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Long non-coding RNA MEG3 regulates autophagy after cerebral ischemia/reperfusion injury

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Neural Regeneration Research 2022年第4期17卷 824-831页

作者： Tian-Hao Li Hong-Wei Sun Lai-Jun Song Bo Yang Peng Zhang Dong-Ming Yan Xian-Zhi Liu Yu-Ru Luo Department of Neurosurgery The First Affiliated Hospital of Zhengzhou UniversityZhengzhouHenan ProvinceChina

Severe cerebral ischemia/reperfusion injury has been shown to induce high-level autophagy and neuronal death.Therefore,it is extremely important to search for a target that inhibits autophagy activation.Long non-coding RNA MEG3 participates in autophagy.However,it remains unclear whether it can be targeted to regulate cerebral ischemia/reperfusion injury.Our results revealed that in oxygen and glucose deprivation/reoxygenation-treated HT22 cells,MEG3 expression was obviously upregulated,and autophagy was increased,while knockdown of MEG3 expression greatly reduced autophagy.Furthermore,MEG3 bound mi R-181 c-5 p and inhibited its expression,while mi R-181 c-5 p bound to autophagy-related gene atg7 and inhibited its expression.Further experiments revealed that mir-181 c-5 p overexpression reversed the effect of MEG3 on autophagy and atg7 expression in HT22 cells subjected to oxygen and glucose deprivation/reoxygenation.In vivo experiments revealed that MEG3 knockdown suppressed autophagy,infarct volume and behavioral deficits in cerebral ischemia/reperfusion mice.These findings suggest that MEG3 knockdown inhibited autophagy and alleviated cerebral ischemia/reperfusion injury through the mi R-181 c-5 p/atg7 signaling pathway.Therefore,MEG3 can be considered as an intervention target for the treatment of cerebral ischemia/reperfusion injury.This study was approved by the Animal Ethics Committee of the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University,China(approval No.XF20190538)on January 4,2019.

关键词： atg7 autophagy cerebral infarction cerebral ischemia/reperfusion injury long non-coding RNA miR-181c-5p neuron oxygen and glucose deprivation/reoxygenation

atg7 and beclin1 are essential for energy metabolism and survival during the larval-to-juvenile transition stage of zebrafish

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Aquaculture and Fisheries 2022年第4期7卷 359-372页

作者： Suzan Attia Mawed Jin Zhang Fan Ren Yan He Jie Mei College of Fisheries Huazhong Agricultural UniversityWuhan430070China Zoology Department Faculty of ScienceZagazig UniversityZagazig44519Egypt

The high mortality in larval-to-juvenile transition is a big problem in aquaculture which is related to the shifting from endogenous to exogenous feeding.However,the underlying causes remain poorly understood.Autophagy,an evolutionary regulated cellular mechanism,is highly conserved in eukaryotic organisms to maintain energy homeostasis against stress including starvation.To investigate whether autophagy plays a role during larval-to-juvenile transition,we generated atg7 and beclin1 zebrafish mutant lines using CRISPR/Cas9 gene editing technology.In this study,both atg7 and beclin1 null zebrafish died during larval-to-juvenile transition because atg7 and beclin1 mutants were unable to cope with the metabolic stress after yolk absorption and fail to activate autophagy in response to nutrient restriction.Meanwhile,dramatic defects in the intestine architecture and metabolic functions in the liver of these mutants were observed even though refeeding them.Treatment with rapamycin,an activator of autophagy,could effectively extend the survival time of both atg7 and beclin1 null zebrafish through decreasing the metabolic rate while it couldn’t activate autophagy in mutants via the canonical pathway.Thus,our results revealed that autophagy played a crucial role in zebrafish ontogeny during larval-to-juvenile transition,and it could be considered as one of the most important endogenous factors judging the survival rate of the developing embryos during this period.

