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一种新的CD13小分子抑制剂抗肝癌的作用及其机制研究

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一种新的CD13小分子抑制剂抗肝癌的作用及其机制研究

作者：庞敏山东大学

学位级别：硕士

研究目的肝癌是全球发病率第五、死亡率第二的恶性肿瘤,严重威胁着人类的生命。当前,肝癌在全球的发病率呈上升趋势,中国新增肝癌病例和死亡人数均居世界首位,约占全球总数的50%左右。由于肝癌的预后不佳,因此,需要寻求新的治疗手段或... 详细信息

研究目的肝癌是全球发病率第五、死亡率第二的恶性肿瘤,严重威胁着人类的生命。当前,肝癌在全球的发病率呈上升趋势,中国新增肝癌病例和死亡人数均居世界首位,约占全球总数的50%左右。由于肝癌的预后不佳,因此,需要寻求新的治疗手段或药物。CD13,又称氨肽酶N(APN),是一种Zn2+依赖的位于细胞表面的金属蛋白酶,能够与从寡肽N末端切除氨基酸的糖蛋白结合。CD13在多种组织细胞均有表达,例如神经细胞、髓样细胞、内皮细胞以及成纤维细胞等。同时,CD13在急性髓性白血病和多种实体瘤组织中呈现高表达的现象。因此,该分子又被称作肿瘤标记分子。由于CD13分布范围广,且生物学功能多样,不仅参与多种生理病理过程,还可作为肝癌干细胞的标志分子。由于CD13分布广泛,在临床治疗中需要选择特异性强的靶向抑制剂进行治疗,这是研发新型CD13抑制剂所面临的最大挑战。由此,本研究利用分子生物学手段,通过体内外实验,对我院药物化学课题组合成的新的CD13小分子抑制剂4.1-3k在治疗肝癌中的作用进行了研究,并对其作用机制进行了探讨,为临床治疗肝癌以及研发靶向药物提供了参考。研究方法1.以肝癌细胞系为模型,采用流式细胞术检测CD13分子在不同细胞系表面的表达情况;2.采用 MTT 法检测 CD13 抑制剂对 HepG2、PLC/PRF/5 以及 HepG2.2.15细胞增殖能力的影响;PI单染、Annexin V/PI双染法分别检测CD13抑制剂对HepG2、PLC/PRF/5以及HepG2.2.15细胞周期和细胞凋亡的影响;荧光定量PCR及Western Blot实验检测细胞凋亡基因Bcl-2、Bax的表达变化;***实验分析CD13抑制剂对HepG2、HepG2.2.15细胞迁移的影响;荧光定量PCR检测经CD13抑制剂处理的HepG2、HepG2.2.15细胞中基质金属蛋白酶MMP2、MMP9的表达;4.血管生成实验检测CD13抑制处理HepG2、PLC/PRF/5以及HepG2.2.15细胞后的血管生成情况;荧光定量PCR检测经CD13抑制剂处理的HepG2和HepG2.2.15细胞中与血管生成相关的VEGF、MCP-1等基因的表达;*** blot 实验检测 CD13 抑制剂对 HepG2、HepG2.2.15 细胞 MAPK、NF-κB以及STAT3信号通路基因表达;荧光定量PCR检测经CD13抑制剂处理的HepG2以及HepG2.2.15细胞中炎症因子IL-6、IL-10等基因的表达;6.流式细胞术检测DEN/CCL4诱导肝纤维化模型、HBV模型、肝癌细胞荷瘤模型小鼠各个器官中CD13的表达,统计经CD13抑制剂治疗后的荷瘤裸鼠的生存期;7.建立肝癌的肺转移模型,经CD13抑制剂治疗后观测肺组织的转移情况;研究结果***13在不同肝癌细胞中表达情况不同,其中含S抗原或HBV基因组的肝癌细胞系中CD13表达较高。***13抑制剂显著抑制肝癌细胞的增殖能力,对HepG2.2.15细胞的作用最为明显;在高表达CD13的肝癌细胞系中,4.1-3k的抑制效果强于对照药bestatin。CD13抑制剂处理后,肝癌细胞凋亡比例增加,4.1-3k在高表达CD13的肝癌细胞系中促凋亡效果强于bestatin,但对细胞周期无影响。***13抑制剂能够抑制HepG2、HepG2.2.15细胞迁移,且作用效果强于bestatin。同时,基质金属蛋白酶MMP2、MMP9在经CD13抑制剂处理后的细胞中表达下调。***13抑制剂处理肝癌细胞后,新生血管的生成明显受到抑制。在CD13高表达的肝癌细胞系中,4.1-3k抑制血管生成作用明显优于bestatin。同时,血管生成相关基因VEGF、MCP-1在CD13抑制剂处理后显著下调。5.经CD13抑制剂处理后,HepG2、HepG2.2.15细胞中MAPK、NF-κB以及STAT3信号通路相关基因的活化受到抑制;同时,细胞中炎症因子IL-6、IL-8表达显著下调。***/CCL4诱导的肝脏纤维化模型小鼠及HBV模型小鼠中,CD13在免疫负调细胞中表达较高。经CD13抑制剂治疗后,HCC荷瘤小鼠中肿瘤的生长受到抑制,生存期延长。7.在BALB/c肺转移模型小鼠中,经CD13抑制剂治疗后肺结节数目明显减少,且在4.1-3k组效果最为显著。结论及意义本文对新型的CD13小分子抑制剂4.1-3k的抗肝癌作用进行系统评价,发现4.1-3k可通过促进肿瘤细胞凋亡抑制肿瘤细胞生长,同时可以抑制肿瘤细胞的迁移和新生血管的形成,从而发挥有效的抗HCC作用。体内小鼠模型实验发现,4.1-3k能抑制肝癌生长和转移,大大提高荷瘤小鼠存活率。因此,CD13小分子抑制剂4.1-3k可作为治疗肝癌的候选药物,为研发更加

