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小鼠骨髓基质细胞系bmsc1的建立及鉴定

科学通报 1996年第8期41卷 744-748页

作者：刘倩张平夏刘祝公吴江声陈慰峰北京医科大学免疫学系北京100083

对T细胞发育的研究表明:胸腺是T细胞发育的主要场所,来源于骨髓的pro-T细胞进入胸腺,在胸腺微环境的作用下,经阳性和阴性选择逐渐发育为成熟的T细胞输出胸腺。但目前对T细胞在骨髓内是如何由造血干细胞分化成pro-T细胞的发育过程还不太... 详细信息

对T细胞发育的研究表明:胸腺是T细胞发育的主要场所,来源于骨髓的pro-T细胞进入胸腺,在胸腺微环境的作用下,经阳性和阴性选择逐渐发育为成熟的T细胞输出胸腺。但目前对T细胞在骨髓内是如何由造血干细胞分化成pro-T细胞的发育过程还不太清楚,骨髓微环境与此过程密切相关。现在的研究表明骨髓造血微环境主要是由骨髓基质细胞(Bone Marrow Stromal Cell,bmsc)及其分泌的细胞外基质、细胞因子三者共同组成,影响着造血细胞的粘附、增殖和分化。其中骨髓基质细胞是关键成分,主要包括成纤维细胞、脂肪细胞、巨噬细胞、内皮细胞和上皮细胞等。各种基质细胞网状分隔构成微环境支架,造血细胞在此微环境支架中与基质细胞相互作用并接受基质细胞分泌的造血因子的刺激而增殖分化。研究T细胞在骨髓内发育途径及分化机理,须分析bmsc类型、功能及其与发育中的T细胞的相互作用效应,其体外培养可以仔细分析骨髓微环境的作用。为此,我们继建成了小鼠胸腺基质细胞系以后,开始建立小鼠骨髓基质细胞系,本文报道所建骨髓基质细胞系bmsc1,并对其进行了细胞学鉴定分析。

关键词：骨髓基质细胞系上皮细胞角蛋白张力丝 bmsc

bmsc和HUVEC来源的外泌体复合介孔生物玻璃促进成骨的研究

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BMSC和HUVEC来源的外泌体复合介孔生物玻璃促进成骨的研究

作者：曲博中国人民解放军海军军医大学

学位级别：硕士

研究目的1、对于临床医生来说,治疗由创伤,感染,肿瘤或遗传畸形引起的大面积骨缺损是一项重大挑战。为了解决上述问题,促进缺失骨的再生,我们对一种骨再生支架材料—介孔生物玻璃进行表征,并研究其在骨传导(用于诱导新骨生成)、骨刺激(... 详细信息

研究目的1、对于临床医生来说,治疗由创伤,感染,肿瘤或遗传畸形引起的大面积骨缺损是一项重大挑战。为了解决上述问题,促进缺失骨的再生,我们对一种骨再生支架材料—介孔生物玻璃进行表征,并研究其在骨传导(用于诱导新骨生成)、骨刺激(促进新骨形成)和血管生成(诱导血管形成)方面的生物特性。2、有研究表明外泌体作为一种新型细胞因子具有促进骨缺损修复的功能。我们对外泌体进行表征,并通过细胞实验的方法,研究其在人脐静脉内皮细胞和骨髓间充质干细胞中促进增殖、粘附、迁移和分化的功能。3、将介孔生物玻璃和外泌体复合,通过动物实验研究其促进骨再生的能力。研究方法对介孔生物玻璃和不同来源的外泌体(HUVEC-Exo、bmsc-Exo)进行相应研究,将提取好的Exo加入到HUVEC和bmsc中,通过扫描电镜(SEM),透射电镜(TEM),NTA,FNA,WB,吞噬实验LSCM等进行表征,并最终将其负载在MBG支架上植入到大鼠颅骨缺损的部位,一定时间后取材进行MicroCt扫描,并进行数据统计,验证成骨效果。结果1、HUVEC在一定条件下培养后的增殖、迁移、成管实验、VEGF荧光、VEGF释放及蛋白表达水平。其中bmsc-Exo L和bmsc-Exo H组均强于Control组,差异有统计学差异,而且bmsc-Exo H强于bmsc-Exo L组,差异有统计学差异。2、bmsc在一定条件下培养后的增殖、迁移实验、VEGF荧光、VEGF释放及OPN,ALP,RUNX-2基因表达、蛋白表达水平。其中HUVEC-Exo L和HUVEC-Exo H组均强于Control组,差异有统计学差异,而且HUVEC-Exo H强于HUVEC-Exo L组,差异有统计学差异。3、在颅骨缺损体内动物模型建立后,培养3个月,MicroCT扫描图像显示bmsc-Exo L和bmsc-Exo H组成骨效果均强于Control组,而且在定量数据上bmsc-Exo H成骨效果强于bmsc-Exo L组。结论综上,我们通过体外实验证明了bmsc来源的外泌体能够促进HUVEC相关基因PI3K/AKT,ERK1/2的表达,促进HUVEC的增殖、迁移、成骨和VEGF分泌;同时HUVEC来源的外泌体能够对bmsc产生促进作用,促进Wnt/β-Catenin通路的激活,促进bmsc的增殖、迁移和VEGF表达,促进相应成骨基因BMP-2,OPN,ALP,COL-1,RUNX-2的表达。通过体内实验,通过Micro CT初步证实了负载bmsc-Exo的MBG能够明显地促进骨缺损愈合。综上所述,介孔生物玻璃负载bmsc来源的外泌体能够促进骨再生。