关键词： Autophagy Larval-to-juvenile transition atg7 beclin1 Metabolism Rapamycin

atg7 in development and disease： panacea or Pandora＇s Box？

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Protein & Cell 2015年第10期6卷 722-734页

作者： Jianhua Xiong Center for Molecular Medicine National Heart Lung and Blood Institute National Institutes of Health Bethesda MD 20892USA

Macroautophagy is an evolutionarily conserved intracellular degradation system used by life ranging from yeasts to mammals. The core autophagic machinery is composed of atg （autophagy-related） protein constituents. One particular member of the atg protein family, atg7, has been the focus of recent research. atg7 acts as an Ellike activating enzyme facilitating both microtubule-associated protein light chain 3 （LC3）- phosphatidylethanolamine and atg12 conjugation. Thus, atg7 stands at the hub of these two ubiquitin-like systems involving LC3 and atg12 in autophagic vesicle expansion. In this review, I focus on the pleiotropic function of atg7 in development, maintenance of health, and alternations of such control in disease.

关键词： autophagy atg7 mouse model,development disease

基于miR-17-5p/atg7介导自噬探讨苍附导痰汤对痰湿型多囊卵巢综合征不孕症的影响

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中华中医药杂志 2023年第10期38卷 5075-5080页

作者：于晓娜连方相珊于艺山东中医药大学济南250014 山东中医药大学附属医院中西医结合生殖与遗传中心济南250014

目的:基于miR-17-5p/atg7介导自噬探讨苍附导痰汤对痰湿型多囊卵巢综合征(PCOS)不孕症患者的影响。方法:选取符合痰湿型PCOS诊断标准的不孕患者76例,随机分为试验组(苍附导痰汤+IVF)、观察组(安慰剂+IVF),各38例。另选取因男方因素行辅... 详细信息

目的:基于miR-17-5p/atg7介导自噬探讨苍附导痰汤对痰湿型多囊卵巢综合征(PCOS)不孕症患者的影响。方法:选取符合痰湿型PCOS诊断标准的不孕患者76例,随机分为试验组(苍附导痰汤+IVF)、观察组(安慰剂+IVF),各38例。另选取因男方因素行辅助生殖的患者38例为对照组(IVF)。3组患者皆采用拮抗剂方案进行控制性卵巢刺激,统计分析试验组和观察组患者治疗前后中医痰湿证候积分、体质量指数(BMI)变化,比较3组患者促性腺激素(Gn)使用天数、Gn用量、性激素水平、获卵数、2PN受精率、优质胚胎率等临床指标,采用qRT-PCR检测颗粒细胞中miR-17-5p及atg7 mRNA表达水平,Western Blot检测atg7蛋白水平。结果:试验组治疗后痰湿证候积分、BMI显著降低(P7-5p相对表达量试验组和观察组均显著低于对照组(Patg7 mRNA相对表达量试验组和观察组显著高于对照组(Patg7蛋白表达水平观察组显著高于试验组和对照组(P7-5p/atg7表达存在差异,低表达的miR-17-5p可能通过上调atg7的表达使颗粒细胞过度自噬,从而参与痰湿型PCOS的发生;苍附导痰汤可使miR-17-5p表达上调,atg7表达下调,显著改善痰湿型PCOS不孕患者的临床症状,提高2PN受精率和优质胚胎率。

关键词：多囊卵巢综合征苍附导痰汤 miR-17-5p atg7 自噬

基于miR-17-5p/atg7介导自噬探讨苍附导痰丸方对痰湿型多囊卵巢综合征的作用机制

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基于miR-17-5p/ATG7介导自噬探讨苍附导痰丸方对痰湿型多囊卵巢综...

作者：于晓娜山东中医药大学

学位级别：硕士

目的自噬异常激活被认为是多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome,PCOS)发病的一个重要机制,本课题组早期研究发现自噬相关基因atg7在痰湿型PCOS患者颗粒细胞(granulosa cells,GCs)中表达增加。本研究基于自噬探讨PCOS发病的机制... 详细信息

