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基于bt毒素的杀虫蛋白理性设计与创新应用策略

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中国农业科学 2024年第1期57卷 96-125页

作者：徐重新金嘉凤孙晓明沈成张霄陈澄宇刘贤金刘媛江苏省农业科学院农产品质量安全与营养研究所/省部共建国家重点实验室培育基地-江苏省食品质量安全重点实验室江苏大学食品与生物工程学院南京农业大学植物保护学院

bt毒素是源于苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）的具有特殊杀虫功能的大分子蛋白，其制剂和转基因作物已广泛用于害虫防治，产生了巨大的经济和社会生态效益。围绕bt毒素挖掘和提升其应用价值是持续研究的热点，特别是随着bt毒... 详细信息

bt毒素是源于苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）的具有特殊杀虫功能的大分子蛋白，其制剂和转基因作物已广泛用于害虫防治，产生了巨大的经济和社会生态效益。围绕bt毒素挖掘和提升其应用价值是持续研究的热点，特别是随着bt毒素结构功能和作用机制日趋明晰，为其功能修饰和创新应用创造了条件，相关研究蓬勃发展，成效显著。大量研究表明，采用定点突变、结构域替换或融合以及抗独特型抗体模拟等策略，是理性设计活性更高、稳定性更强、杀虫谱更广、非靶标生物安全性更高甚至是可用于害虫抗药性治理的有别于母体bt毒素的突变体、结构杂合体乃至功能效应物抗体等新型杀虫蛋白的有效手段；此外，采用催化毒素活化、驱动毒素靶向受体结合、促进毒素表达以及同源或异源杀虫材料复配或共表达的协同促效等创新增效策略，也是助推bt毒素应用价值的重要手段。本文总结了bt毒素结构功能和作用机制，梳理了基于bt毒素功能修饰的突变体、结构杂合体以及功能效应物抗体等新型杀虫蛋白理性设计和基于bt毒素功能增效的创新应用策略等相关研究进展，并结合作者团队在模拟bt毒素杀虫功能效应物抗体靶向设计研发方面的最新成果，探讨了基于bt毒素的杀虫蛋白理性设计与创新应用策略未来发展动向及潜在可行捷径，为相关研究提供较为全面的最新有价值的文献资料和启发思路。

关键词： bt毒素苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白定点突变抗独特型抗体蛋白融合表达杀虫增效物

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bt毒素在转基因棉花与土壤系统中的分布

应用生态学报 2005年第9期16卷 1765-1768页

作者：孙彩霞陈利军武志杰中国科学院沈阳应用生态研究所

研究了转bt基因棉花与土壤系统中bt毒素的分布.结果表明,两种转bt基因棉花地上部(叶片、茎秆)的毒素表达量(103.5～134.1 ng·g-1)显著高于地下部分(根系)(44.7～21.2ng·g-1),土壤中bt毒素总量可通过转基因棉花地上部分秸秆的处理得到... 详细信息

研究了转bt基因棉花与土壤系统中bt毒素的分布.结果表明,两种转bt基因棉花地上部(叶片、茎秆)的毒素表达量(103.5～134.1 ng·g-1)显著高于地下部分(根系)(44.7～21.2ng·g-1),土壤中bt毒素总量可通过转基因棉花地上部分秸秆的处理得到控制;bt毒素在转bt基因棉花根系分泌物中的含量极低,如果控制bt毒素的其它导入来源,将显著降低转bt基因作物释放中因bt毒素导入而引发的对土壤生态系统的扰动.

关键词： bt毒素转基因棉花土壤分布

bt毒素诱导下小菜蛾实时定量PCR内参基因的筛选

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昆虫学报 2012年第12期55卷 1406-1412页

作者：符伟谢文张卓吴青君王少丽张友军湖南农业大学农药研究所长沙410128 湖南省植物保护研究所长沙410125 中国农业科学院蔬菜与花卉研究所北京100081

【目的】筛选出bt毒素诱导后的小菜蛾Plutella xylostella(L.)的实时定量PCR最适内参基因。【方法】选取核糖体18S rRNA(18S rRNA)、肌动蛋白(ACTB)、延伸因子(EF1)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、核糖体蛋白L32(RPL32)、核糖体蛋白S13(R... 详细信息

