群体感应信号分子降解酶AiiA的分子进化研究

作     者：李婧 

作者单位：华东理工大学 

学位级别：硕士

导师姓名：叶邦策

授予年度：2010年

学科分类：0710[理学-生物学] 1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 100705[医学-微生物与生化药学] 07[理学] 071005[理学-微生物学] 10[医学] 

主      题：群体感应 AiiA AHLs 分子进化 CV026 

摘      要：许多细菌都能够合成并释放一种或多种信号分子,随着菌体密度的增加,信号分子的浓度也随之增加。当信号分子的浓度积累到一定阀值的时候,就会启动菌体中相关基因的表达,调控细菌的某些生物行为。在大部分革兰氏阴性致病菌中,信号分子的积累可以启动下游致病因子的表达。从苏云金芽孢杆菌Bt.4Q7中克隆得到的aiiA基因编码的AiiA蛋白可以降解群体感应信号分子,从而使得致病菌的致病性降低或者消失。AiiA蛋白的活性越高,对致病菌致病性的抑制作用也就越明显。 本文通过PCR扩增,得到了aiiA4Q7、aiiA8010、aiiAWB4、aiiAWB12、aiiAT-HW3、aiiA6A3共6个aiiA同源基因;运用DNA shuffling分子进化技术,通过一步DNaseⅠ(Rnase Free)随机酶切、三轮无引物PCR、一轮有引物PCR过程,成功构建了aiiA基因突变库;以紫色色杆菌突变株CV026为报告菌,从中筛选得到了S29、S47、S21、S4、S36、S52、S7、S14、S63共9株具有较高AiiA蛋白酶活的突变株,并进一步得到了进化后的aiiAS29、aiiAS47、aiiAS21、aiiAS4、aiiAS36、aiiAS52、aiiAS7、aiiAS14、aiiAS63基因;aiiAS29和aiiAS36基因的测序结果完全相同,其余aiiA基因序列各不相同。制备了AiiAT-HW3、AiiA4Q7、AiiA8010、AiiAWB4/WB12、AiiAS29/S36、AiiAS47/S52、AiiAS21、AiiAS4、AiiAS7、AiiAS63共10个AiiA蛋白样品,通过测定各AiiA蛋白样品之间的相对酶活,得到了具有高酶活性的AiiA蛋白即AiiAs29／s36,其进化后的酶活性比原始AiiA4Q7提高了2.2倍,成功实现了对群体感应信号分子降解酶AiiA的分子进化。