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MicroRNA-184 negatively regulates corneal epithelial wound healing via targeting CDC25A,carm1,and LASP1

Eye and Vision 2020年第1期7卷 336-346页

作者： Qiongjie Cao Weiwei Xu Weiwei Chen Dewei Peng Qi Liu Jing Dong Peter S.Reinach Dongsheng Yan School of Ophthalmology and Optometry Eye HospitalWenzhou Medical University270 Xueyuan RoadWenzhou 325027ZhejiangChina State Key Laboratory of Ophthalmology Optometry and Visual ScienceWenzhouZhejiangChina

Background:MicroRNAs(miRNAs)play critical roles in corneal development and functional homeostasis.Our previous study identified miR-184 as one of the most highly expressed miRNAs in the corneal epithelium.Even though its expression level plummeted dramatically during corneal epithelial wound healing(CEWH),its precise role in mediating corneal epithelial renewal was unresolved.The present study aimed to reveal the function and mechanism of miR-184 in regulating CEWH.Methods:Quantitative RT-PCR analysis characterized the miR-184 expression pattern during CEWH in mice.Ectopic miR-184 injection determined its effect on this process in vivo.We evaluated the effects of miR-184 and its target genes on the proliferation,cell cycle,and migration of human corneal epithelial cells(HCECs)using MTS,flow cytometry,and wound-healing assay,respectively.Bioinformatic analysis,in conjunction with gene microarray analysis and cell-based luciferase assays,pinpointed gene targets of miR-184 contributing to CEWH.Results:MiR-184 underwent marked downregulation during mouse CEWH.Ectopic miR-184 overexpression delayed this process in mice.Furthermore,miR-184 transfection into HCECs significantly inhibited cell proliferation,cell cycle progression,and cell migration.MiR-184 directly targeted CDC25A,carm1,and LASP1,and downregulated their expression in HCECs.carm1 downregulation inhibited both HCEC proliferation and migration,whereas a decrease in LASP1 gene expression only inhibited migration.Conclusions:Our results demonstrate that miR-184 inhibits corneal epithelial cell proliferation and migration via targeting CDC25A,carm1,and LASP1,suggesting it acts as a negative modulator during CEWH.Therefore,identifying strategies to suppress miR-184 expression levels has the potential to promote CEWH.

关键词： miR-184 Corneal epithelial wound healing Proliferation Migration CDC25A carm1 LASP1

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carm1介导的精氨酸甲基化修饰调控结肠癌细胞辐射敏感性的机制研究

CARM1介导的精氨酸甲基化修饰调控结肠癌细胞辐射敏感性的机制研究

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作者：于迪吉林大学

学位级别：硕士

结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是第三大常见癌症,也是癌症相关死亡的第四大常见原因,死亡率排名第五,其发病率逐年增加,主要治疗方式为手术治疗和辅助放疗。然而,肿瘤细胞的辐射抗性仍然是限制包括结肠癌在内的各种人类肿瘤放射治疗... 详细信息

