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江苏省植物病理学会第十一次会员代表大会暨学术研讨会

作者： Guo-Liang Qian~+ Jia-Qin Fan~+ Yue-Jing Kang~+ Bing Han Bai-Shi Hu~* Feng-Quan Liu~* Department of Plant Pathology,College of Plant Protection,Nanjing Agricultural University,Nanjing,210095,China *To whom correspondence should be addressed.Tel:+86-25-84396726.Fax:+86-25-84395325.

An N-acyl homoserine lactonase gene aiia,transcribed by a strong and constitutive Escherichia coli promoter P (accession ***723847),was transformed into Lysobacter enzymogenes strain OH11,creating strain *** N-acyl-homoserine lactone (AHL)-degradation assay showed that transformant OH11A acquired the ability to degrade AHL molecules produced by Agrobacterium tumefaciens,Erwinia carotovora, Pseudomonas *** ***3000 and Acidovorax avenae *** test showed that while the parental strain OH11 did not reduce *** infection,the transformant OH11A caused a strong reduction of Erwinia virulence on Chinese cabbages and cactus,whereas strain OH11A did not seem to interfere the normal growth of this pathogen in *** antimicrobial activity assays,strain OH11A and OH11 showed similar antimicrobial activity against Phytophthora capsici and Sclerotinia *** work provided a new strategy for developing genetically engineered multi-functional L. enzymogenes strains that possessed the ability to biologically control fungal pathogens and reduced bacterial pathogenicity.

关键词： Lysobacter enzymogenes acyl homoserine lactone aiia Erwinia carotovora

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蜡质芽孢杆菌aiia基因的克隆及融合表达

福建农林大学学报（自然科学版） 2006年第3期35卷 292-297页

作者：黄天培杨梅姚帆黄张敏俞晓敏黄志鹏黄必旺生物农药与化学生物学教育部重点实验室(福建农林大学) 福建福州350002 福建师范大学生命科学学院福建福州350007

设计一对可扩增aiia基因完整的开放阅读框的简并引物对aiia1和aiia2,通过PCR技术对3株蜡质芽孢杆菌(Bc)的aiia基因进行检测.结果表明,它们均含有aiia基因.利用pMD18-T克隆载体直接从GP7菌株的PCR产物中克隆了aiia基因.测序结果表明,该基... 详细信息

设计一对可扩增aiia基因完整的开放阅读框的简并引物对aiia1和aiia2,通过PCR技术对3株蜡质芽孢杆菌(Bc)的aiia基因进行检测.结果表明,它们均含有aiia基因.利用pMD18-T克隆载体直接从GP7菌株的PCR产物中克隆了aiia基因.测序结果表明,该基因(GenBank登录号:AY943831)由753个碱基组成,编码含有250个氨基酸残基的蛋白质.该蛋白质推测的分子质量为28 ku,等电点约4.235.核苷酸序列的BLAST分析结果表明,与之同源性较高的基因均为Bc组aiia基因(87%-99%).在氨基酸序列多重比较的基础上,应用PHYLIP软件构建了A iiA蛋白的系统发育树.此外,利用原核融合表达载体pMXB10初步研究了A iiA、几丁质结合蛋白(CBD)及Inte in融合蛋白诱导表达的情况.

关键词：蜡质芽孢杆菌(Bc) aiia 基因克隆序列分析生物信息学系统发育树融合蛋白

aiia对AHL调控下猪源F4ac+产毒素大肠杆菌破坏肠道屏障的保护及机制探讨

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AiiA对AHL调控下猪源F4ac+产毒素大肠杆菌破坏肠道屏障的保护及机...