关键词：生物玻璃 bmsc Scholar 骨再生颅骨缺损支架材料细胞实验动物模型建立扫描图像基因表达

bmsc来源外泌体减轻CCN1介导的缺氧肝细胞线粒体损伤及凋亡

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BMSC来源外泌体减轻CCN1介导的缺氧肝细胞线粒体损伤及凋亡

作者：李一敬华中科技大学

学位级别：硕士

肝脏是人体重要的器官之一,具有代谢、糖原储存、药物解毒、胆汁分泌等广泛的功能。肝功能对于体内平衡至关重要,手术,创伤,药物等会造成肝脏损伤,并导致肝功能受损甚至死亡。而肝组织结构中80%的肝细胞,是肝功能的主要执行者,也是缺血... 详细信息

肝脏是人体重要的器官之一,具有代谢、糖原储存、药物解毒、胆汁分泌等广泛的功能。肝功能对于体内平衡至关重要,手术,创伤,药物等会造成肝脏损伤,并导致肝功能受损甚至死亡。而肝组织结构中80%的肝细胞,是肝功能的主要执行者,也是缺血缺氧应激损伤的靶细胞。肝细胞中富含线粒体,当细胞受到氧化应激损伤时会造成线粒体损伤,改变线粒体通透性和膜电位,进而诱发细胞凋亡。因此,肝细胞线粒体损伤及凋亡在缺血缺氧引起的肝脏疾病中发挥关键作用。骨髓间充质干细胞(Bone marrow derived mesenchymal stem cells,bmsc)是骨髓来源的多功能干细胞,具有分化为多种细胞的潜力,可用于治疗肝脏疾病,但干细胞治疗可引起栓塞、异常分化及肿瘤形成等潜在风险。近来诸多研究认为bmscs主要通过旁分泌机制调节免疫反应,下调局部炎症损伤。其中bmsc来源的外泌体(exosomes)是旁分泌的重要成分,在细胞通讯中发挥重要作用。外泌体(exosomes)是由细胞分泌的直径在40-150nm的囊状膜泡,其中富含蛋白和RNA,尤其是miRNAs,具有低免疫原性,生物相容性等优势,可以对细胞增殖、迁移、凋亡等多种生物学进程进行调控。富含半胱氨酸蛋白61(Cellular Communication Network Factor 1,CCN1)作为一种细胞基质蛋白,可以参与细胞增殖,分化,凋亡等过程,当细胞损伤发生时,往往伴随CCN1水平升高,不同类型细胞中CCN1可通过激活线粒体途径及TNF-α受体途径激活凋亡。但bmsc来源的exosomes在缺氧性肝细胞损伤中的作用机制,尤其是与CCN1在肝细胞线粒体损伤及凋亡中的作用方式尚未阐明,因此本文将重点研究bmsc来源的exosomes通过降低CCN1减轻氧化应激状态下肝细胞线粒体损伤及凋亡的具体机制,为缺血等缺氧肝损伤的治疗提供新的治疗策略。我们用过氧化氢(hydrogen peroxide,HO)诱导肝细胞株L02建立肝缺氧损伤模型。首先确定bmsc分泌的exosomes是否对肝细胞具有保护作用。收集bmsc的培养基上清与L02细胞在缺氧条件下共孵育,发现bmsc培养上清能减轻细胞凋亡,保护线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP),降低活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平。随后用exosomes分泌抑制剂-GW4869处理bmsc并收取上清,重复上述实验,结果显示bmsc上清对肝细胞的保护作用消失。最后通过超速离心提取bmsc培养上清中的exosomes并重复上述实验,发现exosomes对细胞同样具有保护作用。为分析exosomes保护肝细胞的分子机制,通过转录组测序对bmsc exosomes处理的缺氧肝细胞、单纯缺氧肝细胞及常氧培养肝细胞中差异表达的基因进行了筛选,并通过DAVID数据库对显著差异表达基因进行生物信息学分析,将响应缺氧诱导并受bmsc exosomes调节,且参与肝细胞凋亡的最佳候选基因初步锁定为CCN1。进一步运用Real time-PCR对测序结果进行确认,发现CCN1在正常细胞中的表达量很低,当HO/缺氧刺激细胞后明显升高,而exosomes能够显著抑制氧化应激导致的CCN1升高。为进一步研究exosomes发挥保护功能是否通过CCN1介导,我们构建CCN1稳转细胞系,发现CCN1过表达(CCN1-over expression)不但会加重HO/缺氧诱导的肝细胞凋亡,而且会完全阻断bmsc来源exosomes的缺氧肝细胞保护效应;降低CCN1表达(sh-CCN1)能显著减轻HO/缺氧诱导的肝细胞凋亡,bmsc来源exosomes对低表达CCN1 L02细胞的保护作用亦不明显。上述结果说明bmsc exosomes通过降低缺氧诱导的CCN1减轻肝细胞凋亡。我们还通过生物信息学对bmsc exosomes中富含的miRNAs调控CCN1表达的可能机制进行了初步分析。对已发表文献的bmsc exosomes miRNAs测序数据二次分析,筛选出可能负调控CCN1且在exosomes中富集的miR-22-3p。但具体调控机制还需后续实验验证。为了探究缺氧时CCN1转录水平升高的机制,通过Animal TFDB数据库和L02细胞转录组测序结果取交集筛选出可能结合CCN1启动子的转录因子锌指和含有7B的BTB结构域(Zinc Finger And BTB Domain Containing 7B,ZBTB7B),初步验证缺氧能够促进ZBTB7B的表达,与CCN1变化一致;且exosomes能够使ZBTB7B m RNA和蛋白水平下降,提示exosomes可能通过抑制ZBTB7B对CCN1表达进行调控