【目的】筛选出bt毒素诱导后的小菜蛾Plutella xylostella(L.)的实时定量PCR最适内参基因。【方法】选取核糖体18S rRNA(18S rRNA)、肌动蛋白(ACTB)、延伸因子(EF1)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、核糖体蛋白L32(RPL32)、核糖体蛋白S13(RPS13)、核糖体蛋白S20(RPS20)和β-微管蛋白(TUB)基因作为候选内参基因,以geNorm、Normfinder和BestKeeper软件分析这8个基因在bt毒素诱导后的小菜蛾不同品系中肠组织中的表达稳定性。并应用筛选出来的内参基因分析小菜蛾氨肽酶2(aminopeptidase N2,APN2)基因的表达水平。【结果】geNorm软件以RPS13和EF1为最稳定内参基因,NormFinder和BestKeeper软件均以RPS13和RPL32为最稳定基因。使用3种不同内参基因分析bt毒素诱导后的小菜蛾bt抗性和敏感品系中ANP2表达水平时,新的内参基因EF1和传统内参基因RPL32表现了良好的稳定性,二者作为标准化因子,ANP2表达量结果基本一致,而使用18S rRNA作为内参基因,却导致部分表达量分析结果有所误差。【结论】筛选出PRS13,RPL32和EF1可以作为小菜蛾某些试验条件下的内参基因,对小菜蛾基因表达研究奠定了一定基础,也对其他昆虫内参基因的筛选具有参考价值。

关键词：小菜蛾实时定量PCR 内参基因抗药性 bt毒素

bt毒素对棉铃虫雄蛾感受雌蛾性信息素EAG反应的影响

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昆虫学报 2005年第3期48卷 450-454页

作者：穆兰芳董双林南京农业大学

用含bt毒素的人工饲料饲养棉铃虫Helicoverpaarmigera3龄幼虫至成虫(死亡率为40%～50%),采用触角电位(electroantennogram,EAG)技术,测定了雄蛾对雌蛾性信息素2种组分顺9十六碳烯醛(Z916:Ald)、顺11十六碳烯醛(Z1116:Ald)及其混合物(Z1116:Ald∶Z916:Ald=97∶3)的EAG反应。结果表明,bt毒素对雄蛾感受性信息素单一组分和混合物的EAG反应均具促进作用;且随信息素剂量的增加,这种促进作用也随之增强。这一结果对于评价和实施延缓棉铃虫对bt棉抗性的“庇护所”策略,具有一定的参考意义。

关键词： bt毒素棉铃虫性信息素 EAG反应

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bt毒素诱导的细胞自噬及其机制的研究

Bt毒素诱导的细胞自噬及其机制的研究

作者：远万里华中师范大学

学位级别：硕士

苏云金芽胞杆菌(Bαcillus thuringiensis)产生的bt毒素蛋白,可以杀死多种农业害虫。活化的苏云金杆菌晶体毒素不仅作用于靶昆虫的中肠细胞,还作用于某些培养的昆虫细胞系。活化的晶体毒素通过寡聚化在刷状缘膜上形成孔隙来杀死中肠细胞... 详细信息

