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牛acox1基因过表达载体构建及对脂肪沉积的初步研究

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中国畜牧杂志 2017年第11期53卷 42-47页

作者：张凤曾倩晖陶虎熊琪张年刘洋蒋思文陈明新湖北省农业科学院畜牧兽医研究所/动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室湖北武汉430064 华中农业大学动物科技学院湖北武汉430070

实验旨在阐明牛酰基辅酶A氧化酶1(Acyl-Co A Oxidase 1,acox1)在肌内脂肪沉积过程中的作用,为优质肉牛品种培育提供理论依据。首先扩增牛acox1基因的CDS序列,构建acox1基因的过表达载体,然后将过表达载体转染3T3-L1细胞,利用油红O染色... 详细信息

实验旨在阐明牛酰基辅酶A氧化酶1(Acyl-Co A Oxidase 1,acox1)在肌内脂肪沉积过程中的作用,为优质肉牛品种培育提供理论依据。首先扩增牛acox1基因的CDS序列,构建acox1基因的过表达载体,然后将过表达载体转染3T3-L1细胞,利用油红O染色技术检测脂滴沉积情况,利用荧光定量PCR、Western blotting技术检测成脂分化基因PPARγ及C/EBPα的表达量。BLAST分析及酶切鉴定结果显示,成功构建了牛acox1基因的过表达载体;油红O结果表明,过表达acox1基因抑制了3T3-L1细胞的脂滴沉积;荧光定量PCR及Western blotting结果表明,过表达acox1基因显著性抑制了C/EBPα的表达量而对PPARγ的表达量无显著性影响。本研究结果显示,acox1可能抑制肌内脂肪沉积。

关键词：牛 acox1 过表达脂肪沉积

PPARα及acox1在酒精性脂肪肝中的表达

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华中科技大学学报（医学版） 2016年第3期45卷 288-291页

作者：仝巧云葛存锦郑世华三峡大学消化疾病研究所宜昌市中心人民医院消化内科宜昌443003

目的通过测定酒精性脂肪肝大鼠血清TNF-α、肝内甘油三酯、PPARαmRNA及acox1mRNA含量、肝内PPARα蛋白含量,并通过PPARα激动剂苯扎贝特(Bezafibrate)的干预研究,探讨酒精性脂肪肝大鼠肝内甘油三酯沉积的分子生物学机制及酒精性脂肪肝... 详细信息

目的通过测定酒精性脂肪肝大鼠血清TNF-α、肝内甘油三酯、PPARαmRNA及acox1mRNA含量、肝内PPARα蛋白含量,并通过PPARα激动剂苯扎贝特(Bezafibrate)的干预研究,探讨酒精性脂肪肝大鼠肝内甘油三酯沉积的分子生物学机制及酒精性脂肪肝的发病机制。方法将60只Wistar大鼠随机分为正常对照组(n=20)、酒精性脂肪肝组(n=20)及苯扎贝特组(n=20)。正常对照组予蒸馏水灌胃8周;酒精性脂肪肝组给予鱼油2.5mL/kg+乙醇灌胃8周;苯扎贝特组采用鱼油+乙醇灌胃,4周后加用苯扎贝特100mg/kg灌胃治疗4周。第8周取腹腔静脉血及肝组织,采用ELISA法测定血清TNF-α含量;比色法测定肝脏甘油三酯沉积;RT-PCR法测定肝内PPARαmRNA及acox1mRNA含量;Western blot法测定肝内PPARα蛋白含量。结果与正常对照组相比,酒精性脂肪肝组大鼠血清内TNF-α含量升高[(3.01±0.31)ng/mL vs.(1.07±0.28)ng/mL,P1],肝内甘油三酯沉积增多[(0.72±0.09)mmol/L vs.(0.28±0.07)mmol/L,P1],肝内PPARαmRNA[(0.22±0.08)vs.(0.68±0.13),P1]及acox1 mRNA[(0.43±0.12)vs.(1.14±0.21),P1]表达减少,PPARα蛋白含量减少[(0.19±0.07)vs.(0.48±0.11),P1]。经苯扎贝特治疗后,苯扎贝特组大鼠血清内TNF-α含量降低,肝内甘油三酯沉积减少,肝内PPARαmRNA及acox1mRNA表达增多,PPARα蛋白含量增多。结论酒精性脂肪肝大鼠肝内PPARα及acox1表达减少,从而影响脂肪酸的代谢,导致肝内甘油三酯沉积增多,血清内TNF-α含量升高,引起酒精性脂肪肝。苯扎贝特可通过激活PPARα,使肝内PPARα及acox1表达增加,促进脂肪酸的代谢,减少肝内甘油三酯沉积,降低血清内TNF-α含量,起到预防和治疗酒精性脂肪肝的作用。