结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是第三大常见癌症,也是癌症相关死亡的第四大常见原因,死亡率排名第五,其发病率逐年增加,主要治疗方式为手术治疗和辅助放疗。然而,肿瘤细胞的辐射抗性仍然是限制包括结肠癌在内的各种人类肿瘤放射治疗效果的最大障碍,导致肿瘤复发增加并降低治疗效果,寻找其他各种辅助手段提高其辐射敏感性具有重要的临床意义。精氨酸甲基化(arginine methylation)是一种近年发现的转录后修饰,由精氨酸甲基转移酶(PRMTs)催化。蛋白质精氨酸甲基化广泛存在于生物体内部,发挥着许多重要的作用,例如参与转录后调节、RNA加工、细胞增殖、凋亡、分化和肿瘤形成等,甲基化水平异常的蛋白质可以作为潜在的生物标志物或药物研究靶点。目前已报道的 PRMT 有 11 种,其中Ⅰ型(PRMT1、PRMT2、PRMT3、PRMT4、PRMT6和PRMT8)催化单甲基和不对称双甲基,Ⅱ型(PRMT5、PRMT9)催化对称双甲基,Ⅲ型(PRMT7)仅能催化单甲基。carm1又称为PRMT4,是PRMT家族的其中一员,属于Ⅰ型精氨酸甲基化酶,其表达水平与癌症的预后有关已被证明,在各种人类癌症类型中过表达,作为转录因子参与肿瘤细胞的凋亡,侵袭与转移等过程。本研究以人结肠癌细胞为主要研究对象,探究carm1介导的精氨酸甲基化在辐射敏感性中的作用及其可能涉及的相关机制。目的:本课题以结肠癌细胞HCT116和HT29细胞为研究对象,探讨carm1介导的精氨酸甲基化的辐射增敏作用及其调控机制,为结肠癌放射治疗提供新的理论依据。方法:1.采用X-RAD 320i X深部辐照仪进行照射,照射条件分别为:电压180 kV,电流20 mA,靶皮70 cm,剂量率1.02 Gy/min和电压320 kV,电流12.5 mA,靶皮距 60 cm,剂量率 2.22 Gy/min;2.利用生物信息学方法分析carm1在不同分期结肠癌组织中表达情况,以及其对于结肠癌患者生存期影响;3.采用CCK8法:通过检测carm1抑制剂SGC2085对HCT116和HT29细胞的增殖活性影响,得出用作辐射增敏实验的最佳药物浓度;检测不同辐照剂量对HCT116和HT29细胞的抑制效果得出最佳辐照剂量;检测carm1抑制剂SGC2085对辐照前后的HCT116和HT29细胞的增殖存活能力;4.采用克隆形成法:检测carm1抑制剂SGC2085对辐照前后HCT116和HT29细胞集落形成能力的影响;5.采用流式细胞术实验法:检测carm1抑制剂SGC2085对辐照前后HCT116和HT29细胞凋亡、周期、自噬、ROS的变化。6.采用Western Blot法:检测carm1抑制剂SGC2085对辐照前后HCT116和HT29细胞周期、凋亡相关蛋白以及HCT116细胞精氨酸残基上非对称二甲基和单甲基精氨酸蛋白水平变化;7.采用细胞划痕实验,Transwell(细胞迁移)实验法:检测carm1抑制剂SGC2085对辐照前后HCT116和HT29细胞迁移与侵袭能力的影响;8.利用MDC法检测carm1抑制剂SGC2085联合电离辐射对HCT116和HT29细胞自噬的影响;利用DCFH-DA探针检测carm1抑制剂对辐照前后HCT116和HT29细胞ROS的影响;利用罗丹明123(Rhodamine123)、JC-1检测carm1抑制剂SGC2085联合电离辐射对HCT116和HT29细胞线粒体膜电位的变化;9.利用免疫荧光法检测对HCT116和HT29细胞DNA损伤相关蛋白γ-H2AX、53BP1的表达变化;10.采用Graphpad prism8.0软件分析处理数据,计量资料的各组数据以x±s表示,正态且方差齐的数据,采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)比较不同组间各指标的差异,采用LSD法进行组间的两两比较。以P1.carm1与结肠癌患者疾病分期及生存期关系使用在线分析网站进行的生物信息学分析结果显示,carm1在结肠癌组织中处于高表达水平(P1),并且随着结肠癌患者分期的增长,carm1表达水平亦逐渐升高,并且carm1基础表达水平较高的患者生存期在中后期比基础表达较低者差(P=0.71)。2.电离辐射对结肠癌细胞HCT116中carm1及其调控的单甲基精氨酸或非对称二甲基精氨酸蛋白表达的影响辐照作用后的结肠癌细胞HCT116中carm1的蛋白表达水平随着辐照剂量的增加而增长。通过Western Blot法测定了辐照后HCT116细胞中含有mme-R(单甲基精氨酸蛋白)或adme-R(非对称二甲基蛋白)的内源性蛋白水平变化,发现在HCT116细胞中精氨酸单甲基化及非对称二甲基化蛋白的整体表达水平随辐照强度的增加而增加。3.SGC2085对结肠癌细胞carm1表达变化的影响SGC2085作用后的结肠癌细