关键词：肝癌 CD13 bestatin 4.1-3k

茉莉酸信号转导突变体ber15的筛选和基因克隆

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茉莉酸信号转导突变体ber15的筛选和基因克隆

作者：耿宇广西大学

学位级别：硕士

作为一种重要植物激素，茉莉酸在调控植物的抗性反应方面起必不可少的作用。但目前对茉莉酸信号转导的分子机理所知甚少。bestatin是一种氨肽酶抑制剂，能够在拟南芥和番茄中激活茉莉酸信号转导途径而诱导抗性相关基因的表达，从而为用... 详细信息

作为一种重要植物激素，茉莉酸在调控植物的抗性反应方面起必不可少的作用。但目前对茉莉酸信号转导的分子机理所知甚少。bestatin是一种氨肽酶抑制剂，能够在拟南芥和番茄中激活茉莉酸信号转导途径而诱导抗性相关基因的表达，从而为用化学遗传学手段解析茉莉酸途径提供了一个有效的工具。ber15是我们鉴定到的一个对bestatin对植物根部伸长抑制作用不敏感的拟南芥突变体，该突变体对外源茉莉酸对根伸长抑制作用的敏感性也明显降低，表明相应的野生型基因BER15在茉莉酸信号转导中起重要作用。图位克隆结果表明，ber15的突变表型是由于一个编号为AT3g30180的基因发生单碱基突变造成的，该基因编码一个细胞P450单加氧酶。该酶不仅具有油菜素甾酮合成酶活性还具有催化油菜素甾酮向油菜素内酯转化的活性，是植物激素油菜素内酯合成途径中的一个关键酶。BER15基因的成功克隆，一方面表明利用bestatin建立起来的化学遗传学体系是成功的，可以为进一步探索JA信号途径提供新的思路和方法;另一方面也证实该基因同时关系到生长势和抗性两大农艺性状。这个基因无疑将成为以培育绿色蔬菜为目的的基因改良的优秀侯选基因。对BER15基因功能的深入研究将会为了解油菜素内酯合成与茉莉酸信号途径间的互作关系提供证据。

关键词：茉莉酸 bestatin 油菜素内酯化学遗传学图位克隆信号互作

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茉莉酸信号途径的化学遗传学解析

茉莉酸信号途径的化学遗传学解析

作者：翟庆哲山东农业大学

学位级别：硕士

作为一种重要植物激素,茉莉酸在调控植物对昆虫侵害、病原菌侵染的抗性反应方面起必不可少的作用。但目前对茉莉酸信号转导的分子机理所知甚少。为了鉴定茉莉酸信号传导途径的新组分,本研究以小分子化合物bestatin为工具,建立了用化学... 详细信息