关键词：酒精性脂肪肝甘油三酯 PPARα acox1 苯扎贝特

Exploiting fly models to investigate rare human neurological disorders

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Neural Regeneration Research 2025年第1期20卷 21-28页

作者： Tomomi Tanaka Hyung-Lok Chung Department of Neurology Houston Methodist Research InstituteHoustonTXUSA Department of Neurology Weill Cornell Medical CollegeNew YorkNYUSA

Rare neurological diseases,while individually are rare,collectively impact millions globally,leading to diverse and often severe neurological *** attributed to genetic mutations that disrupt protein function or structure,understanding their genetic basis is crucial for accurate diagnosis and targeted *** investigate the underlying pathogenesis of these conditions,researchers often use non-mammalian model organisms,such as Drosophila(fruit flies),which is valued for their genetic manipulability,cost-efficiency,and preservation of genes and biological functions across evolutionary *** tools available in Drosophila,including CRISPR-Cas9,offer a means to manipulate gene expression,allowing for a deep exploration of the genetic underpinnings of rare neurological *** boasts a versatile genetic toolkit,rapid generation turnover,and ease of large-scale experimentation,making it an invaluable resource for identifying potential drug *** can expose flies carrying disease-associated mutations to various compounds,rapidly pinpointing promising therapeutic agents for further investigation in mammalian models and,ultimately,clinical *** this comprehensive review,we explore rare neurological diseases where fly research has significantly contributed to our understanding of their genetic basis,pathophysiology,and potential therapeutic *** discuss rare diseases associated with both neuron-expressed and glial-expressed *** cases include mutations in CDK19 resulting in epilepsy and developmental delay,mutations in TIAM1 leading to a neurodevelopmental disorder with seizures and language delay,and mutations in IRF2BPL causing seizures,a neurodevelopmental disorder with regression,loss of speech,and abnormal *** we explore mutations in EMC1 related to cerebellar atrophy,visual impairment,psychomotor retardation,and gain-of-function mutations in acox1 causing Mitchell ***-of-fun

关键词： acox1 Drosophila melanogaster glia lipid metabolism model organisms neuroinflammation neurologic disorders neuron rare disease VLCFA

冷诱导下O-GlcNAc糖基化修饰调控小鼠肝脏脂质代谢的机制

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冷诱导下O-GlcNAc糖基化修饰调控小鼠肝脏脂质代谢的机制

作者：周万慧黑龙江八一农垦大学

学位级别：硕士

因寒冷造成动物机体产生的冷应激严重制约了我国畜牧养殖业的发展。冷应激下,机体加速能量代谢,以抵抗冷应激所造成的能量缺失。肝脏作为脂质代谢的关键枢纽,参与冷应激下的全身能量供给。O-GlcNAc糖基化修饰是仅由O-GlcNAc糖基转移酶(O... 详细信息

