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羊口疮病毒全基因组测序及b2l蛋白应用研究

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羊口疮病毒全基因组测序及B2L蛋白应用研究

作者：李阳内蒙古农业大学

学位级别：硕士

羊口疮(Orf)是一种急性、高度接触性的人兽共患传染病。本试验对ORFV-Q分离株进行全基因组测序并进行NR注释、GO注释、KEGG注释等数据分析;利用b2l基因序列设计一对引物,以提取的ORFV基因组为模板,对目的片段进行扩增,构建重组质粒p ET-... 详细信息

羊口疮(Orf)是一种急性、高度接触性的人兽共患传染病。本试验对ORFV-Q分离株进行全基因组测序并进行NR注释、GO注释、KEGG注释等数据分析;利用b2l基因序列设计一对引物,以提取的ORFV基因组为模板,对目的片段进行扩增,构建重组质粒p ET-30a-b2l;经过诱导表达和纯化,获得b2l蛋白。将b2l蛋白作为包被抗原,建立ORFV抗体间接ElISA方法,确立最佳间接ElISA方法各项试验条件,对32份已知ORFV阴性羊血清进行检测确定临界值;同时将b2l蛋白对bAlb/c小鼠进行免疫,取免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合后筛选出阳性杂交瘤细胞株,制备ORFV单克隆抗体。根据全基因组测序结果显示,ORFV-Q株基因组大小为127 160bp,共预测到123个基因。经SDS-PAGE分析表明,b2l蛋白以包涵体形式表达,纯化后大小约为48 k Da。将纯化b2l蛋白作为抗原以8μg/m l进行包被,一抗血清以1:10稀释,二抗以1:5 000为稀释,底物TMb显色15 min,最终建立并优化检测ORFV抗体间接ElISA方法,当OD≥0.372时,样品为阳性;OD≤0.318时,样品为阴性,确定临界值。将纯化b2l蛋白对小鼠免疫后,从13株阳性杂交瘤细胞中筛选出3株能够稳定分泌抗ORFV阳性杂交瘤细胞株,经鉴定后可与抗原发生特异性结合。本研究通过对ORFV-Q株进行全基因组测序及基因功能注释分析,为后续ORFV基因组功能注释方面的研究提供数据支持;利用表达纯化的b2l蛋白,建立检测ORFV抗体间接ElISA方法并制备单克隆抗体,为后续诊断ORFV检测试剂盒的研究、ORFV相关菌株改造和疫苗生产等方面的研究提供方向。

关键词： ORFV 全基因组测序 b2l蛋白间接ElISA 单克隆抗体

羊口疮病毒和山羊痘病毒的分离鉴定及羊口疮病毒b2l蛋白单克隆抗体的研制

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羊口疮病毒和山羊痘病毒的分离鉴定及羊口疮病毒B2L蛋白单克隆抗...

作者：朱相儒扬州大学

学位级别：硕士

羊口疮病毒(Orf virus, ORFV)可感染山羊、绵羊和其他野生或家养的小反刍兽引起羊接触性传染性脓疱(Contagious ecthyma, CE),又名羊口疮(Orf)。虽然感染在1-2月内可自行康复,但继发感染和生长缓慢同样严重影响养殖业的发展。山羊痘病毒... 详细信息