关键词：结肠癌精氨酸甲基化 carm1 电离辐射辐射敏感性

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环状RNA circHMGB2通过miR-181a-5p/carm1轴诱导非小细胞肺癌免疫抑制和抗PD-1治疗耐药的研究

环状RNA circHMGB2通过miR-181a-5p/CARM1轴诱导非小细胞肺癌免疫...

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作者：张领先南昌大学

学位级别：硕士

研究背景和目的:肺癌是最常见的恶性肿瘤之一,是世界上癌症相关死亡的主要原因。非小细胞肺癌(NSCLC)约占所有肺癌病例的85%。对于NSCLC患者来说,早期诊断及根治性手术治疗,其预后较好。但是大多数患者初次诊断时已属晚期,失去手术机会... 详细信息

研究背景和目的:肺癌是最常见的恶性肿瘤之一,是世界上癌症相关死亡的主要原因。非小细胞肺癌(NSCLC)约占所有肺癌病例的85%。对于NSCLC患者来说,早期诊断及根治性手术治疗,其预后较好。但是大多数患者初次诊断时已属晚期,失去手术机会。他们的治疗主要依靠化疗、靶向及免疫等治疗,患者获益有限。最新的临床研究证实,NSCLC的5年总体生存率仅为16%。因此,对于NSCLC的发生和发展机制的进一步研究,并基于此开发NSCLC的新治疗药物和策略具有重要意义。环状RNA(circ RNAs)是一类以共价闭合环为特征的非编码RNA,源自前体m RNA外显子等的反向剪接。环状RNA的生物学功能广泛。虽然已有一些研究报道了环状RNA在NSCLC肿瘤发生和进展中的作用,但大多数环状RNA在NSCLC进展中的潜在作用仍不清楚,需要进一步研究。高迁移率族蛋白2(high-mobility group box 2,HMGB2)是一种核蛋白,普遍存在于人类,负责染色质结构域的活性状态。HMGB2在多种肿瘤中的致癌作用已经得到了广泛的研究和证实,然而由HMGB2衍生出的环状RNA的生物学功能仍然是未知的。因此,我们计划研究由HMGB2衍生出的环状RNA在NSCLC中潜在的作用。方法:使用qRT-PCR检测8对NSCLC组织及其配对的正常组织中由HMGB2衍生出的环状RNA的表达谱,筛选出hsa＿circ＿0071452(circHMGB2)。然后使用q RT-PCR检测120例NSCLC组织和配对的正常肺组织中circHMGB2的表达量,分析circHMGB2的表达与患者的临床病理特征及预后的相关性。circHMGB2在NSCLC中的生物学功能通过Transwsell、划痕实验、CCK-8、克隆形成试验及裸鼠皮下瘤模型进行检测。使用小鼠LLC细胞系,构建免疫功能完善的小鼠模型。予以抗PD-1治疗,观察肿瘤生长情况及抑制率。流式细胞术和免疫组化检测皮下瘤中免疫细胞浸润的情况。最后,我们通过circ RNA沉淀、RNA免疫共沉淀、荧光素酶报告基因试验和RNA pull-down试验来探索circHMGB2促进NSCLC进展的潜在机制。结果:HMGB2衍生出三个circ RNA(hsa＿circ＿0071454、hsa＿circ＿0071452、hsa＿circ＿0071453),其中circHMGB2(hsa＿circ＿0071452)的表达量明显上调(P1)。在120例NSCLC组织和配对的正常肺组织中,circHMGB2在104例NSCLC组织中的表达量高于正常组织。其中,circHMGB2的表达水平高于正常组织两倍以上的有57例。circHMGB2的表达与患者肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期相关(p0.05),但是对NSCLC细胞的增殖有显著的影响(p1)。流式细胞术分析皮下接种LLC-circHMGB2细胞的肿瘤中免疫细胞浸润情况,CD8T细胞(p11)、Treg(p=0.7638)细胞则没有差异。此外,我们发现circHMGB2的上调降低了抗PD-1治疗的疗效(P1)。在机制上,circHMGB2通过海绵样吸附mi R-181a-5p解除了其对下游carm1的抑制,从而导致NSCLC的免疫逃逸和抗PD-1治疗的耐药。结论:circHMGB2过表达重塑NSCLC的免疫微环境和促进抗PD-1治疗耐药,参与NSCLC进展,有望成为NSCLC患者预后的新的生物标志物和潜在的治疗靶点。