关键词：线粒体 bmsc exosomes CCN1 miR-22-3p ZBTB7B

高糖对BMP-2、IGF-Ⅰ基因转染大鼠bmsc增殖的影响

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高糖对BMP-2、IGF-Ⅰ基因转染大鼠BMSC增殖的影响

作者：吴建军山东大学

学位级别：硕士

背景骨折愈合是一个复杂的机体自身修复过程,需要多种生长因子参与。临床上糖尿病合并骨折患者很常见,延迟愈合或不愈合发生率高,是临床医师面临的棘手问题。研究认为糖尿病骨折愈合过程中血清及局部骨痂组织中骨形态发生蛋白-2（Bone m... 详细信息

背景骨折愈合是一个复杂的机体自身修复过程,需要多种生长因子参与。临床上糖尿病合并骨折患者很常见,延迟愈合或不愈合发生率高,是临床医师面临的棘手问题。研究认为糖尿病骨折愈合过程中血清及局部骨痂组织中骨形态发生蛋白-2（Bone morphogenetic protein-2, BMP-2）、胰岛素样生长因子-I（Insulin-like growth factor-1, IGF-I）含量减少是导致骨折延迟愈合、不愈合的原因之一。随着干细胞工程和组织工程的研究进展,骨髓基质干细胞已成为研究和治疗多种骨科疾病及其合并症的一种重要方法。BMP-2、IGF-I均具有促进bmsc增殖及向成骨细胞分化的作用,而关于两者联合应用对bmsc增殖及分化效应尚缺乏系统研究。目的高糖环境下通过测定BMP-2、IGF-I基因转染大鼠bmsc后,目的蛋白表达情况及bmsc的增殖情况,进一步了解基因转染bmsc的生物学特性,为构建新型组织工程骨种子细胞提供思路,从而为临床上应用bmsc移植治疗糖尿病骨折不愈合、延迟愈合提供实验依据。方法用Ad-BMP-2和Ad-IGF-I转染大鼠bmsc,按转染情况分为5组：A组：未转染组;B组：转染空载体组;C组：转染BMP-2组;D组：转染IGF-I组;E组：BMP-2加IGF-I共转染组。分别于转染处理后24h、48h、72h、96h荧光显微镜下观察转染效果;不同时间点观察各组大鼠bmsc的形态变化;利用蛋白印迹法（Western blotting）检测转染后24h、48h、72h各组细胞BMP-2和IGF-I的表达情况。绘制细胞生长曲线、采用噻唑蓝（MTT）比色法及流式细胞仪,观察大鼠bmsc的生长及增殖情况。利用SPSS16.0统计软件进行统计,P＜0.05表示差异有统计学意义。结果（1）基因转染组（C、D、E组）与未转染组及空载体组比较,转染处理后初期,细胞形态无明显变化;随着培养时间延长,基因转染组多角形细胞增多。（2）荧光显微镜下观察到基因转染组大部分细胞呈现绿色荧光,Ad-BMP-2转染大鼠bmsc后48h时最强,Ad-IGF-I转染大鼠bmsc后72h时最强,Ad-BMP-2-IGF-I转染大鼠bmsc后72h时最强。转染率均高达90%以上。（3）蛋白印迹法检测到转染组细胞中有BMP-2和IGF-I蛋白表达,且随时间延长目的蛋白表达逐渐增强。（4）生长曲线、MTT法及流式细胞仪结果显示第5天各组bmsc增殖能力趋于达到高峰,其中E组增殖能力最强（P＜0.055）。