目的自噬异常激活被认为是多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome,PCOS)发病的一个重要机制,本课题组早期研究发现自噬相关基因atg7在痰湿型PCOS患者颗粒细胞(granulosa cells,GCs)中表达增加。本研究基于自噬探讨PCOS发病的机制,揭示自噬与PCOS临床表型的相关性。应用苍附导痰丸方干预,探讨中药治疗PCOS的疗效及可能的微观机制。方法第一部分:根据生物信息学软件预测结果,通过双荧光素酶实验验证自噬相关基因atg7的相关联micro RNA。第二部分:选取符合痰湿型PCOS诊断标准的患者76例,按照随机数字表法分为实验组(苍附导痰丸方+IVF/ICSI)38例、观察组(安慰剂+IVF/ICSI)38例。另选取因男方因素行辅助生殖的患者38例为对照组(IVF/ICSI)。以期观测辅助中药治疗后临床症状的改善程度及检测指标的变化。三组患者皆采用拮抗剂方案进行控制性卵巢刺激,统计分析实验组和观察组患者治疗前后中医痰湿证候积分、体重指数(Body Mass Index,BMI)变化,比较三组患者促性腺激素(gonadotropin,Gn)使用天数、Gn用量、扳机日雌二醇(estradiol,E)、孕酮(progesterone,P)、促黄体生成素(luteinizing hormone,LH)水平、获卵数、2PN受精率、优质胚胎率等临床指标,采用q PCR和Western Blot检测颗粒细胞中自噬相关基因atg7及相关联micro RNA的表达水平。结果第一部分:miR-17-5p是atg7相关联的micro RNA,miR-17-5p与靶基因atg7的3’UTR能结合,并抑制其表达。第二部分:1.中医痰湿证候评分:实验组治疗后痰湿证候积分低于治疗前(P0.05),但实验组Gn用量有降低趋势。4.HCG日E、P、LH水平:三组患者HCG日E水平实验组高于观察组和对照组(P0.05)。5.获卵数:三组患者获卵数对照组低于实验组和观察组(P0.05),但实验组获卵数有升高趋势。6.2PN受精率、优质胚胎率:三组患者2PN受精率无明显差异(P>0.05),但实验组较观察组有升高趋势;优质胚胎率实验组和对照组高于观察组(P7.三组患者miR-17-5p、atg7表达水平比较:miR-17-5p相对表达量实验组和观察组均明显低于对照组(Patg7 m RNA相对表达量实验组和观察组高于对照组(Patg7 m RNA相对表达量有降低趋势。atg7蛋白表达水平观察组高于实验组和对照组(P7-5p可能通过上调atg7的表达使颗粒细胞过度自噬,从而参与PCOS的发生;2.苍附导痰丸方可显著改善痰湿型PCOS患者的临床症状,提高2PN受精率和优质胚胎率,可使miR-17-5p表达上调,atg7表达下调;3.苍附导痰丸方对PCOS患者卵子及胚胎质量的提高可能与苍附导痰丸方通过上调miR-17-5p表达使atg7表达受抑制,从而减弱PCOS患者颗粒细胞的过度自噬有关。

关键词：多囊卵巢综合征苍附导痰丸方 miR-17-5p atg7 颗粒细胞自噬

MicroRNA-129-5p通过抑制心肌细胞自噬改善心力衰竭大鼠心功能的作用机制研究

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中国现代医学杂志 2023年第6期33卷 30-36页

作者：谭莉吴健熊迪张慧易瑞兰株洲市中心医院全科医学科湖南株洲412000

目的探讨miR-129-5p通过抑制心肌细胞自噬改善心力衰竭(HF)大鼠心功能的作用机制。方法将40只健康雄性Wistar大鼠作为研究对象,并分为空白对照组、模型组、空载病毒组和miR-129-5p组,每组10只。模型组腹腔注射阿霉素溶液复制慢性HF模型... 详细信息

目的探讨miR-129-5p通过抑制心肌细胞自噬改善心力衰竭(HF)大鼠心功能的作用机制。方法将40只健康雄性Wistar大鼠作为研究对象,并分为空白对照组、模型组、空载病毒组和miR-129-5p组,每组10只。模型组腹腔注射阿霉素溶液复制慢性HF模型;空白对照组腹腔注射等量0.9%生理盐水;空载病毒组、miR-129-5p组分别通过尾静脉注射空载体病毒、miR-129-5p载体复制HF模型。各组大鼠连续给药6周后,采用心脏彩色多普勒超声仪检测大鼠左室射血分数(LVEF)、左室舒张末期内径(LVEDd)和左室收缩末期内径(LVEDs)。实时荧光定量聚合酶链反应检测大鼠心肌组织miR-129-5p表达,HE染色观察心肌组织病理形态,Western blotting检测心肌细胞自噬相关蛋白表达。结果模型组、空载病毒组EF较空白对照组降低(P0.05);miR-129-5p组EF较模型组升高(Patg7蛋白相对表达量较空白对照组升高(Patg7的抑制,上调miR-129-5p可能通过抑制心肌细胞过度自噬,从而改善大鼠心功能。