关键词： circHMGB2 carm1 非小细胞肺癌肿瘤微环境抗PD-1治疗

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carm1、p54nrb在乳腺癌中的表达及临床意义

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诊断病理学杂志 2022年第5期29卷 423-427页

作者：姜涵译陈志伟张雪鹏华北理工大学附属医院肿瘤外科河北唐山063000 华北理工大学河北唐山063000

目的探讨carm1与p54nrb在浸润性乳腺癌组织中的表达情况及其与临床病理学特征的关系。方法采用免疫组织化学染色SP法检测121例浸润性乳腺癌组织及随机抽取与其配对的60例癌旁正常组织中carm1和p54nrb的表达情况,分析carm1和p54nrb表... 详细信息

目的探讨carm1与p54nrb在浸润性乳腺癌组织中的表达情况及其与临床病理学特征的关系。方法采用免疫组织化学染色SP法检测121例浸润性乳腺癌组织及随机抽取与其配对的60例癌旁正常组织中carm1和p54nrb的表达情况,分析carm1和p54nrb表达与乳腺癌临床病理学特征及乳腺癌分子分型的关系。结果 carm1在乳腺癌中的阳性表达率为55.4%,高于癌旁组织(38.3%);p54nrb的阳性表达率为57.9%,高于癌旁组织(35.0%),以上差异均具有统计学意义(Pcarm1和p54nrb在浸润性乳腺癌中的表达水平与较高组织学分型,ER、PR、高Ki-67指数相关,与患者发病年龄、肿瘤大小、淋巴结转移(N)、TNM分期及HER-2表达情况无关(P>0.05)。carm1表达与p54nrb表达呈正相关(r=0.463,P=0.000)。结论乳腺癌组织中carm1与p54nrb均呈高表达,提示两者可能与乳腺癌的发生、高恶性程度及侵袭力相关。

关键词： carm1 p54nrb 乳腺癌免疫组织化学

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carm1在胶质瘤发生发展中的作用研究

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医学信息 2022年第6期35卷 77-80页

作者：胡彩虹王志浩方思琪蔡菲高雨罗洋洋张旭东西安医学院临床医学院中尼友好拉吉姆医学实验室西安医学院临床医学院药学院

目的基于中国脑胶质瘤基因组图谱（CGGA）数据库，分析研究精氨酸甲基转移酶1(carm1)在胶质瘤中的差异性表达情况，探讨其潜在的作用机制，进而为胶质瘤的诊断与治疗提供新的靶点。方法基于CGGA数据库中胶质瘤患者的相关临床资料，分... 详细信息

目的基于中国脑胶质瘤基因组图谱（CGGA）数据库，分析研究精氨酸甲基转移酶1(carm1)在胶质瘤中的差异性表达情况，探讨其潜在的作用机制，进而为胶质瘤的诊断与治疗提供新的靶点。方法基于CGGA数据库中胶质瘤患者的相关临床资料，分析不同情况胶质瘤患者中carm1表达差异性及与患者生存率及生存时间的关系，最后通过String数据库对carm1蛋白表达相关作用网络进行分析。结果不同性别的胶质瘤患者中carm1表达比较，差异无统计学意义（P=0.36）;CGGA数据库分析显示，carm1在原发性胶质瘤和复发性胶质瘤组织中呈高水平表达（P=1.4e-18）;carm1的表达与年龄有一定相关性（P=0.0006），与胶质瘤发生发展呈正相关（P=1e-16）;carm1在复发性胶质瘤组织中表达量高于原发性胶质瘤（P=0.0011）;carm1在原发性、复发性胶质瘤组织中的表达与患者生存期呈负相关（P1）；利用String数据库分析显示，carm1与EP300、TP53、NCOA3等多个蛋白有相互作用。结论 carm1在胶质瘤组织中呈高表达，且与患者的预后密切相关，可作为诊断和治疗胶质瘤的潜在靶点。