作者：邵季扬州大学

学位级别：硕士

产肠毒素大肠杆菌（enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC）是引起初生和断奶仔猪腹泻的重要病原体,在全世界范围内造成养猪业的巨大经济损失。通常认为ETEC通过黏附素定殖于仔猪肠上皮细胞,大量繁殖后通过释放肠毒素损伤肠道屏障并... 详细信息

产肠毒素大肠杆菌（enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC）是引起初生和断奶仔猪腹泻的重要病原体,在全世界范围内造成养猪业的巨大经济损失。通常认为ETEC通过黏附素定殖于仔猪肠上皮细胞,大量繁殖后通过释放肠毒素损伤肠道屏障并引起仔猪腹泻。大肠杆菌无法自身合成AHLs,却编码LuxR同源蛋白SdiA,可感应并应答于其他细菌产生的各种群体信号,通过这种被称为“群体感应窃听”的行为调控自身群体感应相关基因;即可窃听环境中优势菌种的联络信号,在自身种群未达到致病规模时提前诱导相应基因表达,以获得生存或致病优势。在前期研究中,我们发现Ⅰ型群体感应信号分子AHL能够直接诱导肠上皮细胞凋亡,造成肠上皮细胞骨架损伤,破坏肠道粘膜机械屏障,可协助病原菌发挥致病作用,细菌移位并进入体循环造成全身感染。aiia基因编码的aiia蛋白通过水解AHLs分子的内酯环,使AHLs分子失去生物活性,降低了 AHLs分子的浓度,进而减弱病原菌致病基因的表达。本研究旨在探究aiia对AHL调控下猪源F4ac+产毒素大肠杆菌致肠道微生物屏障、机械屏障、免疫屏障损伤的保护作用,进一步明确群体感应抑制剂作用机制和应用前景。具体研究内容如下:1.群体感应AHL信号对猪源F4ac+产肠毒素大肠杆菌生物学特性的影响。将负责合成侧链长链AHL分子（3OC12-HSL）的铜绿假单胞菌lasI基因,和负责合成侧链短链AHL（C6-HSL）的小肠结肠炎耶尔森菌yenI基因,分别转化至ETEC菌株C83902中,赋予其内源合成3OC12-HSL和C6-HSL信号分子的能力;同时分别在培养基中外源添加200 μmol/L的3OC12-HSL、C6-HSL,与ETEC菌株C83902共同培养。通过不同来源（外源、内源添加）不同种类（长链、短链侧链）AHL分子,分别刺激ETEC菌株,观测其生长特性、生物被膜形成能力、对仔猪小肠上皮细胞IPEC-J2粘附能力等生物学特性变化;运用Real-time PCR技术,检测AHL影响下菌毛、鞭毛、肠毒素、黏附素、溶血素等主要毒力因子转录水平。结果表明群体感应AHL影响下ETEC菌株生物被膜形成能力显著降低,对仔猪小肠上皮细胞IPEC-J2的粘附能力显著降低,鞭毛fliC等主要毒力因子基因表达受调控。***介导AHL对宿主肠道屏障的影响。通过体外不同培养条件下对ETEC生长速率的测定,并利用荧光定量PCR对ETEC生长、应激相关基因进行定量。发现静置培养时AHL对ETEC生长速率有显著促进作用,ETEC应激反应相关基因rpoS、rmf、促分裂生长基因ftsZ表达水平显著升高。通过建立体外模拟肠道菌群模型,并对其中大肠杆菌的生长特性进行定量分析。结果显示体外环境AHL作用下,C83902在6h、12 h、18 h、24 h,生长数量分别提高了 20.5%,37.6%,27.5%,33.9%。通过在饮用水中添加AHL,进行小鼠肠道菌群16s组学试验。组学结果显示,AHL作用下小鼠肠道菌群物种组成及相对丰度发生显著变化;差异物种Heatmap图、种属水平Top10菌种分析均显示大肠杆菌在AHL作用下数量下调。通过荧光定量PCR方法对小鼠肠道菌群中大肠杆菌数量进行定量,结果与小鼠肠道菌群16s组学一致,即体内环境中AHL抑制大肠杆菌生长。将野生株ETEC C83902与ETEC鞭毛缺失株C83902ΔfliC同时刺激猪小肠上皮细胞IPEC-J2,可见缺失株诱导肠上皮细胞凋亡能力下调7.6%。在缺失株组添加鞭毛素FliC蛋白,诱导凋亡能力回复。利用AHL与ETEC共同刺激猪小肠上皮细胞IPEC-J2以建立细胞模型;同时建立群体感应信号分子AHL与致病性大肠杆菌ETEC共同感染的小鼠模型,通过ELISA方法分别检测猪肠上皮细胞上清和小鼠血清中免疫因子IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、TGF-β水平的表达情况。相较于阴性对照组,3OC12-HSL组可直接诱导肠上皮细胞及小鼠产生免疫应答,各免疫因子的表达显著升高,表明群体感应信号分子AHL可影响干扰肠道免疫屏障;在猪肠上皮细胞IPEC-J2上,相较于C83902组,C83902+3OC12-HSL组IL-1β、IL-6的产生水平分别下降了 9.7%、3.5%,IL-10、TGF-β的产生水平分别上升了 4.5%、16.7%。在小鼠血清中,相较于C83902组,C83902+3OC12-HSL组IL-6、TNF-α的产生水平分别下降了 8.1%、5.7%,IL-1β的产生水平上升了12.6%。以上结果显示ETEC介导下,AHL信号在肠道环境中严重干扰肠道微生物屏障,同时对机械屏障、免疫屏障也有一定程度的影响。***对AHL/ETEC影响肠道屏障的保护作用。通过在

