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asiaⅰ型口蹄疫病毒VP1基因在昆虫细胞/杆状病毒中的表达

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中国畜牧兽医 2009年第7期36卷 63-67页

作者：丁银巧张文杰张云霞赵铁柱孙明遇秀玲赵德明田克恭中国农业大学动物医学院北京100193 中国动物疫病预防控制中心兽医诊断室北京100193

利用杆状病毒表达系统对asiaⅰ型口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)VP1基因在Sf9昆虫细胞中进行表达,为研究asiaⅠ型FMDVVP1蛋白功能及建立asiaⅠ型FMDV血清学诊断方法奠定基础。采用PCR方法从pGEM-T-Easy-asiaⅠ型VP1质... 详细信息

利用杆状病毒表达系统对asiaⅰ型口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)VP1基因在Sf9昆虫细胞中进行表达,为研究asiaⅠ型FMDVVP1蛋白功能及建立asiaⅠ型FMDV血清学诊断方法奠定基础。采用PCR方法从pGEM-T-Easy-asiaⅠ型VP1质粒中扩增VP1基因,将其插入杆状病毒转座载体pFastBacHTA,构建的重组质粒pFast-BacHTA-VP1再转入DH10Bac感受态细胞,经三重抗性与蓝白斑筛选,获得杆状病毒重组质粒Bacmid-VP1,然后转染Sf9昆虫细胞。PCR鉴定证实VP1基因正确地插入到Bacmid中,成功构建了杆状病毒重组质粒Bacmid-VP1,SDS-PAGE和Western-blotting检测结果表明,VP1基因在Sf9昆虫细胞中表达出约26.5ku的VP1蛋白。将可溶性表达的融合蛋白用Ni-NTA亲和层析方法进行纯化,通过ELISA分析,能特异性地检测出asiaⅰ型口蹄疫病毒阳性血清。asiaⅠ型FMDV VP1基因在杆状病毒表达系统中的成功表达为asiaⅠ型FMDV VP1蛋白的抗原性及血清学抗体水平检测研究奠定了基础。

关键词： asiaⅰ型口蹄疫病毒 VP1基因杆状病毒真核表达

羊O／P液中asiaⅰ型口蹄疫病毒VP1基因3′端序列的分析

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中国兽医科学 2008年第7期38卷 559-562页

作者：王建东卢曾军包慧芳曹轶梅郭建宏刘湘涛何生虎杨春生刘在新中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点实验室国家口蹄疫参考实验室甘肃兰州730046 宁夏大学农学院宁夏银川750001

从宁夏中卫asiaⅠ型口蹄疫疫区的无临床症状羊采集的食道咽部分泌液（OPF）中扩增得到了4个口蹄疫病毒（FMDV）VP1基因3′-端483bp（VP483）片段。核苷酸和氨基酸序列比较结果表明，从4份OPF中扩增出的VP1片段，在细胞受体结合位点处的... 详细信息

从宁夏中卫asiaⅠ型口蹄疫疫区的无临床症状羊采集的食道咽部分泌液（OPF）中扩增得到了4个口蹄疫病毒（FMDV）VP1基因3′-端483bp（VP483）片段。核苷酸和氨基酸序列比较结果表明，从4份OPF中扩增出的VP1片段，在细胞受体结合位点处的关键氨基酸与目前公布的FMDVasiaⅠ型流行毒相比均发生了改变，由RGD变成RDD。4个扩增片段的核苷酸序列与asiaⅠ／js／WX／05株相比，同源性为96．2％～98、3％，表明与asiaI／JS／WX／05株高度同源。蛋白结构模拟结果显示，这种改变会导致G—H环柔性减弱，这可能是asiaⅠ／JS／WX／05FMDV适应羊体，造成持续感染后发生的一种变异。