关键词： carm1 PRMT4 PRMTs 胶质瘤肿瘤

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carm1维持羊水干细胞干性的机制

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中国组织工程研究 2016年第36期20卷 5412-5418页

作者：吴静赵利华上海市儿童医院上海交通大学附属儿童医院中心实验室上海市200040 上海市儿童医院上海交通大学附属儿童医院骨科上海市200040

背景:研究表明,carm1催化的组蛋白H3R17/R26的甲基化修饰对于胚胎干细胞干性的维持起着非常重要的作用,但其在羊水干细胞干性维持中的作用及机制目前尚不明确。目的:初步探讨carm1在维持羊水干细胞干性中的作用及其分子机制。方法:分离... 详细信息

背景:研究表明,carm1催化的组蛋白H3R17/R26的甲基化修饰对于胚胎干细胞干性的维持起着非常重要的作用,但其在羊水干细胞干性维持中的作用及机制目前尚不明确。目的:初步探讨carm1在维持羊水干细胞干性中的作用及其分子机制。方法:分离、培养人妊娠晚期羊水干细胞,RT-PCR鉴定干细胞标志物及carm1基因的表达。利用carm1的两条shR NA慢病毒表达载体,沉默羊水干细胞中carm1基因的表达。RT-qP CR检测carm1基因的表达沉默效率,Western blot检测组蛋白H3R17的甲基化水平。RT-qP CR检测干细胞标志物OCT4,SOX2和NANOG基因的表达水平。结果与结论:(1)人妊娠晚期羊水干细胞能够表达干细胞标志物,包括OCT4、SOX2、Nanog和KLF4,并表达carm1基因;(2)carm1的两条shR NA均能够有效沉默carm1基因的表达;(3)carm1表达沉默后,羊水干细胞中组蛋白H3R17的甲基化水平降低,OCT4和SOX2的表达也降低,而NANOG的表达没有发生变化;(4)结果表明,carm1可能通过调控OCT4和SOX2基因的表达,进而起到维持羊水干细胞干性的作用。

关键词：干细胞羊水妊娠末期蛋白质精氨酸N-甲基转移酶慢病毒感染甲基化组织工程分化羊水干细胞妊娠晚期 carm1 慢病毒 sh RNA 表达沉默 OCT4 SOX2 H3R17甲基化干性国家自然科学基金

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子宫颈鳞状细胞癌组织中SIAH2、carm1的表达与意义

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实用中西医结合临床 2023年第3期23卷 105-108页

作者：陈湧彧福建省漳浦县医院病理科漳浦363200

目的:探讨子宫颈鳞状细胞癌组织中SIAH2、carm1的表达及与临床特征间的关系。方法:前瞻性选取2020年5月至2022年5月漳浦县医院收治的120例子宫颈鳞状细胞癌患者为研究对象,于患者入院后检测癌组织与配对癌旁组织中SIAH2、carm1相关蛋白... 详细信息