5d光吸收值：A-E组分别为0.324±0.027,0.319±0.017,0.622±0.028,0.626±0.020,0.778±0.031。流式细胞术结果显示A-E组细胞处于增殖期的比重分别为23.92±3.07,23.51±2.11,34.37±6.85,35.04±1.45,42.56±1.15。结论高糖环境下在腺病毒载体介导下BMP-2、IGF-I基因转染bmsc是可行的,经BMP-2、IGF-I基因转染的bmsc能够稳定表达外源性BMP-2和IGF-I。BMP-2和IGF-I均有促进体外培养的bmsc增殖的作用,联合应用促增殖作用最强,两者对bmsc增殖有协同增强效应。

关键词：高糖细胞增殖 bmsc BMP-2 IGF-Ⅰ

基于生物活性玻璃、Collagen-Chitosan支架对bmsc行为影响的研究

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基于生物活性玻璃、Collagen-Chitosan支架对bMSC行为影响的研究

作者：高凯国防科技大学

学位级别：硕士

骨组织工程以构建组织工程骨为重点,以替代并修复骨组织结构和功能为目的,涉及材料科学的选材和合成、工程学的支架设计和构建以及生物医学的在体移植等技术,是针对全球范围内骨科疾病发病率逐年攀升的重要应对手段之一,为世界骨缺损患... 详细信息

骨组织工程以构建组织工程骨为重点,以替代并修复骨组织结构和功能为目的,涉及材料科学的选材和合成、工程学的支架设计和构建以及生物医学的在体移植等技术,是针对全球范围内骨科疾病发病率逐年攀升的重要应对手段之一,为世界骨缺损患者带来了福音。生物活性玻璃（Mesoporous bioactive glass,MBG）以其规整的孔道结构和较高的比表面积和孔容,在骨修复领域展现出良好的骨诱导和骨传导活性。胶原蛋白和壳聚糖都是组织修复工程中常用的天然生物材料,具有良好生物相容性和生物活性。本文首先通过化学合成生物活性玻璃,研究生物活性玻璃控制释放睾酮激素并检测对于前成骨细胞MC3T3-E1增殖、分化以及矿化的影响,探究以生物活性玻璃作为骨修复支架二维材料的可行性,研究结果显示,吸附睾酮的生物活性玻璃显著地促进了MC3T3-E1的增殖、分化以及矿化,并与骨生成标志基因的显著表达结果一致。在此基础上,通过共混壳聚糖和胶原蛋白作为三维支架,以生物活性玻璃为纳米填充颗粒,探究复合修复支架对于骨髓间充质干细胞增殖、骨分化和骨矿化的影响,结果显示,负载有生物活性玻璃的复合支架有利于骨髓间充质干细胞干细胞的骨分化和骨矿化,与细胞内骨形成相关分子的显著表达结果相吻合。本文所得出的研究结果表明,以壳聚糖、胶原蛋白和生物活性玻璃为基础的骨修复复合支架具有很好的骨修复应用前景。

关键词：骨组织工程 MC3T3-E1 MBG bmsc 胶原蛋白壳聚糖

BDNF过表达bmsc修复凋亡脊髓神经细胞的初期实验研究

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BDNF过表达BMSC修复凋亡脊髓神经细胞的初期实验研究