关键词： asiaⅰ型口蹄疫病毒羊O/P液 VPl基因序列分析

牛asiaⅰ型口蹄疫病毒克隆纯化及其灭活疫苗的研究

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牛AsiaⅠ型口蹄疫病毒克隆纯化及其灭活疫苗的研究

作者：李玉娟西北农林科技大学

学位级别：硕士

我国自1999年暴发第五次口蹄疫病流行以来,至今仍未能有效地控制口蹄疫疫情,各省区散发和区域性流行现象不断出现,疫情形势异常严峻。我国现行口蹄疫灭活疫苗,由于毒株型别单一,生产工艺相对简单落后,导致疫苗免疫效力低,副反应大,对口... 详细信息

我国自1999年暴发第五次口蹄疫病流行以来,至今仍未能有效地控制口蹄疫疫情,各省区散发和区域性流行现象不断出现,疫情形势异常严峻。我国现行口蹄疫灭活疫苗,由于毒株型别单一,生产工艺相对简单落后,导致疫苗免疫效力低,副反应大,对口蹄疫病的预防性较差,对现行口蹄疫灭活疫苗进行生产工艺改进,进一步提高抗原纯度,研制口蹄疫克隆纯化灭活疫苗已变得十分必要和迫切,特对其进行了以下研究: 1.应用BHK细胞通过蚀斑试验克隆和再次克隆牛asia I型口蹄疫病毒毒株AKT03并对克隆前和第一次、第二次克隆的口蹄疫病毒毒株的细胞半数感染量(TCID)、乳鼠半数致死量(LD(50))进行比较测定。结果表明,通过蚀斑试验成功的克隆了牛asia I型口蹄疫AKT03毒株。口蹄疫asia I KT03毒株克隆后的蚀斑形成单位(3.0x10pfu/mL)比克隆前的蚀斑形成单位(7.2x10pfu/mL)提高了4倍。克隆后口蹄疫asia I KT03毒株的TCID(5.5～6.5)和LD(7.78～8.43)分别比克隆前TCID(4.37～5.75)和LD(6.88～7.43)明显提高,第一次克隆的毒株和第二次克隆的毒株的TCID和LD效价明显提高。这给制备口蹄疫疫苗提供了优质的抗原。 2.应用牛口蹄疫asia I KT03克隆毒株研制牛asia I型口蹄疫油乳剂灭活疫苗并对其物理性状、无菌检验、安全检验、免疫效力检测等进行了系统的研究。应用克隆毒株研制的asia I型口蹄疫油乳剂灭活疫苗为乳白色,稳定、稀薄、无菌、安全,免疫效力检验结果表明克隆口蹄疫asia I KT03毒株疫苗的半数保护量(PD)比普通疫苗提高2.4倍。因此,克隆毒株疫苗的免疫效力比普通疫苗明显提高。

关键词： asiaⅰ型口蹄疫病毒蚀斑试验克隆灭活疫苗

亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒多抗原表位DNA疫苗免疫原性研究

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亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒多抗原表位DNA疫苗免疫原性研究

作者：张攀中国农业科学院

学位级别：硕士

为了构建asiaⅠ型FMDV多抗原表位DNA疫苗，选择asiaⅠ型FMDV的B细胞表位VP1135-159aa、VP1194-211aa及T细胞表位3A21-45aa、3D789-805aa。采用重复串联的策略，人工合成多抗原表位基因片段F。利用限制性内切酶Hind Ⅲ、XbaⅠ将片段F克... 详细信息