羊口疮病毒(Orf virus, ORFV)可感染山羊、绵羊和其他野生或家养的小反刍兽引起羊接触性传染性脓疱(Contagious ecthyma, CE),又名羊口疮(Orf)。虽然感染在1-2月内可自行康复,但继发感染和生长缓慢同样严重影响养殖业的发展。山羊痘病毒(Goatpox virus, GTPV)可感染各种年龄、性别、品种的山羊,有报道称也可感染绵羊,引起急性热性接触性山羊痘病,该病最典型的临床症状为皮肤粘膜出现广泛性痘疹,羔羊、泌乳羊及老年羊发病严重,后期多因衰竭死亡,孕羊大多发生流产,严重威胁国内反刍动物的生长繁殖,是OIE规定的必须申报疾病之一,在GTPV流行地区造成巨大的经济损失。羊口疮和羊痘在临床症状上十分相似,血清学诊断又存在交叉反应,同时混合感染也时有发生,一般很难快速鉴别,给疾病的治疗造成很多不必要的麻烦。本实验从江苏地区部分养殖场(户)采集病死羊病料,利用细胞培养从中分离GTPV和ORFV,通过PCR、遗传进化分析等方法对其进行鉴定,克隆表达了ORFV b2l蛋白并制备相应的单克隆抗体。取得了如下结果：1.2013-2015年江苏部分地区ORFV和GTPV的分离鉴定共采集羊病料121份,对其进行细菌分离和病毒分离鉴定。其中ORFV PCR检测阳性有4份,分别将其命名为ORFV/Ovis/XZ/Jiangsu/2015/China、 ORFV1/Ovis/DT/Jiangsu/2015/China、ORFV2/Ovis/DT/Jiangsu/2015/China和ORFV/Ovis/Sl/Jiangsu/2015/China。其中有1份是和GTPV混合感染的,扩增ORFV b2l基因全长并绘制遗传进化树,结果表明,XZ株和DT株核酸同源性分别为100.0%、98.6%、98.6%,与SC-JY、GX-Yb、JS-FX株聚成一簇,核酸同源性分别为99.9%、100.0%、99.2%和98.5%、98.6%、97.8%。Sl株与其他3株核酸同源性分别为98.8%、98.8%、98.5%,与liaoNing、Hub、Gansu株亲缘关系接近,核酸同源性分别为98.8%、98.9%、98.9%。4株分离株与中国疫苗株的核酸同源性为96.8%-98.8%。用胎羊鼻甲骨细胞(OFTu)和MDbK细胞系对其进行分离,成功分离出2株。GTPV PCR检测阳性有2份,将其命名为Goatpox/WX/Jiangsu/2014/China和Goatpox/XZ/Jiangsu/2014/China.2株分离株与EF514890、 EF522177、EF514892、HM572329、JN596275、EF514891株等聚成一簇,同源性接近,其中Goatpox/WX/Jiangsu/2014/China与其核酸同源性分别为98.7%-99.1%,Goatpox/XZ/Jiangsu/2014/China与其核酸同源性分别为99.4%-99.5%,与中国疫苗株的核酸同源性分别为98.6%和99.3%。扩增其P32全长基因绘制遗传进化树,结果表明,与其他地区分离株核苷酸序列同源性分别为97.3%-100%、97.7%-99.6%。用胎羊睾丸细胞(lT)和bHK-21细胞对其进行分离,成功分离出1株。2. ORFV和GTPV多重PCR检测方法的建立选择羊口疮病毒和羊痘病毒各自的保守基因P32和VIR,分别设计特异性引物,建立多重PCR (mPCR)检测方法。该方法特异性和广谱性较好,提取病料DNA的敏感度结果显示,鉴别羊痘、羊口疮病毒的最低检出量分别为0.098 ng/μl和0.46ng/μl,可在同一个PCR反应体系中快速鉴定羊痘、羊口疮病毒感染或是两者混合感染。*** b2l基因的原核表达克隆ORFV的囊膜蛋白b2l基因,并将其插入pET-32a,转化表达菌株bl21。 SDS-PAGE检测结果显示,在37℃、200rpm、0.6M IPTG条件下,融合蛋白b2l-His以可溶性形式大量表达。经His标签蛋白纯化试剂盒(可溶性蛋白)纯化后,重组蛋白浓度为4.183 mg/ml。4.抗b2l蛋白单克隆抗体的制备以纯化的His-b2l融合蛋白免疫六周龄balb/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0进行融合,通过间接ElISA方法筛选出与b2l蛋白反应呈阳性,与His蛋白反应呈阴性的孔进行亚克隆,获得1株能稳定分泌抗b2l蛋白抗体的杂交瘤细胞株,命名为6D5。IFA结果显示,该株单抗与感染ORFV的MDbK细胞反应产生特异性绿色荧光;Western-blot试验结果表明该株单抗与b2l蛋白反应,而与His蛋白不反应。综上所述,ORFV和GTPV在江苏省仍有流行,存在潜在的爆发危险,应加强监测。对ORFV、GTPV的分子流行