关键词： aiia AHL 肠道屏障 QSI ETEC

群体感应信号分子降解酶aiia的分子进化研究

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群体感应信号分子降解酶AiiA的分子进化研究

作者：李婧华东理工大学

学位级别：硕士

许多细菌都能够合成并释放一种或多种信号分子,随着菌体密度的增加,信号分子的浓度也随之增加。当信号分子的浓度积累到一定阀值的时候,就会启动菌体中相关基因的表达,调控细菌的某些生物行为。在大部分革兰氏阴性致病菌中,信号分子的... 详细信息

许多细菌都能够合成并释放一种或多种信号分子,随着菌体密度的增加,信号分子的浓度也随之增加。当信号分子的浓度积累到一定阀值的时候,就会启动菌体中相关基因的表达,调控细菌的某些生物行为。在大部分革兰氏阴性致病菌中,信号分子的积累可以启动下游致病因子的表达。从苏云金芽孢杆菌Bt.4Q7中克隆得到的aiia基因编码的aiia蛋白可以降解群体感应信号分子,从而使得致病菌的致病性降低或者消失。aiia蛋白的活性越高,对致病菌致病性的抑制作用也就越明显。本文通过PCR扩增,得到了aiia4Q7、aiia8010、aiiaWB4、aiiaWB12、aiiaT-HW3、aiia6A3共6个aiia同源基因;运用DNA shuffling分子进化技术,通过一步DNaseⅠ(Rnase Free)随机酶切、三轮无引物PCR、一轮有引物PCR过程,成功构建了aiia基因突变库;以紫色色杆菌突变株CV026为报告菌,从中筛选得到了S29、S47、S21、S4、S36、S52、S7、S14、S63共9株具有较高aiia蛋白酶活的突变株,并进一步得到了进化后的aiiaS29、aiiaS47、aiiaS21、aiiaS4、aiiaS36、aiiaS52、aiiaS7、aiiaS14、aiiaS63基因;aiiaS29和aiiaS36基因的测序结果完全相同,其余aiia基因序列各不相同。制备了aiiaT-HW3、aiia4Q7、aiia8010、aiiaWB4/WB12、aiiaS29/S36、aiiaS47/S52、aiiaS21、aiiaS4、aiiaS7、aiiaS63共10个aiia蛋白样品,通过测定各aiia蛋白样品之间的相对酶活,得到了具有高酶活性的aiia蛋白即aiias29／s36,其进化后的酶活性比原始aiia4Q7提高了2.2倍,成功实现了对群体感应信号分子降解酶aiia的分子进化。

关键词：群体感应 aiia AHLs 分子进化 CV026

花粉管通道法介导aiia和TuMV-CP基因转化大白菜的研究

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花粉管通道法介导aiiA和TuMV-CP基因转化大白菜的研究

作者：韩丽伟东北农业大学

学位级别：硕士

大白菜（Brassica campestris L. ssp. pekinensis）原产于中国,是我国蔬菜栽培中分布最广,种植面积最大的蔬菜作物之一,在我国尤其是北方地区的“菜篮子工程”中占有举足轻重的地位。但是,近年来随着大白菜栽培面积的不断扩大和种植年... 详细信息