作为一种重要植物激素,茉莉酸在调控植物对昆虫侵害、病原菌侵染的抗性反应方面起必不可少的作用。但目前对茉莉酸信号转导的分子机理所知甚少。为了鉴定茉莉酸信号传导途径的新组分,本研究以小分子化合物bestatin为工具,建立了用化学遗传学方法解析茉莉酸信号途径的研究体系。bestatin是一种氨肽酶抑制剂,在以前的报道中发现它能够诱导番茄中抗性相关基因的表达。我们以番茄和拟南芥中茉莉酸合成和信号传导突变体为材料,利用遗传学和生理生化手段证明bestatin可以特异性的激活植物体内的茉莉酸信号转导途径。首先,bestatin可以特异的激活拟南芥和番茄中茉莉酸诱导的基因表达。其次,bestatin的这种作用依赖于茉莉酸信号转导途径中非常重要的组分COI1,但是不依赖于茉莉酸的合成。第三,利用拟南芥全基因组芯片分析表明,bestatin和茉莉酸诱导非常类似的基因表达模式。第四,植物被施加bestatin后,还可表现出一系列与茉莉酸有关的生长发育方面的表型,包括抑制主根生长、促进侧根发生、诱导花青素积累等。综上所述,bestatin可能通过修饰JA信号转导途径中一些重要的调节因子而在茉莉酸信号途径中发挥着独特的作用,因而为用化学遗传学方法解析茉莉酸信号转导途径提供了一个有力的工具。我们利用bestatin抑制主根伸长作为指标,通过筛选拟南芥EMS诱变的M2代群体,得到了一系列bestatin不敏感突变体(ber)。进一步分析发现,一些ber突变体对茉莉酸诱导的反应表现出各种变化,因此将ber突变体分为三种类型:JA不敏感ber突变体,JA超敏感ber突变体和正常JA反应的ber突变体。通过对这些ber突变体进行遗传学和基因表达水平的分析发现它们确实表现出对茉莉酸反应的改变,并且是茉莉酸信号转导途径中的新组分。

关键词：番茄拟南芥 bestatin 茉莉酸信号转导

一种利用荧光标记检测氨肽酶N抑制剂与肿瘤细胞结合的方法

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现代生物医学进展 2014年第4期14卷 634-638页

作者：王婷阮林高戈梅钱秀萍上海交通大学药学院上海200240 上海来益生物药物研发中心上海201203

目的:建立利用荧光标记法检测氨肽酶抑制剂和肿瘤细胞结合的方法。方法:以异硫氰酸荧光素(FITC)标记氨肽酶N抑制剂LYRM03和bestatin,制备荧光探针FITC-LYRM03、FITC-bestatin,应用荧光显微成像观察和流式细胞仪检测标记化合物FITC-LYRM0... 详细信息

目的:建立利用荧光标记法检测氨肽酶抑制剂和肿瘤细胞结合的方法。方法:以异硫氰酸荧光素(FITC)标记氨肽酶N抑制剂LYRM03和bestatin,制备荧光探针FITC-LYRM03、FITC-bestatin,应用荧光显微成像观察和流式细胞仪检测标记化合物FITC-LYRM03、FITC-bestatin对肿瘤细胞的结合与氨肽酶N抑制活性的相关性。结果:化合物LYRM03和bestatin具有肿瘤细胞的氨肽酶N抑制活性,荧光标记化合物FITC-LYRM03、FITC-bestatin能与肿瘤细胞有不同程度的结合。结论:标记化合物FITC-LYRM03、FITC-bestatin和肿瘤细胞的结合与对肿瘤细胞的氨肽酶N抑制活性相一致。

关键词：氨肽酶N抑制剂 LYRM03 bestatin 异硫氰酸荧光素

P-gp抑制乌苯美司的小肠吸收及其抗肿瘤作用

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P-gp抑制乌苯美司的小肠吸收及其抗肿瘤作用

氨肽酶抑制剂对全反式维甲酸诱导人急性早幼粒白血病细胞株NB4细胞分化作用的影响及其机制的初步探讨

第十届全国药物和化学异物代谢学术会议暨第三届国际ISSX/CSSX联合学术会议

作者：霍晓奎刘琦王长远孟强孙慧君刘克辛大连医科大学临床药理教研室

目的揭示P-gP对乌苯美司(bestatin)肠道吸收抗肿瘤活性的影响。方法应用大鼠in vivo口服、in situ肠灌流、in vitro翻转肠实验和Caco-2细胞摄取、mock-/MDR1-MDCK细胞双向转运实验,MTT实验、药物蓄积实验以及real timeRT-PCR实验探究P-g... 详细信息