关键词： ORFV GTPV b2l蛋白原核表达单克隆抗体

表达羊口疮病毒b2l蛋白重组小反刍兽疫病毒的拯救

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中国动物检疫 2019年第10期36卷 71-77页

作者：刘拂晓孙成友李岭王志亮中国动物卫生与流行病学中心山东青岛266032 青岛农业大学动物医学院山东青岛266109

羊口疮(传染性脓疱)和小反刍兽疫的病原体分别为羊口疮病毒(orf virus,ORFV)和小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)。如果通过反向遗传技术进行基因修饰,PPRV可成为表达外源蛋白的有效载体。ORFV含有1个具有高免疫... 详细信息

羊口疮(传染性脓疱)和小反刍兽疫的病原体分别为羊口疮病毒(orf virus,ORFV)和小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)。如果通过反向遗传技术进行基因修饰,PPRV可成为表达外源蛋白的有效载体。ORFV含有1个具有高免疫原性的b2l蛋白。本研究首先构建了含b2l基因开放阅读框的重组PPRV cDNA clone,然后通过反向遗传技术,拯救了一株表达b2l蛋白的重组PPRV。试验表明,该重组病毒的生长动力学类似其母源病毒;Western blot和质谱分析表明,该重组PPRV可在细胞内表达b2l蛋白。该研究为羊口疮和小反刍兽疫二联疫苗的研制奠定了基础。

关键词：重组小反刍兽疫病毒羊口疮病毒反向遗传 b2l蛋白蛋白表达

羊口疮病毒单抗2E4可变区同源建模及病毒b2l基因体外编辑的研究

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羊口疮病毒单抗2E4可变区同源建模及病毒B2L基因体外编辑的研究

作者：张雪黑龙江八一农垦大学

学位级别：硕士

羊传染性脓疱病(Contagious Ecthyma,CE)俗称羊口疮,是由痘病毒科(Poxviridae)副痘病毒属(Parapoxvirus)的羊口疮病毒(Orf virus,ORFV)引起的一种接触性皮肤传染病,主要感染绵羊和山羊等小反刍动物,有时甚至会感染人类,是全球性广泛分... 详细信息