目的:探讨子宫颈鳞状细胞癌组织中SIAH2、carm1的表达及与临床特征间的关系。方法:前瞻性选取2020年5月至2022年5月漳浦县医院收治的120例子宫颈鳞状细胞癌患者为研究对象,于患者入院后检测癌组织与配对癌旁组织中SIAH2、carm1相关蛋白的表达水平,分析上述指标与临床病理特征的相关性。结果:子宫颈鳞状细胞癌组织中SIAH2、carm1的阳性表达率明显较子宫颈鳞状细胞癌旁组织高(Pcarm1通路相关蛋白阳性表达与年龄、肿瘤直径无关(P>0.05),但可能与分化程度、肌层浸润深度、FIGO分期、淋巴结转移有关(Pcarm1通路相关蛋白表达阳性率在低分化、肌层浸润深度≥1/2、FIGO分期为Ⅲ~Ⅳ期、淋巴结转移的患者中较高(OR>1,Pcarm1在子宫颈鳞状细胞癌组织中的阳性表达率较癌旁组织高,且与临床病理特征(分化程度、肌层浸润深度、FIGO分期、淋巴结转移)有一定关系。

关键词：子宫颈鳞状细胞癌 SIAH2 carm1 病理特征

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Coactivator-associated arginine methyltransferase 1: A versatile player in cell differentiation and development

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Genes & Diseases 2023年第6期10卷 2383-2392页

作者： Zhongrui Ma Xinxing Lyu Ning Qin Haoyu Liu Mengrui Zhang Yongchao Lai Bo Dong Peiyuan Lu Medical Research Center The First Affiliated Hospital of Shandong First Medical UniversityJinanShandong 250014China Department of Immunology Medical Science and Technology Innovation CenterShandong First Medical University&Shandong Academy of Medical SciencesJinanShandong 250117China Department of Biochemistry and Molecular Biology School of Basic MedicineShandong First Medical University&Shandong Academy of Medical SciencesJinanShandong 250117China Department of Cardiology Shandong Provincial Hospital Affiliated to Shandong First Medical UniversityJinanShandong 250021China

Protein arginine methylation is a common post-translational modification involved in the regulation of various cellular functions. Coactivator-associated arginine methyltransferase 1 (carm1) is a protein arginine methyltransferase that asymmetrically dimethylates histone H3 and non-histone proteins to regulate gene transcription. carm1 has been found to play important roles in cell differentiation and development, cell cycle progression, autophagy, metabolism, pre-mRNA splicing and transportation, and DNA replication. In this review, we describe the molecular characteristics of carm1 and summarize its roles in the regulation of cell differentiation and development in mammals.

关键词： Arginine methylation carm1 Cell differentiation Development Epigenetic regulation

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carm1通过上调EGFR蛋白表达促进胶质瘤进展

CARM1通过上调EGFR蛋白表达促进胶质瘤进展

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作者：王青苏州大学

学位级别：硕士

研究背景和目的:胶质瘤因高度恶性、高复发性及高耐药性成为颅内最难治疗的肿瘤之一,因此针对胶质瘤的发生发展机制研究对于其临床诊断及治疗意义重大。carm1即共激活因子相关的精氨酸甲基转移酶1,又名PRMT4(蛋白质精氨酸甲基转移酶4),... 详细信息