关键词：心力衰竭 miR-129-5p atg7 自噬心肌细胞

有氧运动加速细胞自噬atg7基因缺陷小鼠肌肉萎缩

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有氧运动加速细胞自噬Atg7基因缺陷小鼠肌肉萎缩

作者：黄杰轮武汉体育学院

学位级别：硕士

研究目的:骨骼肌作为人体最丰富的组织,除自主运动外,在维持机体健康中承担着重要作用。然而,创伤、衰老、疾病或长时间卧床休息以及代谢紊乱等,通常会导致肌肉快速萎缩。与此同时,肌肉质量下降诱发多病,身体功能减弱,并对生活质量产生... 详细信息

研究目的:骨骼肌作为人体最丰富的组织,除自主运动外,在维持机体健康中承担着重要作用。然而,创伤、衰老、疾病或长时间卧床休息以及代谢紊乱等,通常会导致肌肉快速萎缩。与此同时,肌肉质量下降诱发多病,身体功能减弱,并对生活质量产生实质性的负面影响。近来研究发现,骨骼肌萎缩通常伴随细胞自噬功能紊乱与细胞凋亡增加,细胞自噬和细胞凋亡两者之间受到严格调控,在维持肌肉质量方面扮演着重要作用。其中,有氧运动作为一项便捷、经济和易于接受的有效干预手段可改善骨骼肌萎缩的发生和发展,其调控肌肉质量的主要机制还未被全完阐释清楚。为此,我们选择骨骼肌细胞自噬关键基因(atg7)特异性敲除小鼠,进行为期12周的有氧运动干预,从而论证在细胞自噬基因缺陷条件下有氧运动对骨骼肌质量维持的作用与机制,以期运动预防或减缓骨骼肌萎缩方面提供靶向干预策略。研究方法:实验采用Cre-loxP基因敲除技术构建atg7骨骼肌特异性敲除小鼠模型,选择4月龄atg7纯合对照组小鼠(atg7)和atg7骨骼肌特异性敲除小鼠(atg7)各16只,随机分为两组:安静组(atg7-NE、atg7-NE)与有氧运动组(atg7-AE、atg7-AE)。有氧运动组小鼠采用跑台运动:速度:14 m/min,每次训练50 min,跑台坡度为10°;每周5次。干预周期为期12周;干预结束后,休息24 h,进行体重称量、肌肉功能和运动能力测试后再处死,收集左右后肢腓肠肌用于计算腓肠肌/体重(Gastrocnemius muscle weight/body weight,GMW/BW)比值以间接评估骨骼肌萎缩;其余部分采用HE、TUNEL与SDH染色来观察骨骼肌组织病理学改变;采用PCR技术鉴定基因和Western blot检测泛素-蛋白酶体系统、细胞自噬、细胞凋亡、以及线粒体生物发生等相关蛋白的表达。研究结果:1.有氧运动加剧骨骼肌atg7特异性敲除小鼠腓肠肌萎缩:与atg7-NE组相比,atg7-AE组小鼠GMW/BW比值显著增加(patg7-NE组相比,atg7-NE组小鼠GMW/BW比值则明显下降;其中,与atg7-NE组相比,atg7-AE组小鼠GMW/BW比值呈现出显著下降(patg7-NE相比,atg7-NE的GMW/BW比值显著降低(patg7-AE相比,atg7-AE的GMW/BW比值也表现出显著降低(patg7特异性敲除小鼠抓力与翻转能力:与atg7-NE组相比,atg7-AE组小鼠翻转能力呈现上升趋势,但无显著性差异;与atg7-NE组相比,atg7-NE组小鼠翻转能力无显著性差异,重量测试结果显著下降(patg7-NE组相比,atg7-NE组小鼠两种实验测试结果显著降低(patg7-NE组相比,atg7-AE组小鼠测试结果显著下降(patg7特异性敲除小鼠运动能力:与atg7-NE相比,atg7-AE组小鼠有氧力竭时间呈现显著差异(patg7-NE组相比,atg7-NE组力竭时间无显著性差异但呈下降趋势;与atg7-AE组相比,atg7-AE组小鼠有氧力竭时间呈现显著差异(patg7-NE组相比,atg7-AE组小鼠力竭时间无显著差异但呈现下降趋势。3.组织病理学改变:3.1 HE染色结果:与atg7-NE组相比,atg7-AE组小鼠腓肠肌纤维横截面的明显增加(patg7-NE组相比,atg7-NE组小鼠腓肠肌纤维横截面积显著减少(patg7-AE组相比,atg7-AE组小鼠骨骼肌横截面积降低更为显著(patg7-NE组相比,atg7-AE组小鼠腓肠肌横截面积显著性减少(patg7-NE组相比,atg7-AE组小鼠腓肠肌SDH活性显著增加(patg7-NE组相比,atg7-NE组小鼠SDH活性显著降低(patg7-AE组相比,atg7-AE组小鼠,SDH活性下降显著(patg7-NE相比,atg7-AE组小鼠SDH活性呈现下降趋势。4.TUNEL染色结果:与atg7-NE组相比,atg7-AE组小鼠腓肠肌细胞凋亡呈下降趋势;atg7-AE与atg7-NE两组腓肠肌肌纤维细胞凋亡水平显著上升(patg7-NE组相比,atg7-NE组小鼠细胞凋亡显著增多(patg7-AE组相比,atg7-AE组小鼠细胞凋亡显著增多(patg7-NE组相比,atg7-AE组小鼠骨骼肌凋亡水平显著增加(p<0.05)。5.Wester