苏云金芽胞杆菌(Bαcillus thuringiensis)产生的bt毒素蛋白,可以杀死多种农业害虫。活化的苏云金杆菌晶体毒素不仅作用于靶昆虫的中肠细胞,还作用于某些培养的昆虫细胞系。活化的晶体毒素通过寡聚化在刷状缘膜上形成孔隙来杀死中肠细胞,但是还不清楚低浓度毒素对细胞的其它影响。探究bt毒素毒杀昆虫细胞所发生的一系列生理生化反应,有助于提高bt毒素对害虫的防治能力,丰富细菌毒理学的理论。研究表明,自噬在天然免疫防御系统中起着关键作用(抵抗细胞内病原体的自噬也被称为异种自噬)。细胞自噬的研究近来已经涉及到针对各种成孔毒素(pore forming toxin,PFT)的反应,但是如何引发这个过程尚不明确,这种现象的生理学意义也尚不清楚。本论文致力于研究低浓度的活化Cry1 Ac和Cry1Ca毒素对培养的昆虫和哺乳动物的细胞自噬的影响,探究自噬在昆虫细胞对bt毒素抗性中的作用。所有试验的昆虫细胞(Hi5,Sl-HP和Sf9)都对活化的Cry1Ca毒素敏感,但只有Sl-HP细胞对活化的Cry1Ac毒素敏感。活化的Cry1Ac和Cry1Ca毒素对哺乳动物细胞293T均无毒害性。本研究发现Cry1Ca毒素增强Hi5,S1-HP和Sf9细胞的自噬水平,而Cry1Ac毒素只促进S1-HP细胞的自噬(P毒素不影响293T细胞的自噬水平。这表明毒素对自噬的诱导需要毒素受体的介导,与细胞对毒素的敏感性呈正相关。本实验通过使用四种自噬抑制剂(Baf、CQ、ConA、3-MA)处理Hi5细胞后,Western blot分析发现Baf、CQ、ConA三种自噬抑制剂处理能够抑制Cry1Ca毒素促使的Atg8向Atg8-PE的转换,并且能够使细胞对该毒素的敏感性下降。通过干扰Hi5细胞自噬相关基因Atg5或Atg13后,发现Hi5细胞对Cry1Ca毒素的敏感性下降。因此,自噬在介导Cry1Ca毒素对Hi5细胞的毒力方面起着重要作用。本研究使用Jnk、P38、PI3K抑制剂处理三种昆虫细胞(Hi5、S1-HP和Sf9),能够抑制Cry1Ca毒素增强细胞的自噬水平,但结果表明Jnk抑制剂处理后三种昆虫细胞对Cry1Ca、Cry1Ac毒素的敏感性下降最为明显。然后,在S1-HP细胞中沉默SlJnk基因后细胞对毒素的敏感性下降,这与使用Jnk抑制剂的效果相同。这表明Cry1Ac和Cry1Ca毒素诱导的昆虫细胞自噬水平增强能够被经典的自噬抑制剂阻断,依赖于Atg5和Atg13,Jnk信号途径在这个过程中起着重要作用,自噬在一定程度上影响细胞对毒素的敏感性。该昆虫细胞自噬诱导和阻断体系的建立对深入探究昆虫细胞的自噬分子机制具有十分重要的意义,将促进昆虫发育生物学和害虫防治的相关研究。

关键词：细胞自噬 bt毒素自噬抑制剂 RNA干扰 Jnk信号途径

转bt基因作物bt毒素在土壤中的环境去向及其生态效应

同方学位论文库评论

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生态学报 2003年第4期23卷 797-804页

作者：王建武骆世明冯远娇 Cindy Nakatsu 华南农业大学热带亚热带生态研究所广州510642 Department of Agronomy Purdue University

综述了转 bt基因作物的 bt毒素在土壤中的环境去向及其生态效应的研究进展。重点阐述了 :1 bt毒素与土壤表面活性颗粒结合及其与土壤理化性质的关系 ;2 bt毒素微生物利用与降解 ;3bt毒素的杀虫活性 ;4后茬作物和土壤动物对 bt毒素的吸... 详细信息

综述了转 bt基因作物的 bt毒素在土壤中的环境去向及其生态效应的研究进展。重点阐述了 :1 bt毒素与土壤表面活性颗粒结合及其与土壤理化性质的关系 ;2 bt毒素微生物利用与降解 ;3bt毒素的杀虫活性 ;4后茬作物和土壤动物对 bt毒素的吸收与利用 ;5 bt毒素的垂直运移 ;6 bt毒素对土壤生物和生态过程的影响。转 bt基因作物的 bt毒素对土壤生态系统的影响急需在生态系统水平进行深入细致的长期定位研究。