为了构建asiaⅠ型FMDV多抗原表位DNA疫苗，选择asiaⅠ型FMDV的B细胞表位VP1135-159aa、VP1194-211aa及T细胞表位3A21-45aa、3D789-805aa。采用重复串联的策略，人工合成多抗原表位基因片段F。利用限制性内切酶Hind Ⅲ、XbaⅠ将片段F克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(+)，构建出重组质粒pc-F;将PCR鉴定、酶切鉴定和序列测定分析为阳性的重组质粒pc-F利用LipofectamineTM2000转染进入BHK-21细胞;通过Western Blot、间接免疫荧光标记法检测重组质粒pc-F在BHK-21细胞内的表达情况。通过RT-PCR技术从伴刀豆球蛋白A刺激培养的牛外周血淋巴细胞中扩增出牛IL-4基因，进行测序鉴定;利用PCR技术扩增出不含信号肽序列的IL-4基因片段SIL4，利用限制性内切酶NheⅠ/KpnⅠ将基因片段SIL4克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)，构建重组质粒pc-SIL4。经PCR鉴定、酶切鉴定和序列测定分析后，将阳性重组质粒pc-SIL4转染BHK-21细胞，利用间接免疫荧光技术鉴定重组表达载体pc-SIL4在BHK-21细胞中的表达情况。为研究重组质粒pc-F作为DNA疫苗对实验动物BALB/C小鼠的免疫效果，将重组质粒pc-F单独或与重组质粒pc-SIL4联合以肌肉注射的方法免疫实验动物小鼠。同时设立对照组，包括PBS免疫组、pcDNA3.1(+)免疫组和灭活苗免疫组。结果显示： 1)合成的目的基因片段F长759bp，编码244个氨基酸。片段F被成功的克隆到载体pcDNA3.1(+)上，且该基因片段F与合成报告中所提供的片段F的相似性为100%。 2)牛IL-4基因序列长576bp，编码136个氨基酸，且与GeneBank上登录的牛IL-4基因序列相应片段的同源性为99.7%。不含信号肽的牛IL-4基因片段SIL4长342bp，编码氨基酸113个，被成功克隆到载体pcDNA3.1(+)上，且基因片段SIL4与GeneBank上登录的牛IL-4基因序列相应片段的同源性为100%。 3)间接免疫荧光检测结果显示所构建的重组质粒pc-F和pc-SIL4能够在BHK-21细胞中正确表达，表达的蛋白有良好的反应原性。Western Blot结果显示重组质粒pc-F所表达蛋白的大小为25.4Ku。 4)与PBS组和pcDNA3.1组相比，各疫苗免疫组小鼠血清特异性抗体IgG水平升高，淋巴细胞增殖能力增强，细胞因子IL-4、IFN-γ含量有不同程度升高。 5) pc-F+pc-SIL4联合免疫组小鼠的特异性抗体水平略高于DNA疫苗pc-F单独免疫组。同时，pc-F+pc-SIL4联合免疫组小鼠外周血中INF-γ含量低于DNA疫苗pc-F单独免疫组，IL-4含量要高于DNA疫苗pc-F单独免疫组。

关键词： asiaⅰ型口蹄疫病毒多抗原表位 DNA疫苗免疫效果

asiaⅠ型口蹄疫双效表达载体在BHK-21细胞中的表达

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当代畜牧 2012年第3期41卷 61-62页

作者：韩晓荣刘纪省杨彬海南科技职业学院海口5711261 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃兰州730046

将构建好的双向反义表达载体PQC-AS-P12A3C经脂质体2000转染Ampho-pack293细胞,收获假病毒,在聚凝胺的介导下将其转染到BHK-21细胞,一定时间后进行检测。通过荧光抗体染色、目的基因的整合鉴定和RT-PCR检测等表明,目的基因P12A在细胞中... 详细信息

将构建好的双向反义表达载体PQC-AS-P12A3C经脂质体2000转染Ampho-pack293细胞,收获假病毒,在聚凝胺的介导下将其转染到BHK-21细胞,一定时间后进行检测。通过荧光抗体染色、目的基因的整合鉴定和RT-PCR检测等表明,目的基因P12A在细胞中成功表达,且已经整合到细胞染色体基因组中,病毒抑制试验则表明重组反义质粒对FMDV的产生起到一定的抑制作用。

关键词： asiaⅰ型口蹄疫病毒双效表达载体 BHK-21细胞转染表达