的NK细胞的细胞毒作用比较

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中国实验血液学杂志 2016年第6期24卷 1691-1697页

作者：郭继强韩亚萍李芳赵晴贾原靳保利张俊萍山西医学科学院山西大医院生物治疗科山西太原030032 山西医科大学研究生院山西太原030032

目的:比较流式细胞术3种不同染色方法检测体外诱导扩增后NK细胞的细胞毒活性效果。方法:收集健康志愿者外周血,体外诱导扩增NK细胞,在培养第17天后分为3组,每组按10∶1、20∶1、40∶1 3个效靶比混合,共同培养4 h,并分组用3种不同方法染... 详细信息

目的:比较流式细胞术3种不同染色方法检测体外诱导扩增后NK细胞的细胞毒活性效果。方法:收集健康志愿者外周血,体外诱导扩增NK细胞,在培养第17天后分为3组,每组按10∶1、20∶1、40∶1 3个效靶比混合,共同培养4 h,并分组用3种不同方法染色后经流式细胞术检测。A组:cfse/Annectin-V/7-AAD三色荧光染色法;B组:Annectin-V/PI双色荧光染色法;C组:cfse/PI双色荧光染色法。结果:培养17 d后,NK细胞(CD3-CD56+)由培养第0天(16.34±10.51)%增加到(83.63±10.63)%(Pcfse/Annectin-V/7-AAD三色荧光染色法能特异性地和灵敏地检测NK细胞的细胞毒活性。

关键词：流式细胞技术细胞毒作用 NK细胞 cfse Annexin-V/7-AAD

cfse示踪与流式细胞仪检测法研究环磷酰胺对T淋巴细胞增殖的影响

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中国药理学通报 2010年第6期26卷 828-831页

作者：包晶晶林海霞马璟上海医药工业研究院国家上海新药安全评价研究中心上海201203

目的利用定量分析羧基荧光素乙酰乙酸(carboxyflu-orescein diacetate succinimidyl ester,cfse)时间系列数据的方法研究淋巴细胞细胞增殖动力学及免疫抑制剂对淋巴细胞增殖抑制机制的研究。方法环磷酰胺造成小鼠免疫抑制模型,并用cfse... 详细信息

目的利用定量分析羧基荧光素乙酰乙酸(carboxyflu-orescein diacetate succinimidyl ester,cfse)时间系列数据的方法研究淋巴细胞细胞增殖动力学及免疫抑制剂对淋巴细胞增殖抑制机制的研究。方法环磷酰胺造成小鼠免疫抑制模型,并用cfse染料给对照组和给药组动物的淋巴细胞染色,通过数学模型拟合法分析数据。结果对照组和给药组淋巴细胞增殖进入第一代分裂的时间分别是27.17h和22.88h,每代细胞死亡率分别为20%和40%;进入分裂前的细胞半衰期分别为31.53h和43.32h。结论通过数学拟合法对cfse数据进行定量分析,探讨药物对淋巴细胞增殖影响的机制,该实验中的药物环磷酰胺抑制淋巴细胞增殖的方式可能是使细胞增殖时每代细胞的死亡率增加所致。

关键词： cfse 定量分析数学拟合流式细胞仪淋巴细胞增殖环磷酰胺

耐受性CD8^+ NKT细胞体外增殖能力的鉴定

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细胞与分子免疫学杂志 2011年第2期27卷 170-172页

作者：郭业磊陈钰钟江张世仑解放军总医院免疫学教研室北京100853 复旦大学生命科学院微生物与微生物工程系上海200433

目的:利用cfse标记细胞,流式细胞术(FCM)检测法,解析超抗原SEB活化的耐受性CD8+ NKT细胞在体外增殖的情况。方法:利用cfse标记新鲜分离的C57BL/J鼠脾细胞,分别与ConA和LPS共同培养3d,收集细胞进行荧光染色并用FCM解析细胞表面CD69分子... 详细信息

目的:利用cfse标记细胞,流式细胞术(FCM)检测法,解析超抗原SEB活化的耐受性CD8+ NKT细胞在体外增殖的情况。方法:利用cfse标记新鲜分离的C57BL/J鼠脾细胞,分别与ConA和LPS共同培养3d,收集细胞进行荧光染色并用FCM解析细胞表面CD69分子的表达率和增殖能力。cfse标记的鼠脾细胞与SEB共培养5d和10d后,荧光染色并用FCM解析细胞表面CD69的百分数和增殖能力。SEB活化的第10天细胞经cfse标记后在IL-2的协同作用下继续培养10d,荧光染色,FCM解析这群细胞的增殖能力、活性分子CD69的表达率和NKT细胞亚群的变化情况。结果:ConA、LPS和SEB三者均可以刺激小鼠脾细胞增殖。ConA和LPS在3d内可以使细胞增殖3代,且CD69的表达率为74.19%和41.56%;SEB在5d和10d内分别可以使细胞增殖5代和7代,细胞表面CD69的表达率为32.09%和48.66%。SEB活化的10d细胞可以在IL-2的协同下继续传代培养10d,可以增殖7代;这群细胞中CD8+ NKT细胞亚群,由原始的0.36%增加到38.58%;细胞表面CD69分子由正常值的0.11%提高到83.74%。结论:超抗原SEB活化的CD8+ NKT细胞可以在体外进行增殖培养,且这些细胞是活性化的细胞。利用cfse标记细胞,FCM可以检测耐受性CD8+ NKT细胞在体外的增殖水平。

关键词： CD8+ NKT细胞超抗原 SEB 流式细胞术 cfse

荧光染料cfse差异浓度标记活细胞体内示踪方法

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中国组织工程研究与临床康复 2010年第15期14卷 2773-2777页

作者：蒋泽生高毅南方医科大学附属珠江医院肝胆二科南方医科大学再生医学研究所广东省广州市515282

背景:利用荧光染料标记活细胞体内示踪的方法较多,但是应用荧光染料浓度差异实现不同细胞体内示踪的方法目前仍不成熟。目的:观察不同浓度荧光活性染料cfse标记的小鼠脾细胞体内示踪情况,建立稳定的单染料差异浓度标记活细胞的体内示踪... 详细信息

背景:利用荧光染料标记活细胞体内示踪的方法较多,但是应用荧光染料浓度差异实现不同细胞体内示踪的方法目前仍不成熟。目的:观察不同浓度荧光活性染料cfse标记的小鼠脾细胞体内示踪情况,建立稳定的单染料差异浓度标记活细胞的体内示踪方法。方法:取C57BL/6J及BALB/c小鼠脾脏制备脾细胞单细胞悬液,分别用不同浓度cfse染色后制备1∶1混合细胞悬液;锥虫蓝染色鉴定细胞活性;将染色的混合细胞输注BALB/c小鼠后不同时间点,流式细胞仪检测小鼠外周血两种荧光细胞的比例。结果与结论:cfse标记的小鼠脾细胞活力良好,荧光显微镜下见全部细胞标记后均发绿色荧光,形态正常,cfse标记阳性率为95%。cfse染色时,在浓度相差20倍时流式直方图才显示为两个完全独立的峰,即cfse低浓度用0.3μmol/L高浓度用6μmol/L。异基因的C57BL/6J脾细胞在输注1d后就快速消失,而同基因BALB/c脾细胞能够在BALB/c小鼠外周血中长期存在,但是两种细胞荧光强度均未见降低,说明荧光染料cfse差异浓度标记活细胞进行体内示踪是一种稳定的示踪方法。

关键词：细胞示踪,体内,荧光标记,差异浓度染色 cfse