关键词：转bt基因作物 bt毒素土壤环境去向生态效应土壤生物土壤生态系统

转基因植物释放bt毒素的土壤环境行为与生物学效应

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土壤学报 2005年第6期42卷 1024-1029页

作者：姚艳玲崔海瑞卢美贞忻雅浙江大学原子核农业科学研究所杭州310029

bt(Bacillus thuringiensis)杀虫晶体蛋白基因是植物抗虫基因工程中应用最广泛的基因,随着大批转bt基因作物的商品化,bt毒素对土壤生态系统的影响已引起了人们的高度关注。本文对转基因植物释放bt毒素的土壤环境行为与生物效应进行了综... 详细信息

bt(Bacillus thuringiensis)杀虫晶体蛋白基因是植物抗虫基因工程中应用最广泛的基因,随着大批转bt基因作物的商品化,bt毒素对土壤生态系统的影响已引起了人们的高度关注。本文对转基因植物释放bt毒素的土壤环境行为与生物效应进行了综述,包括bt毒素蛋白进入土壤的途径、在土壤中的运动、与土壤颗粒的结合与存留及其对土壤生物和土壤酶的影响。

关键词：转基因植物 bt毒素土壤环境行为生物学效应

Cry1Ie毒素胁迫下亚洲玉米螟的抗性发展及汰选种群对其他bt毒素的交互抗性

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昆虫学报 2013年第10期56卷 1135-1142页

作者：贺明霞何康来王振营王新颖李庆四川农业大学农学院成都611130 中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室北京100193

亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis(Guenée)是危害玉米的重要害虫之一,转bt基因抗虫玉米为其防治提供了新的途径。然而,靶标害虫产生抗性将严重阻碍bt制剂及转bt基因抗虫玉米的持续应用。明确害虫对转bt基因玉米表达的毒素蛋白的抗性演化... 详细信息

亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis(Guenée)是危害玉米的重要害虫之一,转bt基因抗虫玉米为其防治提供了新的途径。然而,靶标害虫产生抗性将严重阻碍bt制剂及转bt基因抗虫玉米的持续应用。明确害虫对转bt基因玉米表达的毒素蛋白的抗性演化,对于制定科学有效的抗性治理策略具有重要的理论和实际意义。本实验通过人工饲料汰选法研究了bt Cry1Ie毒素胁迫下亚洲玉米螟的抗性发展及汰选14代的种群对其他bt毒素(Cry1Ab,Cry1Ac和Cry1Fa)的交互抗性,并观察了Cry1Ie蛋白胁迫对亚洲玉米螟生物学的影响。结果表明:随着汰选压不断提高,亚洲玉米螟种群对Cry1Ie毒素的敏感性逐渐下降。汰选14代后,种群对Cry1Ie毒素的抗性水平提高了23倍。然而,Cry1Ab,Cry1Ac和Cry1Fa对所获Cry1Ie汰选种群的毒力与对敏感种群的毒力相比没有显著差异,说明Cry1Ie汰选没有引起亚洲玉米螟对Cry1Ab,Cry1Ac和Cry1Fa毒素产生交互抗性。同时,与敏感种群相比,Cry1Ie汰选14代的种群幼虫平均发育历期延长5.7 d,蛹重减轻13.7%,单雌产卵量下降40.0%。本研究结果说明,大面积单一种植转cry1Ie基因抗虫玉米,可能引起亚洲玉米螟产生抗性;亚洲玉米螟Cry1Ie抗性种群对Cry1Ab,Cry1Ac和Cry1Fa没有交互抗性,含有cry1Ie和cry1Ab,cry1Ac或cry1F双/多基因抗虫玉米,可作为靶标害虫抗性治理的重要策略。

关键词：亚洲玉米螟 bt毒素抗性汰选抗性发展生物学抗性治理

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bt毒素对稻飞虱安全性评价和活性菌株筛选

Bt毒素对稻飞虱安全性评价和活性菌株筛选

作者：王增霞南京农业大学

学位级别：硕士

稻飞虱是水稻上最主要的害虫之一,主要包括褐飞虱、白背飞虱和灰飞虱,给水稻的生产造成了严重危害。苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,简称bt）产品以其高效安全、对目标害虫的特异性而倍受亲睐,并逐渐成为研究最深入、应用最广... 详细信息