作者：李峥江昆明医科大学

学位级别：硕士

[目的]我们的前期研究发现在伴发颈脊髓空洞脊柱侧凸发生、发展的病理过程中,脊髓神经细胞凋亡扮演了重要角色。本研究拟在原代培养兔脊髓神经细胞的基础上,利用去血清营养剥夺法建立兔脊髓神经细胞凋亡细胞模型,确定此模型中脊髓神经... 详细信息

[目的]我们的前期研究发现在伴发颈脊髓空洞脊柱侧凸发生、发展的病理过程中,脊髓神经细胞凋亡扮演了重要角色。本研究拟在原代培养兔脊髓神经细胞的基础上,利用去血清营养剥夺法建立兔脊髓神经细胞凋亡细胞模型,确定此模型中脊髓神经细胞凋亡的最佳治疗介入时相点;并通过构建脑源性神经营养因子(Brain Derived Neurotrophic Factor,BDNF)过表达的骨髓基质干细胞(bone marrow stromal stem cell,bmsc),与凋亡脊髓神经细胞共培养,从细胞层面研究BDNF过表达bmsc对凋亡脊髓神经细胞的保护作用。[方法]1.原代骨髓基质干细胞的分离、纯化、培养及鉴定:分离、纯化及培养孕19天胎兔骨髓基质干细胞并原代培养及传代;传至第三代时用兔抗CD29、CD34、CD45、CD90抗体后上流式细胞仪鉴定。2.兔脊髓神经细胞的分离、纯化、培养、原代培养及鉴定:分离、纯化、培养孕19天胎兔脊髓,并行原代培养。免疫组化法鉴定培养的兔脊髓神经细胞,进行NSE染色;3.去血清营养剥离法建立脊髓神经细胞体外凋亡模型并鉴定将原代培养的脊髓神经细胞中完全培养基吸去;后用胰酶消化将贴壁脊髓神经细胞细胞重悬浮;加入去血清培养基后以1×105cells/孔的细胞密度铺至六孔板中培养72小时。用Annexin V-PE和7-AAD试剂盒及流式细胞仪于24、48、72小时检测凋亡的发生及凋亡率的变化情况***高表达的bmsc的构建及检测构建能够持续稳定高表达BDNF的bmsc;用RT-PCR、Western Blotting分别检测转染的bmsc中BDNF基因、蛋白表达情况;***高表达的bmsc与凋亡脊髓神经细胞共培养并检测凋亡率变化与细胞增殖情况;BDNF高表达的bmsc与凋亡脊髓神经细胞transwell共培养72小时并用流式细胞仪检测凋亡率变化情况。BDNF高表达的bmsc与凋亡脊髓神经细胞混合培养72小时并用CCK-8试剂盒检测神经细胞增殖情况。6.采用SPSS17.0统计软件进行分析,所有数据均以x±s表示,数据组间差异用独立样本t检验分析,组内差异用单因素方差分析,Pbmsc与凋亡脊髓神经细胞共培养后流式细胞仪检测凋亡率:凋亡对照组:早期凋亡率:6.15%,晚期凋亡率:2.64%,总凋亡率:8.79%;正常神经细胞对照组:早期凋亡率:0.8%,晚期凋亡率:2.41%,总凋亡率:3.21%;BDNF过表达组:早期凋亡率:0.78%,晚期凋亡率:2.05%,总凋亡率:2.83%;BDNF干扰组:早期凋亡率:2.49%,晚期凋亡率:2.22%,总凋亡率:4.71%;正常bmsc组:早期凋亡率:1.45%,晚期凋亡率:2.90%,总凋亡率:4.35%;eGFP-bmsc组:早期凋亡率:1.81%,晚期凋亡率:2.56%,总凋亡率:4.37%;BDNF高表达组较其他对照组凋亡率明显降低。各组间比较结果存在统计学意义(Pbmsc与凋亡脊髓神经细胞transwell共培养后CCK-8试剂盒检测细胞增殖情况(OD值间接反应活细胞总数):凋亡对照组:OD 450:0.512、0.909、1.036;正常神经细胞对照组 OD 450::1.209、0.373、0.765;正常 bmsc组 OD 450::1.244、1.045、1.141;BDNF 干扰组 OD 450:0.821、0.802、0.736;BDNF过表达组OD450:1.902、1.952、1.640;各组间比较结果存在统计学意义(Pbmsc与凋亡脊髓神经细胞混合共培养后CCK-8试剂盒检测细胞增殖情况(OD值间接反应活细胞总数):凋亡对照组:OD 450:0.512、0.909、1.036;正常神经细胞对照组 OD 450::1.209、0.373、0.765;正常 bmsc 组 OD 450::1.61、1.214、1.74;eGFP-bmsc 组 OD450::2.164、

