羊口疮抗体间接ELISA方法的建立及血清学调查

作     者：王斌 

作者单位：湖南农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：余兴龙

授予年度：2017年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：羊口疮 B2L蛋白 间接ELISA方法 血清学调查 

摘      要：近年来随着大规模、集约化养羊业的兴起,对羊口疮的报道也越来越多。羊口疮不仅引起发病羊采食、咀嚼、吞咽困难致使其消瘦。同时,作为一种人畜共患传染病,常引起人的手指感染而发生溃疡,因此,对羊口疮的诊断及防控越来越引起人们的重视。在多种实验室诊断方法中,间接ELISA方法具有检出率高、操作简单、省时、经济,而且单次检测样本量大等优点。因而建立羊口疮病毒(orf virus,ORFV)B2L蛋白抗体的间接ELISA方法,对羊口疮的免疫、防控以及血清学调查具有重要的意义。本研究采集湖南省10个疑似羊口疮羊场的病料共24份,以提取的DNA为模板进行PCR扩增运用琼脂糖凝胶电泳鉴定。将阳性样品测序,得到10株B2L基因序列。从GenBank下载已上传的B2L基因序列43株,运用MEGA6.0中的Neighbor-Joining算法对获得的序列绘制遗传进化发育树。首次,确定湖南地区流行的毒株属于Ⅰ型ORFV。另外,在我国主要流行的ORFV毒株是Ⅰ型和Ⅱ型。本研究根据NCBI公布的ORFV全基因序列,设计一对扩增B2L全长基因的引物。将B2L基因克隆至pET-28a(+)表达载体上,然后转入BL21(DE3)中进行诱导表达,将表达后的蛋白裂解后离心,取离心后的上清用Ni亲和层析柱纯化,并用BCA法测定纯化后重组蛋白的浓度,最终用终浓度为50%的甘油保存重组蛋白。包被重组蛋白B2L,筛选出间接ELISA方法建立的最佳条件。结果表明,B2L重组蛋白最佳包被浓度为25ng/孔,最佳血清稀释倍数为100倍,最适酶标二抗稀释倍数为20000倍,血清和酶标二抗在37℃温箱孵育的最佳时间均为30min,底物在37℃温箱反应15min后加终止液用OD读数,阳性临界值为0.327。试验结果表明,批内和批间重复性实验被检血清的变异系数均低于15%,ELISA板在4℃放置9个月后弱阳性的血清仍为阳性,强阳性血清稀释12800倍之后,结果仍为阳性。运用本研究所建立的间接ELISA方法,跟踪检测攻毒羊的抗体,1号羊在攻毒第2天后产生抗体,第21天抗体达到峰值,3号羊在攻毒第7天后产生抗体,第28天抗体达到峰值,而2号羊在攻毒第14天后开始产生抗体,第35天抗体达到峰值。运用本研究所建立的间接ELISA方法,对湖南省流行的羊口疮进行调查。收集湖南省13个市部分羊场的血清为834份。检测结果表明,羊口疮在湖南省流行范围较广,同时,各地区ORFV感染率也较高。