关键词：骨骼肌萎缩细胞自噬细胞凋亡 atg7 线粒体生物发生运动能力

CHIP、atg7、NAC38和生长素IAA对拟南芥fes1a和hot1突变体耐热性的影响

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CHIP、ATG7、NAC38和生长素IAA对拟南芥fes1a和hot1突变体耐热性...

作者：郑立娜山东师范大学

学位级别：硕士

FES1A作为拟南芥HSP70的核苷酸交换因子(NEF),促进HSP70-ADP复合物中的ADP释放,同时将HSP70折叠蛋白底物从HSP70复合物中释放。缺失FES1A会导致拟南芥呈现严重的耐热性缺陷。本实验室前期研究发现突变BRFs、BAG6、atg7或atg2以及施加外... 详细信息

FES1A作为拟南芥HSP70的核苷酸交换因子(NEF),促进HSP70-ADP复合物中的ADP释放,同时将HSP70折叠蛋白底物从HSP70复合物中释放。缺失FES1A会导致拟南芥呈现严重的耐热性缺陷。本实验室前期研究发现突变BRFs、BAG6、atg7或atg2以及施加外源IAA,均能够有效修复fes1a的热敏感缺陷。在本实验中,作者进一步研究了CHIP对热敏感突变体fes1a和hot1耐热性的影响,探讨了CHIP突变修复热敏感突变体的分子机制。此外,本实验还研究了IAA相关合成途径以及NAC38转录因子对fes1a耐热性的影响。主要研究内容如下:1)突变CHIP部分修复了热敏感突变体fes1a和hot1的获得耐热性缺陷。chip单突变体虽然不呈现热敏感缺陷,但在fes1a或hot1的遗传背景下,再次突变CHIP可以修复fes1a或hot1的热敏感缺陷。Western-blotting结果显示hot1 chip与hot1或fes1a chip与fes1a在热适应期和高温后恢复期的热激蛋白水平并没有差别,但是双突变体的蛋白泛素化强度显著低于单突变体hot1或fes1a。作者培育了fes1a atg7 chip三突变体,结果发现,虽然再次双突变CHIP和atg7可以修复fes1a的热敏感缺陷,但修复效果反而不及单突变CHIP对fes1a的热敏感缺陷修复效果。另外我们发现atg7 chip双突变的基础耐热性明显高于WT。2)外源施加IAA可以抑制突变体fes1a的热敏感缺陷。前期数据表明阻断atg7或atg2相关的自噬系统,可以修复fes1a的耐热性缺陷。转录组数据表明,与fes1a相比,fes1a atg7双突变体中两个IAA合成关键基因(AAO1和NIT2)的转录水平显著上调,且fes1a atg7双突变体中的IAA显著高于fes1a。本实验发现aao1 nit2突变体并未呈现出热敏感表型,但在fes1a atg7的基础上同时突变AAO1和NIT2,培育出fes1a atg7 aao1 nit2四突变体的耐热性显著低于fes1a atg7,说明IAA合成途径与atg7突变可以修复fes1a耐热性缺陷有关,为IAA可以修复fes1a耐热性缺陷提供了分子遗传证据。