关键词： bmsc BDNF 凋亡脊髓神经细胞共培养

负载适配体的水凝胶募集内源性bmsc加速骨折愈合

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负载适配体的水凝胶募集内源性BMSC加速骨折愈合

作者：龚江山中南大学

学位级别：硕士

目的:骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cell,bmsc)作为成骨细胞的前体细胞,具有出色的多能性,在骨修复中起到主导和起始作用。与传统的体外培养自体或异体bmsc后再体内移植的方法相比,募集自身内源性bmsc用于原位骨组织... 详细信息

目的:骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cell,bmsc)作为成骨细胞的前体细胞,具有出色的多能性,在骨修复中起到主导和起始作用。与传统的体外培养自体或异体bmsc后再体内移植的方法相比,募集自身内源性bmsc用于原位骨组织再生不仅可以有效避免体外复杂细胞操作和移植相关并发症的发生,而且还可以充分利用机体内的自身修复机制,具有更广泛的应用前景。然而,由于骨髓微环境的复杂性,目前特异性地招募内源性bmsc用于原位骨再生仍然具有一定的挑战性。本研究旨在构建负载骨髓间充质干细胞特异性靶向核酸适配体的水凝胶(bmsc-Aptamer gel,bmsc-aptgel),并验证bmsc-aptgel能否长效而稳定地选择性募集局部的内源性bmsc,从而加速骨折的愈合。方法:(1)通过四臂聚乙二醇马来酰亚胺(Polyethylene glycol-4armmaleimide,PEG-4ARM-MAL)与双疏基聚乙二醇(Polyethylene glycol-dithiol,PEG-dithiol)发生迈克尔加成反应生成实验中所用的水凝胶(Hydrogel,Gel);并通过用醛基修饰的骨髓间充质干细胞特异性靶向核酸适配体(bmsc-Aptamer,bmsc-apt)与疏基发生反应将适配体稳定结合在Gel上生成实验所用负载bmsc-apt的水凝胶(bmsc-Aptamer gel,bmsc-aptgel)。(2)采用扫描电子显微镜(Scanning Electronic Microscopy,SEM)和聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)等技术,验证bmsc-aptgel的理化性质;通过细胞迁移(Transwell)实验检测bmsc-aptgel对bmsc的募集效率。(3)通过活死细胞(Calcein-AM/PI)染色验证bmsc-aptgel对bmsc的生物适应性;通过茜素红(Alizarin red S)染色和抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)染色分别检测bmsc-aptgel对原代bmsc成骨分化和单核-巨噬细胞系RAW264.7破骨分化的作用。(4)构建C57BL/6小鼠右侧股骨骨折模型,通过小动物活体成像技术检测bmsc-aptgel对内源性bmsc的募集效率;并进一步通过Nestin染色(bmsc标志物)对骨折区域的bmsc进行定量分析。(5)构建C57BL/6小鼠右侧股骨骨折模型,分别在第3周和第6周进行微计算机断层扫描(Micro Computed Tomography,micro-CT),明确bmsc-aptgel是否能够加速骨折愈合;并进一步通过苏木精-伊红(Hematoxylin and Eosin,H&E)染色和番红固绿(Safranin O-Fast green,SO/FG)染色进行定量统计;在第6周,采用生物力学仪检测骨折小鼠右侧股骨的力学强度。(6)分别通过骨钙素(Osteocalcin,OCN)的免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)染色和TRAP染色检测骨折区域成骨细胞和破骨细胞的数量,并定量统计。(7)通过肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)、白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)和白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)的IHC染色检测骨折区域炎症因子的水平,并定量统计。结果:(1)bmsc-aptgel具有稳定的多孔网络结构,在体外可以有效固定bmsc-apt,并募集bmsc。(2)bmsc-aptgel对bmsc无明显的生物毒性,且在体外能促进原代bmsc的成骨分化和RAW264.7细胞的破骨分化。(3)在股骨骨折模型小鼠体内,原位合成的bmsc-aptgel可以原位募集更多的bmsc到骨折部位。(4)bmsc-aptgel可以在体内有效地增加骨折部位的新骨形成,从而促进小鼠骨折愈合。(5)bmsc-aptgel可以在体内促进骨折区域的成骨细胞数量,而对破骨细胞数量无明显影响。(6)bmsc-aptgel可以在体内显著减轻骨折区域的炎症水平。结论:(1)bmsc-aptgel在体内外可长效地募集bmsc。(2)bmsc-aptgel能够加速小鼠的骨折的愈合。(3)bmsc-aptgel加速骨折局部的骨形成,并通过bmsc的旁分泌作用减少骨折局部炎症反应。