研究背景和目的:胶质瘤因高度恶性、高复发性及高耐药性成为颅内最难治疗的肿瘤之一,因此针对胶质瘤的发生发展机制研究对于其临床诊断及治疗意义重大。carm1即共激活因子相关的精氨酸甲基转移酶1,又名PRMT4(蛋白质精氨酸甲基转移酶4),是PRMT家族中的Ⅰ型蛋白。carm1在多种肿瘤中高表达,促进肿瘤的发生发展,但carm1在胶质瘤中的作用尚未有文献报道。本研究对carm1在胶质瘤中的作用、作用机制以及carm1小分子抑制剂对胶质瘤增殖的抑制效果进行探索,争取为胶质瘤提供新的诊断和治疗靶点。研究方法:(1)利用公共数据库对比carm1在脑胶质瘤患者中的表达差异及其与胶质瘤患者预后的相关性;(2)通过siRNA瞬时转染法敲低carm1表达,并构建强力霉素诱导的carm1 shRNA胶质瘤稳转株,并用实时荧光定量PCR及Western blot法检测carm1敲低效率;(3)通过Alamarblue法和细胞克隆形成实验检测敲减carm1表达对胶质瘤细胞短期和长期增殖的影响;(4)通过实时荧光定量PCR法和Western blot实验检测敲减胶质瘤细胞中carm1表达对EGFR的RNA和蛋白水平影响;(5)利用Western blot法检测EGFR信号通路在carm1影响胶质瘤细胞增殖中的作用;(6)通过Western blot实验检测敲低carm1表达对EGFR半衰期的影响;(7)通过流式细胞仪检测敲减carm1表达后胶质瘤细胞周期的改变;(8)通过Alamarblue及细胞克隆形成实验检测不同carm1小分子抑制剂在不同浓度对胶质瘤细胞增殖的影响,筛选出最佳carm1抑制剂和最佳作用浓度。研究结果:(1)通过数据库分析我们发现carm1在胶质瘤患者中高表达,表达水平与胶质瘤患者生存期相关;(2)使用carm1 siRNA干扰胶质瘤细胞后,carm1表达明显降低,构建的carm1 shRNA胶质瘤细胞稳转株经过DOX诱导后,carm1表达明显降低;(3)敲减carm1后,胶质瘤的细胞增殖下降;(4)敲减carm1后,EGFR蛋白表达水平下调,但其mRNA水平没有明显变化;(5)敲低carm1蛋白水平可降低ERK1/2及AKT的磷酸化水平;(6)敲减carm1蛋白水平可降低EGFR半衰期,促进EGFR蛋白降解;(7)敲减carm1后,胶质瘤细胞周期G1期的比例增加,S期的比例降低;(8)一定浓度范围的carm1小分子抑制剂处理胶质瘤细胞后,胶质瘤细胞增殖能力下降。结论:(1)carm1在胶质瘤中表达增加提示预后不良;(2)carm1具有促进胶质瘤细胞增殖的作用;(3)carm1可通过阻止蛋白降解,引起胶质瘤中EGFR蛋白积聚,进而上调EGFR蛋白表达;(4)carm1可通过ERK1/2及AKT磷酸化途径对胶质瘤细胞增殖进行调控;(5)carm1促进胶质瘤细胞从G1期向S期分化,DNA复制增加;(6)2μ m和4μm浓度的carm1小分子抑制剂Calbiochem对胶质瘤抑制效果明显。

关键词： carm1 胶质瘤 EGFR 小分子抑制剂

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carm1在P19细胞神经分化过程中的调控机制初探

Carm1在P19细胞神经分化过程中的调控机制初探

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作者：冯炯北京协和医学院

学位级别：硕士

表观遗传学是基于非基因序列改变所致的基因表达水平变化,包括染色体重塑,组蛋白修饰,DNA甲基化等,尤其组蛋白的修饰。本文关注于精氨酸的甲基化修饰。随着人们对精氨酸甲基化的特殊状态的研究深入,其所起到的作用也越来越被关注。精氨... 详细信息