因寒冷造成动物机体产生的冷应激严重制约了我国畜牧养殖业的发展。冷应激下,机体加速能量代谢,以抵抗冷应激所造成的能量缺失。肝脏作为脂质代谢的关键枢纽,参与冷应激下的全身能量供给。O-GlcNAc糖基化修饰是仅由O-GlcNAc糖基转移酶(O-GlcNActransferase,OGT)以及N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(O-GlcNAcase,OGA)一对拮抗酶介导的蛋白翻译后修饰(post-translation modifications,PTMs)。作为机体的“应激感受器”和“营养感受器”,O-GlcNAc糖基化修饰能够对细胞内的信号实现高度动态的调控。那么,O-GlcNAc糖基化修饰是否参与冷诱导下肝脏的脂质代谢。其对肝脏脂质代谢的调控机制又是如何呢?因此,本研究旨在探究冷诱导下O-GlcNAc糖基化修饰在肝脏脂质代谢的作用及其调控机制,为冷诱导下机体肝脏脂质代谢的调控提供一定的参考。本试验首先对肝脏Ogt特异性敲除小鼠(Ogt-LKO,KO)与同窝野生型对照小鼠(Wild Type,WT)进行代谢笼试验,结果发现KO小鼠白天呼吸熵显著低于WT小鼠(P1)。脂质消耗会使机体呼吸熵水平下降,表明OGT可能通过肝脏脂质消耗影响能量代谢水平。为进一步确定冷诱导下O-GlcNAc糖基化修饰对肝脏脂质代谢的影响,每天给予小鼠4℃,连续3 h的慢性冷暴露,持续时间为21 d。慢性冷暴露期间检测小鼠采食量及增重,慢性冷暴露结束后采集小鼠血液及肝脏组织;提取血清检测生化相关指标;苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining,HE)、马松(MASSON)、碘酸雪夫(periodic acid schiff,PAS)、油红O染色观察肝组织形态、肝糖原以及脂质含量;Western blot检测O-GlcNAc糖基化修饰,脂质合成以及脂质分解相关蛋白水平;qRT-PCR检测脂质合成及脂质分解基因表达水平。结果显示KO小鼠较WT小鼠相比,摄食及增重显著增加(P1)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)(P1)显著升高。肝脏呈现轻微纤维化。肝糖原含量显著增加(P1),肝组织内脂质沉积显著增加(P1)。O-GlcNAc糖基化修饰相关蛋白OGT,OGA,O-GlcNAc表达水平显著降低(P1(acetyl-CoA carboxlyasel,ACC1),固醇调节元件结合蛋白 1(sterol regulatory element binding protein 1,SREBP1)表达水平显著升高(P1),脂质分解相关蛋白肉碱酰转移酶1(carnitine palmitoyltransferasel,CPT1),酰基辅酶 A 氧化酶 1(acyl-CoA oxidasel,acox1),氧化物酶体增值受体 α(peroxisome proliferator activates receptor α,PPARα)表达水平显著下降(P1),说明肝脏Ogt基因特异性敲除促进肝内脂质合成,抑制脂质分解。同时肝脏发生损伤、纤维化;慢性冷暴露下WT小鼠摄食增加(P1)。肝脏发生空泡样变以及轻微纤维化。肝糖原含量显著减少(P1),肝内脂质含量无显著变化。O-GlcNAc糖基化修饰相关蛋白表达水平升高(P1),AST升高更加明显(P1)。肝组织损伤以及纤维化程度进一步加重,肝糖原含量(P1),肝组织脂质沉积(Pacox1的O-GlcNAc糖基化修饰升高,说明冷诱导下acox1的O-GlcNAc糖基化修饰对肝脏脂质分解进行调控。为进一步探究acox1的O-GlcNAc糖基化修饰对脂质分解的调控机制,体外使用AML-12肝细胞构建肝细胞高脂模型,筛选OGT抑制剂四氧嘧啶(Al

关键词：慢性冷暴露 O-GlcNAc糖基化修饰 acox1 脂质代谢

丹叶大黄素对非酒精性脂肪肝的药理作用及机制研究

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丹叶大黄素对非酒精性脂肪肝的药理作用及机制研究

作者：柯辛格湖北中医药大学

学位级别：硕士

目的:探究丹叶大黄素对非酒精性脂肪肝（Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）的药理作用及作用机制,为其开发应用提供科学依据。方法:建立高脂饮食诱导的C57BL/6小鼠NAFLD模型,灌胃给予不同浓度的丹叶大黄素,考察其在体内的作用... 详细信息