关键词：核酸适配体水凝胶骨折内源性 bmsc 原位再生

氧化应激响应蛋白bmsc对肿瘤细胞铁死亡的调控机制研究

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氧化应激响应蛋白BMSC对肿瘤细胞铁死亡的调控机制研究

作者：曹思源华中科技大学

学位级别：硕士

目的:铁死亡是由脂质过氧化物在细胞膜上的异常累积所引起的一种细胞死亡方式,其发生受到细胞内氧化与还原反应平衡的精细调控。诱导肿瘤细胞铁死亡不仅能克服传统的化疗药物抗性,并且有助于激活宿主的抗肿瘤免疫反应。骨髓基质细胞来... 详细信息

目的:铁死亡是由脂质过氧化物在细胞膜上的异常累积所引起的一种细胞死亡方式,其发生受到细胞内氧化与还原反应平衡的精细调控。诱导肿瘤细胞铁死亡不仅能克服传统的化疗药物抗性,并且有助于激活宿主的抗肿瘤免疫反应。骨髓基质细胞来源的生长抑制因子bmsc是细胞内重要抗氧化分子Nrf2的下游响应基因,其在细胞受到氧化应激时被激活,从而保护细胞免于过氧化物和氧自由基造成的损伤。已有报道表明bmsc参与调控细胞凋亡,但其在铁死亡通路的影响还未见报道。因此,本研究将聚焦于bmsc对肿瘤细胞铁死亡敏感性的调控作用并解析分子机制,同时探究bmsc对抗肿瘤免疫应答的影响。方法:体外研究中,首先通过RNA干扰和CRISPR-Cas9技术构建bmsc敲降或敲除以及bmsc外源性过表达的细胞系,使用细胞活力测定和流式细胞术检测改造目的细胞和对照细胞在铁死亡诱导剂处理后的细胞活力和死亡比例的变化。机制研究中通过荧光定量PCR和免疫蛋白印迹检测当bmsc表达量改变时铁死亡通路相关基因m RNA和蛋白表达的变化。体内实验中将bmsc敲降或敲除的细胞与对照细胞分别注射到C57BL/6小鼠皮下,观察肿瘤生长状况,并在实验终止时检测肿瘤组织中免疫相关细胞的比例和效应性功能。结果:铁死亡诱导剂能够上调细胞内bmsc的表达。在多种小鼠及人的肿瘤细胞中,bmsc的敲降或敲除能够升高细胞内的脂质过氧化水平,并增强细胞对铁死亡的敏感性;而外源性过表达bmsc则会抑制肿瘤细胞的铁死亡。bmsc的敲降或敲除会导致细胞内GPX4 m RNA和蛋白水平的下调。并且其对GPX4的表达调控可能是发生在基因转录水平。过表达GPX4能够部分逆转bmsc敲除细胞对铁死亡的敏感性。在体内,肿瘤细胞中bmsc的敲降或敲除会显著抑制肿瘤在免疫健全小鼠体内的生长,,并促进CD4和CD8T细胞在肿瘤中的浸润和效应性功能。结论:bmsc通过调控GPX4的表达,来增强肿瘤细胞对铁死亡的抗性。敲除bmsc能够显著抑制肿瘤在体内的生长,并增强宿主的抗肿瘤免疫应答。bmsc是一个潜在的抗肿瘤靶点。

关键词： bmsc 铁死亡 GPX4 脂质过氧化物肿瘤免疫 T淋巴细胞浸润

miR-27a通过靶向调控PPARγ对酒精诱导大鼠bmsc分化的影响

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miR-27a通过靶向调控PPARγ对酒精诱导大鼠BMSC分化的影响

作者：宋石郑州大学

学位级别：硕士

研究背景:股骨头坏死是一种临床上非常常见的关节疾病,该病病因复杂,致残率高,一旦发病往往需要手术治疗,迄今罕有有效的预防方法,对患者的生活质量和生命健康都是一种严重威胁。目前非创伤性股骨头缺血性坏死(Osteonecrosis of the fem... 详细信息