表观遗传学是基于非基因序列改变所致的基因表达水平变化,包括染色体重塑,组蛋白修饰,DNA甲基化等,尤其组蛋白的修饰。本文关注于精氨酸的甲基化修饰。随着人们对精氨酸甲基化的特殊状态的研究深入,其所起到的作用也越来越被关注。精氨酸是带有正电荷的氨基酸,可以调节氢键结合,氨基和芳香基团反应。在多肽中的精氨酸的氮原子可以发生翻译后修饰,连接甲基原子团,这个过程称为精氨酸甲基化。精氨酸甲基化后在精氨酸的胍基的氮原子连接一个或者两个甲基原子团。在真核生物中,主要发生以下三种模式的精氨酸甲基化：o-NG,精氨酸单甲基化(MMA Monomethylarginines);ω-NG, NG-asymmetric精氨酸不对称二甲基化(aDMA asymmetric Dimethylarginines);ω-NG, N'G-symmetric精氨酸对称二甲基化(sDMA symmetric Dimethylarginines)。精氨酸甲基转移酶家族(PRMTs)可以分为类型一和类型二：类型一包括PRMT1, PRMT3, PRMT4, PRMT6,催化形成精氨酸不对称二甲基化(aDMA);类型二包括PRMT5, PRMT7,催化形成精氨酸对称二甲基化(sDMA)。精氨酸甲基转移酶carml属于精氨酸甲基转移酶家族(PRMTs)的类型一,即具有甲基转移酶活性并催化底物精氨酸发生不对称二甲基化,其甲基化底物包括组蛋白甲基化底物和许多非组蛋白底物;同时具有激活转录以及对pre-mRNA的剪接等生物学功能。随着对carml研究的深入,carml在分化发育方面的作用越来越受到关注。carml-/-的小鼠胚胎很小,新生小鼠死亡;无酶活的carml knock-in细胞和小鼠与carml knock-out细胞和小鼠有相似的缺陷,也就是进一步证明carml在发育过程中发挥作用,其甲基转移酶活性是必需的。进一步的研究证实其在肌肉细胞,脂肪细胞,T细胞分化发育过程中,都起到了不可或缺的作用。为进一步深入地探究carml在分化发育方面的作用同时结合本课题组已经建立的P19神经分化模型,进一步探究carml在P19神经分化过程中的机制。一、carml在P19细胞神经分化过程的表达用0.5μM RA诱导小鼠畸胎瘤P19细胞四天后,撤去RA后用正常的培养基培养后,观察P19细胞形态,看到有明显的神经细胞突触和神经网络;同时检测神经标志基因TuJl。证明成功构建P19细胞神经分化模型。在此基础上,检测carml的表达变化,结果发现carml的mRNA水平在RA诱导的一天后就有明显的下降,提示我们carml对P19的分化可能起到一定的作用。二、carml在P19细胞神经分化过程中的作用分析基于上述研究以及本实验室的研究平台,构建稳定敲低carml的P19细胞系后,用RA诱导感染pLKO.1/carml shRNA3, pLKO.1/Scramble shRNA慢病毒的P19细胞系,在P19细胞分化成神经细胞过程中检测早期神经标志基因Mashl和晚期神经标志基因β-tubulin,诱导结束后分别观察P19细胞神经分化的形态。结果显示：carml敲低后,甲,期神经标志Mashl基因的升高程度明显低于对照组;同时免疫荧光结果显示carml敲低后,β-tubulin明显少于对照组,在细胞形态上神经突触也明显少于对照组。进一步提示,carm1在P19细胞分化成神经细胞的早期以及晚期都发挥了很重要的作用。三、carm1稳定敲低的P19细胞系中Sox2R113的二甲基化水平为了深入探究carml在P19细胞神经分化过程中的转录调控机制,我们在carml稳定敲低的P19细胞系检测了主要的多能性基因Oct4, Sox2, Nanog的表达变化,结果显示这些多能性基因在mRNA和蛋白水平上都没有显著性的变化。本课题组发现carml可以甲基化Sox2的113位精氨酸。在上述实验的基础上,我们检测稳定敲低carml的P19细胞系中Sox2的113位的精氨酸的甲基化水平。结果显示carml稳定敲低的P19细胞中,Sox2的113位的精氨酸甲基化水平明显低于对照组。四、carml稳定敲低的P19细胞系中H3R2的二甲基化水平在检测了carml的非组蛋白甲基化底物基础上,检测carml的组蛋白甲基化底物H3R17和H3R2,结果显示稳定敲低carml的P19细胞系中,H3R17的二甲基化水平没有显著变化,但是H3R2的二甲基化水平发生了显著的降低。五、carml稳定敲低的P19细胞系中ERα靶基因的表达carml在具有精氨酸甲基转移酶的特质外,还具有共激活的特质。有研究报道carml-/-的成纤维细胞和胚胎细胞中,雌性激素响应的基因表达都是异常的。实验进一步检测了ERα的靶基因并且其受到carml的共激活调控作用。

关键词：精氨酸甲基转移酶 carm1 P19 转录调控

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