大白菜（Brassica campestris L. ssp. pekinensis）原产于中国,是我国蔬菜栽培中分布最广,种植面积最大的蔬菜作物之一,在我国尤其是北方地区的“菜篮子工程”中占有举足轻重的地位。但是,近年来随着大白菜栽培面积的不断扩大和种植年限的不断增加,软腐病、病毒病等许多病害有加重发展的趋势,严重地影响了大白菜的生产。本研究通过花粉管通道法将aiia,TuMV-CP基因导入大白菜,期望获得抗病转基因植株,为大白菜的抗病育种奠定理论基础。研究结果如下: 1.根据aiia基因的已知序列,克隆该基因,以植物表达载体pBBBast+为目标载体,通过酶切、连接、筛选、鉴定等操作构建了植物表达载体pBBBast-aiia。 2.本研究利用pET-29a构建了pET29a-aiia原核表达载体,制备了*** BL21（DE3）-pET29a-aiia工程菌。通过对融合表达条件（如温度、IPTG浓度及诱导时间）进行优化并用SDS-PAGE检测,结果表明,在20℃低温,0.8 mmol/L IPTG诱导表达25 h条件下可获得含量最高的可溶性aiia蛋白51.1μg/mL。 3.纯化后的aiia蛋白和破壁上清液经活性检测和抑菌抗病实验,结果表明均具有良好的aiia活性和良好抑菌效果。 4.通过花粉管通道法,将aiia,TuMV-CP基因转入大白菜“二牛心”品种中。对转基因植株进行PCR和PCR-Southern验证,获得了转aiia基因大白菜5株,转化率为0.0242%;转TuMV-CP基因大白菜29株,转化率为0.1531%。

关键词：大白菜 aiia TuMV-CP基因花粉管通道法转基因

农杆菌介导3α-HSD/CR与aiia双基因融合载体转化水稻研究

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农杆菌介导3α-HSD/CR与aiiA双基因融合载体转化水稻研究

作者：王京京福建农林大学

学位级别：硕士

随着人类生产活动的发展，大量的有机化学物质（如甾类化合物等）不断进入人类的生产和生活环境中，造成了越来越严重的污染。睾丸酮丛毛单胞菌（Comamonas testosteroni，C. testosteroni）是在自然界中分布广泛的一种革兰氏阴性杆菌，... 详细信息

随着人类生产活动的发展，大量的有机化学物质（如甾类化合物等）不断进入人类的生产和生活环境中，造成了越来越严重的污染。睾丸酮丛毛单胞菌（Comamonas testosteroni，C. testosteroni）是在自然界中分布广泛的一种革兰氏阴性杆菌，C. testosteroni能以睾丸酮、胆汁酸和其它类固醇化合物作为唯一的碳源与能源，可完全降解该类化合物。C. testosteroni具有降解甾核的关键酶3α-羟类固醇脱氢酶/碳酰基还原酶（3α-hydroxysteroid dehydrogenase/carbonyl reductase,3α-HSD/CR），可降解许多难降解化合物，在污染环境中的生物修复上具有很高的应用价值。苏云金芽孢杆菌中的aiia基因所编码的aiia蛋白是一种可以降解革兰氏阴性细菌中普遍存在的信号分子N-乙酰高丝氨酸内酯（N-acyl-homoserine lactones, AHLs）的内酯酶，从而提高抗病性减弱某些致病菌产生的危害。本研究将本实验室已构建的原核双基因表达载体的基础上构建真核双基因表达载体，并通过农杆菌介导法获得转基因水稻，并检测转基因水稻中融合蛋白的表达和生物活性，以期获得具有双基因优点的水稻新种质。研究方法和研究结果如下： 1.构建真核融合基因表达载体PTCK303-3α-HSD/CR-aiia，并经酶切验证和核酸序列分析确定构建成功。 2.利用NB+2.0mg/L2,4-D培养基诱导获得明恢86和日本晴的愈伤受体系统，通过农杆菌介导法将融合基因3α-HSD/CR-aiia分别转入两个品种的水稻愈伤受体;经PCR、PCR-Southern blot与GUS组织染色验证获得转融合基因水稻植株。 3.通过酶联免疫法（ELISA）验证在转融合基因水稻中存在3α-HSD/CR蛋白，且目的蛋白含量显著高于对照。 4.通过对胡萝卜软腐欧文氏杆菌抗菌性实验验证，转融合基因水稻植株中aiia得到表达。 5.由酶联免疫与抗软腐病实验表明融合基因在转基因植物中均得到表达。