研究背景:股骨头坏死是一种临床上非常常见的关节疾病,该病病因复杂,致残率高,一旦发病往往需要手术治疗,迄今罕有有效的预防方法,对患者的生活质量和生命健康都是一种严重威胁。目前非创伤性股骨头缺血性坏死(Osteonecrosis of the femoral head,ONFH)日益多见,大量研究证明,慢性股骨头坏死多与激素和酒精的摄入有关。统计数据显示,在中国,慢性酒精中毒已经是诱发ONFH的主要原因之一。有研究表明,通过对大鼠、小鼠、家兔和鸡等长期使用大剂量酒精灌胃处理后,动物会在一定时间后出现明显的股骨头坏死现象。骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells,bmscs)是一种多能干细胞,主要分化为成骨细胞,并能够分化为脂肪细胞、心肌细胞和神经细胞等。体外培养的bmscs经过酒精诱导后,会大量分化成脂肪样细胞,丧失成骨能力。过氧化物酶体增殖物活化受体γ(peroxisome proliferators-activated receptorγ,PPARγ)基因是一种关键的成脂转录因子,其在脂肪细胞中表达量非常高,且PPARγ的激活与干细胞的分化命运密切相关。大量研究表明,bmsc中PPARγ的激活会导致细胞成骨分化受阻,细胞转而向成脂方向分化,该过程在股骨头坏死过程中表现为骨质丧失和骨骼或关节修复受阻。Micro RNA是一种长度约20～24个核苷酸的短链非编码RNA,不同类型的micro RNA根据其特异的核苷酸序列可以靶向作用于不同基因的m RNA,在m RNA转录后水平调控基因的表达状况。micro RNAs的正常表达对维持正常生命活动至关重要,至今已经发现约60%的人类基因受micro RNAs的调控。一个micro RNA可以靶向调节多个基因,并且一个基因也可以被多个micro RNAs所调控。我们通过生物信息学数据库发现micro RNA-27a能够与PPARγ基因靶向配对,抑制bmsc中PPARγ的表达,阻碍bmsc的成脂分化,进而使bmsc正常的成骨分化能力得以恢复,从而达到对酒精性ONFH发生的抑制作用。研究目的:本实验通过体外合成micro RNA-27a mimics导入大鼠bmscs细胞,观察micro RNA-27a对PPARγ基因的靶向调控作用,及对酒精诱导的bmsc成脂和成骨分化的影响,以此探讨micro RNA在ONFH的发生及防治中的作用。方法:1.实验分组:将大鼠bmscs以1×106/cm2细胞密度,接种于6孔培养板,当细胞融合至80%时应用micro RNA mimics进行电击穿孔法转染,同时随机分组:①空白对照组:正常培养细胞,不做特殊处理。②酒精模型组:培养液中给予0.09 mol/L的酒精。③micro RNA-27a组:micro RNA-27a mimics转染细胞,并给予浓度为0.09mol/L的酒精同时处理。④Negative control组:无关序列合成mimics转染细胞,并给予浓度为0.09mol/L的酒精同时处理。2.荧光素酶报告基因实验检测micro RNA-27a与PPARγ3’UTR的结合情况。3.实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,Q-PCR)检测各组bmscs中PAPRγ和Runx2基因表达的水平。4.酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测各组中碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性、I型胶原(type I collagen)和骨钙素(osteocalcin,OCN)含量的差异。5.免疫印迹法(Western blot)检测各组bmscs中Runx2和PPARγ的蛋白表达水平。6.脂肪染色及脂肪细胞计数检测bmscs酒精诱导后脂肪生成的状态和成脂分化的程度。7.酶偶联比色法检测bmscs中甘油三酯(TG)的含量。结果:1)荧光素酶报告基因实验证实micro RNA-27a可以与PPARγ3’-UTR相结合,即PPARγ是micro RNA-27a的靶基因。2)q PCR结果显示:酒精处理后,酒精模型组和NC组bmsc中PPARγm RNA表达量均高于空白对照组和micro RNA-27a组(Pbmsc中Runx2 m RNA表达量均低于空白对照组和micro RNA-27a组(P<0.01),空白对照组与micro RNA-27a组比较,以及酒精模型组和NC组比较差异均无统计学意义(P﹥0.05)。3)ALP检测结果显示:与空白对照组比较,酒精模型组和

关键词： microRNA-27a bmsc PPARγ Runx2 分化