此外,我们对生长素报告系统DR5-GUS稳定转化的拟南芥幼苗进行GUS组织化学染色,发现正常条件下atg7的着色程度略强于WT,而在外源施加L-Trp或IBA的条件下,atg7着色程度增强,高于WT,有趣的是,外施IBA,导致atg7着色很深,说明IBA转化为IAA相关的酶在atg7突变体中活性很高。组织化学实验证据再次说明,atg7的突变提高了IAA合成途径相关酶的活性,atg7是IAA合成的抑制因子。3)本实验室在研究阻断自噬降解途径修复fes1a热敏感缺陷的机理时,发现fes1a atg7和fes1a atg2中NAC38(AT2G24430)转录因子表达显著上调。复杂的NAC家族转录因子具有多种生物学功能,在植物生长和发育、对非生物和生物胁迫的响应、植物二次生长和植物激素信号转导中发挥着重要作用。本实验在拟南芥中过表达AtNAC38,观察到与WT和fes1a植株相比,AtNAC38基因超表达株系表现出植株发育矮小,出现少量异常花粉,以及果荚出现了种子空缺现象。说明拟南芥NAC38在植物生长发育可能发挥负调节作用,并在种子发育的调控中发挥重要作用。另外,作者在fes1a的遗传背景下过表达AtNAC38,发现过表达AtNAC38没有影响fes1a的获得耐热性,说明AtNAC38在atg7突变修复fes1a耐热性缺陷中不起作用。本课题的主要创新点:1、发现在fes1a或hot1的遗传背景下,再次突变CHIP,降低了泛素化程度,这可能与突变CHIP修复fes1a和hot1的热敏感缺陷有关。2、发现atg7突变体导致Trp和IBA转化为IAA途径相关的酶活性提高,其中IBA转化为IAA相关酶活性提高更显著。突变IAA合成途径中的AAO1和NIT2导致fes1a atg7双突变体的耐热性下降。从酶活性和遗传学角度再次证明,atg7突变提高了IAA水平,进而一定程度上修复fes1a耐热性缺陷。3、在拟南芥中过表达AtNAC38负调节植物生长发育,并且AtNAC38调控种子发育,但对atg7突变修复fes1a耐热性缺陷不起作用。

关键词： CHIP FES1A atg7 热敏感性泛素化 IAA IBA AtNAC38

组蛋白转录因子Spt21的表达调控机制研究

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组蛋白转录因子Spt21的表达调控机制研究

作者：徐晨湖北大学

学位级别：硕士

在真核生物中,染色体是由一连串的核小体压缩组装形成。核小体是由147 bp的DNA缠绕组蛋白八聚体形成。核心组蛋白可以分为四种,包括组蛋白H3、H4、H2A和H2B。核心组蛋白的表达严格地受细胞周期调控。细胞周期包括G1、S、G2和M四个不同... 详细信息