关键词： 3α-羟类固醇脱氢酶/碳酰基还原酶 aiia 融合基因转基因水稻

3a-HSD/CR和aiia双基因融合表达载体的构建和表达

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3a-HSD/CR和aiiA双基因融合表达载体的构建和表达

作者：林彬辉福建农林大学

学位级别：硕士

睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)具有降解许多难降解化合物的能力,在污染物的生物修复上具有很高的应用价值。C. testosteroni具有降解甾核的关键酶3a-羟类固醇脱氢酶/碳酰基还原酶(3a-hydroxysteroid dehydrogenase/ carbony... 详细信息

睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)具有降解许多难降解化合物的能力,在污染物的生物修复上具有很高的应用价值。C. testosteroni具有降解甾核的关键酶3a-羟类固醇脱氢酶/碳酰基还原酶(3a-hydroxysteroid dehydrogenase/ carbonyl reductase,3a-HSD/CR)基因,能够以睾丸酮、孕酮和胆汁酸等类固醇类物质为唯一碳源和能源,该菌在这些危害大的稳定化合物的生物修复中起重要作用。然而,涉及这些物质降解的酶在该菌中是诱导表达的。因此,该菌对污染物的消化降解速度很慢,限制了该菌在生物修复中的大规模应用。苏云金芽孢杆菌(Baci llus thuringiensis, Bt)是一种革兰氏阳性产孢细菌,能形成杀虫蛋白、外毒素、几丁质酶和蛋白酶等多种毒素,对多种昆虫以及线虫、螨虫、原生动物都有活性。Bt aiia基因所编码的aiia蛋白是一种可以降解N-乙酰高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserine lactones, AHLs)的内酯酶,从而减弱某些致病菌产生的危害。本研究将3a-HSD/CR和aiia这两个基因相连接构建了双基因融合表达载体,纯化并检测了融合蛋白的生物活性。同时也构建了真核表达载体。研究方法和结果如下:根据GenBank上已公布的3α-HSD/CR(774 bp)全长基因序列,设计一对PCR扩增引物。构建了3α-HSD/CR基因表达载体pET29a-3α-HSD/CR,在大肠杆菌BL21里进行了诱导表达。根据GenBank上已公布的aiia(753 bp)全长基因序列,设计一对PCR扩增引物。以质粒pET29a-3α-HSD/CR为载体构建了3α-HSD/CR与aiia基因完全融合的重组质粒pET29a-3α-HSD/CR–aiia,经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,以IPTG诱导表达3α-HSD/CR–aiia融合蛋白,用SDS-PAGE进行鉴定。利用Qiagen公司的Ni-NTA Spin Column进行3α-HSD/CR–aiia融合蛋白的分离纯化。应用酶联免疫吸附实验(ELISA)和高效液相色谱法(HPLC)分别分析了3α-HSD/CR–aiia融合蛋白表达及其对睾丸酮降解能力。检测融合蛋白对马铃薯软腐病抑制作用。结果表明:扩增出了3α-HSD/CR(774 bp)及aiia(753 bp)基因,成功构建了重组质粒pET29a-3α-HSD/CR–aiia,SDS-PAGE分析显示重组质pET29a-3α-HSD/CR–aiia在原核系统中得到了表达。成功构建了pET29a-3α-HSD/CR–aiia双基因的原核融合表达载体。通过HPLC试验表明融合蛋白对睾丸酮有很好的降解能力。通过抑菌实验证实融合蛋白对胡萝卜软腐欧文氏杆菌(Erwinia carotovora)引起的马铃薯软腐病有较好的抑制作用。以pET29a-3α-HSD/CR–aiia质粒为模板,PCR扩增获得3α-HSD/CR–aiia基因,与真核表达载体pCMBIA1301定向重组,构建pCMBIA1301-3α-HSD/CR–aiia真核表达载体,经PCR、限制性核酸内切酶酶切鉴定。结果表明成功构建了pCMBIA1301-3α-HSD/CR–aiia真核表达载体。