稻飞虱是水稻上最主要的害虫之一,主要包括褐飞虱、白背飞虱和灰飞虱,给水稻的生产造成了严重危害。苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,简称bt）产品以其高效安全、对目标害虫的特异性而倍受亲睐,并逐渐成为研究最深入、应用最广泛的生物杀虫剂。目前关于bt防治害虫的研究主要集中在鳞翅目、鞘翅目等防治效果显著的害虫中,带来了很好的经济和生态效益,但尚未见到对稻飞虱有毒力菌株的报道。为了实现用bt类产品防治稻飞虱,开发利用对稻飞虱有特效的bt制剂,本文首先建立了测定杀虫化合物对稻飞虱潜在影响的Tier-1毒性测定模型,并用该模型对已经成功转入水稻的bt毒素对非靶标害虫稻飞虱进行风险评价,以预测稻飞虱在抗虫转基因水稻田间发生与为害的可能趋势。bt毒素与害虫中肠BBMV上的受体结合是毒素发挥毒性作用的关键步骤,因此本文对稻飞虱可能的bt受体碱性磷酸酯酶（alkaline phosphatase,简称ALP）从生物化学和分子生物学等方面进行初步研究,克隆到两条ALP的基因并对其功能进行鉴定;最后对大量标准的bt菌株进行室内生物测定,筛选对稻飞虱有活性及特异性菌株,为后续发展转bt基因水稻防治稻飞虱提供理论基础。通过对以上内容的研究,得出了以下几点结论：一、bt毒素对非靶标害虫稻飞虱的风险评价首先选用合适的人工饲料发展了一套评价纯杀虫蛋白对灰飞虱潜在影响的毒性测定模型,用E-64和PA作为模式化合物验证所建立的Tier-1试验模型的灵敏性,试验结果显示,本试验建立的Tier-1毒性测定模型具有较高的灵敏度。借助此模型就Cry2Aa杀虫蛋白对灰飞虱生存率、若虫发育历期和初羽化成虫鲜重的影响作较系统研究,结果表明Cry2Aa对灰飞虱无毒性影响。另外,试验中还通过ELISA和靶标昆虫生测技术全程监测杀虫化合物的浓度、稳定性及生物活性。二、两种碱性磷酸酯酶的生化及分子生物学初步研究本文克隆和测定酶活性均以褐飞虱的整个虫体做为研究对象,采用超速离心的方式分离纯化了可溶性和膜结合两种碱性磷酸酯酶,在最佳pH环境下测定两种碱性磷酸酯酶的酶活性;并采用简并引物PCR和RACE技术克隆了褐飞虱两种碱性磷酸酯酶的全长基因,这是在半翅目昆虫中率先鉴定出来的碱性磷酸酯酶基因。它们与其它昆虫的碱性磷酸酯酶序列都具有40%-50%的相似性,序列比对分析显示两种碱性磷酸酯酶都存在一个假定的碱性磷酸酯酶的信号区域和13个重要功能氨基酸。此外,N1-ALP2包含一个假定的GPI锚定的位点,而Nl-ALPl没有该位点。并通过Western Blotting实验直接证明这两个基因分别编码可溶性的和膜结合的碱性磷酸酯酶,因此将两个基因分别命名为Nl-sALP和Nl-mALP. 三、对稻飞虱有活性的bt菌株的筛选本文利用人工饲料对灰飞虱进行大量bt菌株筛选,利用该方法对68株标准的bt菌株进行活性筛选,结果筛选到1株其晶体蛋白和可溶性小分子均对灰飞虱有较高毒性的bt菌株T42001,且对其进一步分离纯化后得到其对灰飞虱的LC50为6.58μl/m;,表明该菌株对灰飞虱的确有较高的毒性。对该菌株的晶体蛋白部分电泳后,得到蛋白大小为90kDa、60kDa和31kDa左右的几条带,与目前已发现的活性杀虫蛋白的条带大小有所不同。本研究从不同层面揭示了bt毒素在防治稻飞虱方面的可能性,可推动bt菌株在防治稻飞虱方面的研究进展,为实现bt菌株防治稻飞虱、发展转bt基因水稻提供理论基础。

关键词：稻飞虱 bt毒素风险评价碱性磷酸酯酶活性bt菌株