负载适配体的水凝胶募集内源性BMSC加速骨折愈合

作     者：龚江山 

作者单位：中南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：谢辉;王振兴

授予年度：2023年

学科分类：08[工学] 0805[工学-材料科学与工程（可授工学、理学学位）] 

主      题：核酸适配体 水凝胶 骨折 内源性 BMSC 原位再生 

摘      要：目的:骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)作为成骨细胞的前体细胞,具有出色的多能性,在骨修复中起到主导和起始作用。与传统的体外培养自体或异体BMSC后再体内移植的方法相比,募集自身内源性BMSC用于原位骨组织再生不仅可以有效避免体外复杂细胞操作和移植相关并发症的发生,而且还可以充分利用机体内的自身修复机制,具有更广泛的应用前景。然而,由于骨髓微环境的复杂性,目前特异性地招募内源性BMSC用于原位骨再生仍然具有一定的挑战性。本研究旨在构建负载骨髓间充质干细胞特异性靶向核酸适配体的水凝胶(BMSC-Aptamer gel,BMSC-aptgel),并验证BMSC-aptgel能否长效而稳定地选择性募集局部的内源性BMSC,从而加速骨折的愈合。方法:(1)通过四臂聚乙二醇马来酰亚胺(Polyethylene glycol-4armmaleimide,PEG-4ARM-MAL)与双疏基聚乙二醇(Polyethylene glycol-dithiol,PEG-dithiol)发生迈克尔加成反应生成实验中所用的水凝胶(Hydrogel,Gel);并通过用醛基修饰的骨髓间充质干细胞特异性靶向核酸适配体(BMSC-Aptamer,BMSC-apt)与疏基发生反应将适配体稳定结合在Gel上生成实验所用负载BMSC-apt的水凝胶(BMSC-Aptamer gel,BMSC-aptgel)。(2)采用扫描电子显微镜(Scanning Electronic Microscopy,SEM)和聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)等技术,验证BMSC-aptgel的理化性质;通过细胞迁移(Transwell)实验检测BMSC-aptgel对BMSC的募集效率。(3)通过活死细胞(Calcein-AM/PI)染色验证BMSC-aptgel对BMSC的生物适应性;通过茜素红(Alizarin red S)染色和抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)染色分别检测BMSC-aptgel对原代BMSC成骨分化和单核-巨噬细胞系RAW264.7破骨分化的作用。(4)构建C57BL/6小鼠右侧股骨骨折模型,通过小动物活体成像技术检测BMSC-aptgel对内源性BMSC的募集效率;并进一步通过Nestin染色(BMSC标志物)对骨折区域的BMSC进行定量分析。(5)构建C57BL/6小鼠右侧股骨骨折模型,分别在第3周和第6周进行微计算机断层扫描(Micro Computed Tomography,micro-CT),明确BMSC-aptgel是否能够加速骨折愈合;并进一步通过苏木精-伊红(Hematoxylin and Eosin,H&E)染色和番红固绿(Safranin O-Fast green,SO/FG)染色进行定量统计;在第6周,采用生物力学仪检测骨折小鼠右侧股骨的力学强度。(6)分别通过骨钙素(Osteocalcin,OCN)的免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)染色和TRAP染色检测骨折区域成骨细胞和破骨细胞的数量,并定量统计。(7)通过肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)、白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)和白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)的IHC染色检测骨折区域炎症因子的水平,并定量统计。结果:(1)BMSC-aptgel具有稳定的多孔网络结构,在体外可以有效固定BMSC-apt,并募集BMSC。(2)BMSC-aptgel对BMSC无明显的生物毒性,且在体外能促进原代BMSC的成骨分化和RAW264.7细胞的破骨分化。(3)在股骨骨折模型小鼠体内,原位合成的BMSC-aptgel可以原位募集更多的BMSC到骨折部位。(4)BMSC-aptgel可以在体内有效地增加骨折部位的新骨形成,从而促进小鼠骨折愈合。(5)BMSC-aptgel可以在体内促进骨折区域的成骨细胞数量,而对破骨细胞数量无明显影响。(6)BMSC-aptgel可以在体内显著减轻骨折区域的炎症水平。结论:(1)BMSC-aptgel在体内外可长效地募集BMSC。(2)BMSC-aptgel能够加速小鼠的骨折的愈合。(3)BMSC-aptgel加速骨折局部的骨形成,并通过BMSC的旁分泌作用减少骨折局部炎症反应。