关键词：睾丸酮丛毛单胞菌苏云金芽孢杆菌 3α-羟类固醇脱氢酶/碳酰基还原酶 aiia

基于磁性蛋白MagR的群感信号分子水解酶aiia的固定化研究

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基于磁性蛋白MagR的群感信号分子水解酶AiiA的固定化研究

作者：王琳武汉理工大学

学位级别：硕士

群感效应（Quorum sensing,QS）是细菌根据密度大小进行的细胞内或细胞间的信息交流（Cell-cell communication）,协调群体行为和调控基因表达的一种重要的行为方式。N-酰基高丝氨酸内酯（N-acyl-homoserine lactones,AHL）作为群感效... 详细信息

群感效应（Quorum sensing,QS）是细菌根据密度大小进行的细胞内或细胞间的信息交流（Cell-cell communication）,协调群体行为和调控基因表达的一种重要的行为方式。N-酰基高丝氨酸内酯（N-acyl-homoserine lactones,AHL）作为群感效应系统的信号分子,在其中起到重要作用。当环境中的AHLs的浓度达到一定阈值时,QS系统的相关基因的启动子才会被激活,进而调控其表达。革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都受群体感应系统的调控。QS系统参与调控了许多重要的生物学功能:如参与抗生素合成、生物膜的形成、生物发光、生物群游现象和质粒结合转移等。在生活中,革兰氏阴性细菌是主要的致病菌,其致病因子就是通过细菌的群体感应系统来进行调控。铜绿假单胞菌（革兰氏阴性细菌）生成的生物膜也是受群体感应系统调控。其生物膜的生成与铜绿假单胞菌在机体内产生耐药性有很大的关系。在医疗实践上,当植入体进入人体之后会发生细菌感染的问题,其中一个主要原因是由于植入体表面形成了生物膜,阻止抗生素和杀菌药物的渗透以及免疫细胞对细菌的吞噬,从而导致植入体表面抗生素和机体免疫机制的失灵。因此在医疗植入物的特定表面抑制QS,有利于阻止生物膜形成,提高抗生素和机体对于黏附细菌的清除。aiia基因是细菌群感效应的猝灭基因。苏云金芽孢杆菌中的aiia基因表达产物为N-酰基高丝氨酸内酯酶（AHL-Lactonase）,是一种具有降解AHLs分子能力的水解酶,能够降低相对封闭环境中的AHLs的量,导致革兰氏阴性细菌的群体感应系统被阻滞甚至破坏,从而极大地减弱致病菌的危害能力。这种方法有望成为生物防治革兰氏阴性病原菌的新手段。为了解决植入体表面细菌感染的问题,可以通过固定的N-酰基高丝氨酸内酯酶来降解或修改植入体特定区域的QS信号来实现。但进入人体游离的N-酰基高丝氨酸内酯酶会向不同周围环境扩散,从而影响其效果。通常,酶可以通过化学或物理手段固定化,通过修饰酶或支持物/载体来使彼此之间产生特定的相互作用,保持其浓度,例如亲和标签结合,载体上的吸附,包埋,交联,共价键。然而,常规融合标签之间的相互作用依赖于环境的pH,盐度和离子强度,这可能不适合标记酶的活性。本论文希望基于磁性蛋白MagR介导的aiia酶的固定化,从而创立一种新的酶固定化方法,以克服蛋白质传统固定方法的缺点,从而用于预防和清除医疗植入体表面的细菌黏附。本文的研究结果如下:（1）aiia-MagR重组蛋白的表达构建。将人工合成的aiia基因与MagR基因的pET28a质粒进行酶切、连接、纯化等分子生物学操作,得到重组表达质粒pET28a[aiia-MagR],并用菌落PCR、测序进行验证。对构建正确的重组质粒进行目标蛋白的诱导表达研究,并对表达条件进行优化（培养基、温度、时间、IPTG浓度）,获得目标蛋白。（2）aiia-MagR重组蛋白固定化研究及相关表征。优化表达后的融合蛋白与磁珠在室温下相互作用,得到IB@[aiia-MagR]。SDS-PAGE电泳和BCA蛋白浓度法均证实蛋白确实结合在磁珠上。Zeta电势,FTIR光谱和SEM电镜结果也一致证实融合蛋白aiia-MagR确实固定在磁性纳米颗粒（IB）上了。（3）IB@[aiia-MagR]的酶活性和抑制生物膜功能的研究。通过定性和定量的CV026简单生物测定实验,证实IB@[aiia-MagR]具有酶活性。在铜绿假单胞菌生物膜的实验中,证实了IB@[aiia-MagR]存在抑制生物膜的功能,保留有aiia蛋白的生物学活性。