目的揭示P-gP对乌苯美司(bestatin)肠道吸收抗肿瘤活性的影响。方法应用大鼠in vivo口服、in situ肠灌流、in vitro翻转肠实验和Caco-2细胞摄取、mock-/MDR1-MDCK细胞双向转运实验,MTT实验、药物蓄积实验以及real timeRT-PCR实验探究P-gP和bestatin的相互作用关系。LC-MS/MS检测生物样品中bestatin含量。结果 P-gP抑制剂环孢素A和维拉帕米显著增加bestatin在大鼠体内外的吸收以及Caco-2细胞的摄取。mock-/MDR1-MDCK转运bestatin的净外排比为2.2,bestatin浓度依赖的抑制地高辛的外排转运。合用P-gP抑制剂后,bestatin对U937和K562细胞的IC明显下降,胞内蓄积显著增多。K562细胞的阿霉素耐药株K562/ADR的IC50较K562细胞高,胞内蓄积较少,这种现象可被阿霉素逆转。bestatin不影响K562和K562/ADR细胞中P-gP和APN的表达。结论 P-gP抑制剂增强bestatin在小肠的吸收及其抗肿瘤作用,bestatin是P-gP的底物。提示乌苯美司与其他P-gP底物在临床合用时,可能发生潜在的药物相互作用。

关键词： P-gp bestatin 肠道吸收抗增殖效应

来源： cnki会议评论

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中国实验血液学杂志 2006年第3期14卷 471-476页

作者：林茂芳钱习军浙江大学医学院附属第一医院血液科杭州310003

为了研究氨肽酶抑制剂乌苯美司(bestatin)对全反式维甲酸(ATRA)诱导人APL细胞株NB4细胞分化作用的影响及其可能机制,NB4细胞经bestatin和ATRA单用或联合应用处理一定时间后,用光学显微镜观察细胞形态,流式细胞仪检测CD11b表达,四氮唑蓝(... 详细信息

为了研究氨肽酶抑制剂乌苯美司(bestatin)对全反式维甲酸(ATRA)诱导人APL细胞株NB4细胞分化作用的影响及其可能机制,NB4细胞经bestatin和ATRA单用或联合应用处理一定时间后,用光学显微镜观察细胞形态,流式细胞仪检测CD11b表达,四氮唑蓝(NBT)还原实验检测分化细胞功能,RT-PCR法检测c-myc和c-EBPεmRNA表达,Westernblot检测c-Myc蛋白表达。结果显示:NB4细胞经100μg/mlbestatin和10nmol/LATRA联合处理72小时后,其分化的形态更明显;100μg/mlbestatin与不同浓度ATRA联合处理72小时,能增强NB4细胞的NBT还原能力,与单用相应浓度ATRA组相比,差异显著(Pbestatin能增强10nmol/LATRA诱导NB4细胞的NBT还原能力,且呈时间依赖性,与相应时间点ATRA组相比,差异明显(Pbestatin(100μg/ml)联用处理72小时,NB4细胞CD11b阳性表达率明显增加(Pbestatin处理4小时后,NB4细胞c-mycmRNA表达的降低更明显(Pbestatin与10nmol/LATRA联合处理8小时后,NB4细胞c-Myc蛋白表达水平明显降低,与单用ATRA组相比差异显著(Pbestatin联用不能增强10nmol/LATRA上调c-EBPεmRNA的表达;50、75、100μg/mlbestatin单独处理对NB4细胞的分化无影响。结论:氨肽酶抑制剂bestatin能够增强ATRA对NB4细胞的诱导分化作用,这可能与bestatin协同ATRA下调c-myc的表达有关。

关键词： bestatin ATRA 细胞株,NB4 细胞分化

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乌比美克对正常小鼠神经系统的影响

四川生理科学杂志 1999年第4期21卷 28-28页

作者：王萍沈炜明陈荣秀四川抗菌素工业研究所药理室

乌比美克(bestatin,下称BS)是一种小分子肽物质,该物质是日本学者在链球菌Streptomyces olivoretic-uli的培养液中发现的。临床研究发现,BS使急性非淋巴性白血病的初次完全缓解期及生存期均有显著延长;对维持非何杰金氏淋巴瘤完全缓解... 详细信息

乌比美克(bestatin,下称BS)是一种小分子肽物质,该物质是日本学者在链球菌Streptomyces olivoretic-uli的培养液中发现的。临床研究发现,BS使急性非淋巴性白血病的初次完全缓解期及生存期均有显著延长;对维持非何杰金氏淋巴瘤完全缓解有效。对白细胞介素1、2的生成均有促进作用,因此,BS是一种有价值的抗肿瘤免疫增强剂,为了进一步研究BS对重要生理系统的影响,我们进行了BS对正常小鼠神经系统的影响研究,包括对正常小鼠一般行为的影响和对正常小鼠协调运动的影响。

关键词：乌比美克正常小鼠神经系急性非淋巴性白血病白细胞介素1 协调运动免疫增强剂非何杰金氏临床研究 bestatin