在真核生物中,染色体是由一连串的核小体压缩组装形成。核小体是由147 bp的DNA缠绕组蛋白八聚体形成。核心组蛋白可以分为四种,包括组蛋白H3、H4、H2A和H2B。核心组蛋白的表达严格地受细胞周期调控。细胞周期包括G1、S、G2和M四个不同的时期。在细胞周期的S期,组蛋白基因大量表达;在细胞周期的S期之外,组蛋白的表达被抑制。严格调控组蛋白的表达水平对细胞有重要意义。组蛋白表达水平不足会造成细胞周期停滞,导致细胞去分化、细胞衰老和细胞癌变。组蛋白的过多积累会对细胞产生毒性。组蛋白的表达受到很多因子的调控,分为抑制因子和激活因子。Spt21是调控组蛋白基因转录的激活因子。Spt21通过Spt10结合到组蛋白基因的启动子区域,进而招募组蛋白乙酰转移酶使启动子区域的组蛋白发生乙酰化,最终激活组蛋白基因的转录。Spt21的表达同样受细胞周期的调控。在细胞周期的S期,Spt21蛋白大量积累去激活组蛋白基因的转录。在细胞周期的S期之外,Spt21蛋白被降解。Spt21蛋白与核心组蛋白在细胞周期调控的模式上是一致的。因此,Spt21在维持组蛋白水平方面发挥着关键作用。研究在细胞周期中Spt21表达调控机制显得尤为重要。细胞内蛋白质的降解途径主要分为泛素-蛋白酶体系统和自噬途径。在泛素-蛋白酶体降解系统里,泛素分子通过三步级联酶反应被共价连接到蛋白质底物上,含有多个泛素分子的底物迅速被招募到蛋白酶体中进行降解。自噬途径是将受损细胞器和错误蛋白运输到溶酶体或液泡中进行降解的过程。当细胞处于G1期时,APC/C复合物能够识别Spt21的KEN区域,促进Spt21被泛素-蛋白酶体途径所降解。然而,在细胞周期其它时期Spt21的表达调控机制尚未报道。本文主要研究在细胞周期中Spt21表达调控机制。研究结果如下:1.在细胞中Spt21的蛋白含量处于较低水平。当缺失SPT21基因时,细胞生长几乎不受影响。我们构建过表达SPT21基因的菌株,通过细胞生长实验和梯度稀释实验发现Spt21蛋白的积累过多会导致细胞生长明显减慢,细胞抗DNA损伤的能力明显减弱。说明维持正常低水平的Spt21对细胞有重要作用。2.通过细胞周期实验发现Spt21在m RNA和蛋白水平上都受细胞周期的严格调控。SPT21的转录水平在细胞周期的G1晚期达到峰值,在其它时期较低。Spt21的蛋白水平在细胞周期的S期达到峰值,在其它时期较低。3.Spt21可以被自噬途径降解。通过敲除参与蛋白酶体途径或自噬途径的基因,发现Spt21蛋白在细胞周期的S/G2期被自噬途径降解。通过雷帕霉素和氮饥饿诱导自噬进一步验证了Spt21蛋白可以被自噬途径降解。4.为了寻找自噬途径中参与调控Spt21降解的蛋白,我们通过蛋白质免疫印迹筛选了自噬相关蛋白。结果发现敲除atg7和atg8基因可以抑制Spt21被自噬降解的过程。在雷帕霉素和氮饥饿诱导自噬的情况下,敲除atg7和atg8基因也能抑制Spt21被自噬降解的过程。5.Spt21可以与自噬蛋白直接相互作用。免疫共沉淀实验显示Spt21和自噬蛋白(atg7、atg8)存在相互作用,说明atg7和atg8蛋白通过与Spt21蛋白相互作用调控Spt21被自噬降解的过程。本研究发现了一种新的调控Spt21表达的方式,揭示了细胞周期通过调控Spt21的水平来调控组蛋白基因表达的机制。在细胞周期的G1期,Spt21蛋白通过泛素-蛋白酶体途径被降解;在S期Spt21蛋白积累来激活组蛋白基因的表达;在G2期Spt21蛋白通过自噬途径被降解。这为后续进一步研究Spt21被自噬降解的具体机制提供了理论基础。本研究发现在酿酒酵母细胞中Spt21蛋白积累过多会对细胞产生毒性。正确调控Spt21的水平对细胞进行正常生命活动具有重要意义。

关键词： Spt21 atg7 atg8 细胞周期蛋白酶体自噬