关键词：群体感应信号水解酶 aiia MagR 磁固定

3α-HSD/CR、aiia和3α-HSD/CR-aiik基因转化烟草及表达分析

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3α-HSD/CR、aiiA和3α-HSD/CR-aiik基因转化烟草及表达分析

作者：营文文福建农林大学

学位级别：硕士

人类经济快速发展，大量的废气、废水、废物等排放到环境中，导致环境污染日益严重。3α-HSD/CR基因是睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)的关键酶3α-羟类固醇脱氢酶/碳酰基还原酶（3α-hydroxysteroid dehydrogenase/carbonyl ... 详细信息

人类经济快速发展，大量的废气、废水、废物等排放到环境中，导致环境污染日益严重。3α-HSD/CR基因是睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)的关键酶3α-羟类固醇脱氢酶/碳酰基还原酶（3α-hydroxysteroid dehydrogenase/carbonyl reductase，3α-HSD/CR）基因，对环境污染物中的类固醇化合物有很好的降解作用。aiia基因是从苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis, Bt)中克隆的一种酰基高丝氨酸环内酯酶(acyl homoserine lactones, AHLs)基因。aiia蛋白对胡萝卜欧文氏软腐病菌(Erwinia carotovora)引起的软腐病具有抑制作用，其机制是将该菌产生的AHLs分子的内酯键打开，使其结构改变，失去信号分子的功能，进而减弱病害。近年来，植物基因工程迅速发展，“超级生物”备受关注，转基因由单基因向多基因方向发展。但是，由于受到目前可选择的载体数目和载体容量的限制，多基因转化困难。融合基因转化以及融合表达载体构建技术的发展，为多基因的遗传转化开辟了一条新途径。本研究构建3α-HSD/CR基因和aiia基因融合基因植物表达载体并转化烟草，初步研究了融合基因在烟草中的表达。主要方法和结果如下：1.构建了融合基因3α-HSD/CR-aiia植物表达载体pTCK303-3α-HSD/CR-aiia，同时构建了两个单基因(3α-HSD/CR和aiia)植物表达载体pTCK303-3α-HSD/CR和pTCK303-aiia作为对照，研究融合基因的表达。通过酶切验证及测序表明载体构建成功。2.利用农杆菌介导法将融合基因3α-HSD/CR-aiia及两个单基因3α-HSD/CR和aiia转化烟草。经PCR检测及GUS组织化学染色结果表明成功获得转融合基因3α-HSD/CR-aiia烟草及转单基因3α-HSD/CR和aiia烟草。3.利用酶联免疫吸附法(ELISA)检测3α-HSD/CR蛋白在转融合基因3α-HSD/CR-aiia烟草和转单基因3α-HSD/CR烟草中均成功的表达了。4.采用胆固醇降解试验检测转3α-HSD/CR-aiia和3α-HSD/CR基因烟草对胆固醇的降解率均达到70%左右，远远高于对照。5.对转3α-HSD/CR-aiia和aiia基因烟草离体叶片针刺法接种胡萝卜软腐欧文氏杆菌，结果表明转基因烟草离体叶片对胡萝卜软腐欧文氏杆菌引起的软腐病具有抑制作用。6.由胆固醇降解试验及抗病试验结果表明：转3α-HSD/CR-aiia融合基因的烟草同时表达了3α-HSD/CR蛋白和aiia蛋白的功能，获得了对环境具有修复作用的抗病性烟草。

关键词：多基因融合基因 3α-HSD/CR 基因 aiia