羊传染性脓疱病(Contagious Ecthyma,CE)俗称羊口疮,是由痘病毒科(Poxviridae)副痘病毒属(Parapoxvirus)的羊口疮病毒(Orf virus,ORFV)引起的一种接触性皮肤传染病,主要感染绵羊和山羊等小反刍动物,有时甚至会感染人类,是全球性广泛分布的病毒性传染病之一。由于羊口疮对于农牧业的潜在威胁以及存在人畜共患风险,因此,ORFV及其致病因子的研究已经成为热点。其中,b2l基因作为不可替代的关键基因,始终被研究者密切关注。该基因位于病毒基因组中央高度保守区域,是病毒一种重要的保护性抗原基因,其编码的病毒粒子囊膜部分蛋白作为主要的抗原可以刺激机体产生强烈的免疫反应,并活化淋巴细胞;同时,b2l对于病毒的装配、扩散和侵染可能十分必要。然而,针对b2l的研究目前仅仅局限于核酸鉴定,并未有深入研究其功能的报道。因此,可以采用新型基因编辑方法加以验证。首先,为了验证ORFV b2l基因被编辑前后的功能,针对b2l N端构象表位的单克隆抗体2E4,在分子水平上验证2E4抗体轻、重链可变区序列中互补决定区(complementarity determining regions,CDRs)与b2l表位的分子结构对应性。通过体外扩增可变区序列和测序,并上传NCbI-Ig blAST获得2E4抗体可变区的CDRs和骨架区(framework regions,FRs)氨基酸结构。继而,采用SWISS-MODEl同源建模方法,展示抗体分子轻、重链可变区的三维空间构型,并模拟了可能的ORFV b2l抗原表位多肽结合部位(Pocket)。通过CDRs区氨基酸突变验证了其与b2l抗原结合的重要性。其二,采用CRISPR/Cas9基因编辑技术对ORFV b2l基因分别在体外和体内进行编辑。通过设计特异的打靶g RNA序列并体外转录成单链m RNA(sg RNA),在Cas9核酸酶作用下对b2l-p ET-32a重组质粒进行切割,从而验证g RNA序列的选取可行性。随后将PMJ920和g RNA1-p GEMT-easy质粒共转染于HEK293细胞,利用病毒蚀斑纯化技术对编辑后病毒变异株进行纯化和扩大培养,通过测序分析b2l基因编辑情况。测序结果显示,筛选出的1株病毒在PAM序列(CGG)5’端第5个碱基处,由原来的胞嘧啶(C)突变为鸟嘌呤(G),但氨基酸依然是丝氨酸(S);另1株病毒变异株(命名为OVlJ-Δb2l)在PAM序列(CGG)5’端第4个碱基开始连续缺失4个碱基序列,导致后面的氨基酸序列移码并提前有终止子出现。通过间接免疫荧光证实病毒变异株OVlJ-Δb2l不能与2E4单抗结合。将OVlJ-Δb2l变异株接种动物羊后,其致病力减弱。本研究采用同源建模方法,展示抗体分子轻、重链可变区的CDRs,并模拟了可能的b2l表位多肽结合部位,采用点突变法证明了表位与CDRs结合的特异性。采用CRISPR/Cas9技术对ORFV b2l基因进行编辑,并筛选出缺失b2l基因的病毒变异株OVlJ-Δb2l,为今后b2l基因的应用和研究ORFV其它的功能性基因奠定了基础。

关键词：羊口疮病毒 b2l蛋白单克隆抗体互补决定区同源建模基因编辑

羊口疮病毒b2l和F1l基因的表达及其多克隆抗体的制备

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羊口疮病毒B2L和F1L基因的表达及其多克隆抗体的制备

作者：李国华海南大学

学位级别：硕士

羊口疮又称羊传染性脓疱性皮炎,由羊口疮病毒(Orf virus,ORFV)引起,ORFV属于痘病毒科副痘病毒属,主要侵袭皮肤和黏膜。ORFV主要感染绵羊和山羊等动物,严重影响养羊业的发展,对人类健康也造成威胁。可以通过接种疫苗来控制羊口疮的发生,... 详细信息

羊口疮又称羊传染性脓疱性皮炎,由羊口疮病毒(Orf virus,ORFV)引起,ORFV属于痘病毒科副痘病毒属,主要侵袭皮肤和黏膜。ORFV主要感染绵羊和山羊等动物,严重影响养羊业的发展,对人类健康也造成威胁。可以通过接种疫苗来控制羊口疮的发生,但存在灭活苗效果差,弱毒苗毒力返强等问题,而且不同地区的羊口疮毒株存在差异,不能很好的保护羊群。因此,对本地区的ORFV开展研究具有重要意义。1.采集海南某场羊口疮水泡痂皮,克隆ORFV的b2l、VIR和F1l基因,进行遗传进化树分析。结果表明,发现其与福建株和西北株的亲缘关系较近。2.以ORFV基因组为模板,通过PCR技术扩增b2l和F1l片段,构建原核表达质粒 pET28a-b2l 和 pET28a-F1l,通过 Ni-NTA 柱纯化 His-b2l 和 His-F1l 融合蛋白,进行SDS-PAGE和Western blot检测。结果表明,成功构建重组质粒pET28a-b2l和pET28a-F1l,经IPTG诱导成功表达了带His标签的融合蛋白,融合蛋白His-b2l分子量约47 kDa,融合蛋白His-F1l分子量约44 kDa。3.通过PCR技术扩增b2l和F1l片段,构建真核表达质粒pEGFP-N1-b2l和pEGFP-N1-F1l,转染羊睾丸细胞,进行荧光显微镜观察,qRT-PCR检测和Western blot鉴定。结果表明,成功构建了真核表达质粒pEGFP-N1-b2l和pEGFP-N1-F1l,成功表达了 EGFP-b2l和EGFP-F1l融合蛋白,为b2l和F1l蛋白的研究奠定基础。4.用纯化的融合蛋白制备抗原,经皮下多点注射新西兰大白兔,制备兔抗His-b2l和His-F1l多克隆抗体,用ElISA方法检测多克隆抗体效价。结果表明,获得的兔抗多克隆抗体效价均在1:12800以上且具有较好的特异性。

关键词：羊口疮病毒 b2l蛋白 F1l蛋白原核表达纯化多克隆抗体真核表达

羊口疮抗体间接ElISA方法的建立及血清学调查

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羊口疮抗体间接ELISA方法的建立及血清学调查

作者：王斌湖南农业大学

学位级别：硕士

近年来随着大规模、集约化养羊业的兴起,对羊口疮的报道也越来越多。羊口疮不仅引起发病羊采食、咀嚼、吞咽困难致使其消瘦。同时,作为一种人畜共患传染病,常引起人的手指感染而发生溃疡,因此,对羊口疮的诊断及防控越来越引起人们的重... 详细信息

近年来随着大规模、集约化养羊业的兴起,对羊口疮的报道也越来越多。羊口疮不仅引起发病羊采食、咀嚼、吞咽困难致使其消瘦。同时,作为一种人畜共患传染病,常引起人的手指感染而发生溃疡,因此,对羊口疮的诊断及防控越来越引起人们的重视。在多种实验室诊断方法中,间接ElISA方法具有检出率高、操作简单、省时、经济,而且单次检测样本量大等优点。因而建立羊口疮病毒(orf virus,ORFV)b2l蛋白抗体的间接ElISA方法,对羊口疮的免疫、防控以及血清学调查具有重要的意义。本研究采集湖南省10个疑似羊口疮羊场的病料共24份,以提取的DNA为模板进行PCR扩增运用琼脂糖凝胶电泳鉴定。将阳性样品测序,得到10株b2l基因序列。从Genbank下载已上传的b2l基因序列43株,运用MEGA6.0中的Neighbor-Joining算法对获得的序列绘制遗传进化发育树。首次,确定湖南地区流行的毒株属于Ⅰ型ORFV。另外,在我国主要流行的ORFV毒株是Ⅰ型和Ⅱ型。本研究根据NCbI公布的ORFV全基因序列,设计一对扩增b2l全长基因的引物。将b2l基因克隆至pET-28a(+)表达载体上,然后转入bl21(DE3)中进行诱导表达,将表达后的蛋白裂解后离心,取离心后的上清用Ni亲和层析柱纯化,并用bCA法测定纯化后重组蛋白的浓度,最终用终浓度为50%的甘油保存重组蛋白。包被重组蛋白b2l,筛选出间接ElISA方法建立的最佳条件。结果表明,b2l重组蛋白最佳包被浓度为25ng/孔,最佳血清稀释倍数为100倍,最适酶标二抗稀释倍数为20000倍,血清和酶标二抗在37℃温箱孵育的最佳时间均为30min,底物在37℃温箱反应15min后加终止液用OD读数,阳性临界值为0.327。试验结果表明,批内和批间重复性实验被检血清的变异系数均低于15%,ElISA板在4℃放置9个月后弱阳性的血清仍为阳性,强阳性血清稀释12800倍之后,结果仍为阳性。运用本研究所建立的间接ElISA方法,跟踪检测攻毒羊的抗体,1号羊在攻毒第2天后产生抗体,第21天抗体达到峰值,3号羊在攻毒第7天后产生抗体,第28天抗体达到峰值,而2号羊在攻毒第14天后开始产生抗体,第35天抗体达到峰值。运用本研究所建立的间接ElISA方法,对湖南省流行的羊口疮进行调查。收集湖南省13个市部分羊场的血清为834份。检测结果表明,羊口疮在湖南省流行范围较广,同时,各地区ORFV感染率也较高。

关键词：羊口疮 b2l蛋白间接ElISA方法血清学调查