目的:探究丹叶大黄素对非酒精性脂肪肝（Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）的药理作用及作用机制,为其开发应用提供科学依据。方法:建立高脂饮食诱导的C57BL/6小鼠NAFLD模型,灌胃给予不同浓度的丹叶大黄素,考察其在体内的作用。观察丹叶大黄素对小鼠肝脏外观、脏器系数的影响;苏木精-伊红（Hematoxylin-eosin staining,H＆E）染色和油红O染色判断肝脏组织的病理生理结构变化。采用MTT法检测丹叶大黄素和游离脂肪酸（Free fatty acids,FFA）对L-02细胞活力的影响,筛选有效的给药浓度和造模浓度;以优选的FFA浓度建立脂肪变性L-02细胞模型。生化试剂盒检测小鼠血清和L-02细胞上清液中ALT和AST的含量,小鼠肝组织和L-02细胞中脂质、氧化应激相关酶和产物的含量;免疫组化染色检测小鼠肝脏中的ROS,流式细胞术测定L-02细胞内ROS水平;酶联免疫吸附测定法（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）测定小鼠血清和L-02细胞中炎症因子及乙酰辅酶A（Acetyl-Co A,A-Co A）的含量。并设置3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine,3-MA）给药组,考察丹叶大黄素对细胞自噬的影响;Western blot检测给药后细胞内中acox1、Atg5、p-m TOR和p-ULK1蛋白的表达。结果:与Control组相比,HFD组小鼠肝脏脏器系数显著升高（P＜0.01）,肝脏肿大,颜色加深,切面有油腻感,谷丙氨酸转氨酶（Alanine aminotransferase,ALT）和谷草氨酸转氨酶（Aspartate aminotransferase,AST）水平均显著升高（P＜0.01）;丹叶大黄素各剂量处理组小鼠的肝组织细胞结构趋于正常,肝组织中脂质积累显著减少,肝脏脏器系数显著降低（P＜0.05）,小鼠血清中ALT和AST水平显著降低（P＜0.05或P＜0.01）;与Control组相比,HFD组小鼠肝脏ROS水平显著上升（P＜0.01）,肝组织中抗氧化酶谷胱甘肽（Glutathione,GSH）和超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）水平明显降低（P＜0.05）,氧化应激副产物丙二醛（Malondialdehyde,MDA）含量有所增加（P＜0.05）;丹叶大黄素各剂量组的ROS水平明显下降（P＜0.01）,丹叶大黄素治疗组呈现剂量依赖性的升高了肝组织中抗氧化酶SOD和GSH的水平（P＜0.05或P＜0.01）,并且降低了MDA水平（P＜0.01）;与Control组相比,HFD组血清中的白介素-6（Interleukin-6,IL-6）和肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）含量显著升高（P＜0.01）;丹叶大黄素治疗组IL-6和TNF-α水平显著降低（P＜0.05或P＜0.01）。细胞试验:MTT结果显示,当丹叶大黄素浓度在100μM以内时,对L-02细胞活性无明显影响;当FFA浓度在0.3 m M以内时对L-02细胞活性无明显影响。油红O染色结果表明,0.3 m M FFA造模24h可以使L-02细胞积累大量脂肪滴,该浓度为细胞模型最佳造模条件。与Control组相比,Model组细胞中总胆固醇（Total cholesterol,TC）和甘油三脂（Triglyceride,TG）含量显著升高（P＜0.05）;丹叶大黄素给药后显著降低了细胞中TC和TG含量含量（P＜0.05）;与Control组相比,Model组细胞中ALT和AST含量显著升高（P＜0.01）,丹叶大黄素给药后细胞上清液中ALT和AST含量显著减少（P＜0.05）。与Control组相比,Model组细胞ROS水平显著提高（P＜0.01）,细胞中抗氧化酶GSH和SOD含量显著下降（P＜0.05或者P＜0.01）,细胞中MDA含量显著升高（P＜0.01）;丹叶大黄素治疗后显著降低了细胞中ROS水平（P＜0.01）,同时增加了细胞中GSH和SOD含量（P＜0.05）,并显著降低了细胞中MDA含量（P＜0.01）;与Control组相比,Model组细胞中IL-6、TNF-α和A-Co A含量显著升高（P＜0.01或P＜0.001）;丹叶大黄素治疗后可以降低细胞中IL-6、TNF-α和A-Co A含量（P＜0.01或P＜0.001）。然而自噬抑制剂3-MA的加入,逆转丹叶大黄素在体内外治疗作用。Western blot结果显示,与Control组相比,Model组L-02细胞内acox1、p-MTOR和p-ULK1蛋白表达显著升高（P＜0.01）,Model组L-02细

关键词：华北大黄丹叶大黄素 NAFLD 自噬 acox1

YTHDF1延缓代谢功能障碍相关脂肪性肝病进展的机制研究

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YTHDF1延缓代谢功能障碍相关脂肪性肝病进展的机制研究

作者：谭坚中国人民解放军海军军医大学

学位级别：硕士

研究背景和目的:代谢功能障碍相关脂肪性肝病(Metabolic dysfunction associated steatotic liver disease,MASLD)已成为肝癌最常见的基础疾病之一,近年来,MASLD发病率呈逐年增长趋势,未来MASLD将导致沉重的医疗负担。但由于缺乏对MASL... 详细信息

研究背景和目的:代谢功能障碍相关脂肪性肝病(Metabolic dysfunction associated steatotic liver disease,MASLD)已成为肝癌最常见的基础疾病之一,近年来,MASLD发病率呈逐年增长趋势,未来MASLD将导致沉重的医疗负担。但由于缺乏对MASLD致病机制的了解,目前FDA批准用于治疗MASLD的特效药物仅有resmetirom。此前很多研究发现在MASLD进展过程中,一些与脂质代谢、炎症进展密切相关的基因m6A修饰(N6-methyladenosine,m6A)水平发生异常变化,进而影响MASLD进程。在前期的研究中,我们发现m6A修饰识别蛋白YTHDF1(YTH domain-containing family protein 1,YTHDF1)蛋白在MASLD小鼠肝脏中上调,但其m RNA并没有明显变化,目前并未有研究阐明YTHDF1在MASLD进程过程中的作用机制及其临床意义。本研究拟对MASLD进展过程中YTHDF1相关的主要分子事件进行研究,揭示YTHDF1在MASLD进展过程中的调控机制,探索靶向YTHDF1及其相关信号途径从而阻遏MASLD进展的可能性及有效性,进而为MASLD及其相关肝癌的早期干预和治疗提供新思路、新方法。研究方法:1.通过高脂饮食构建MASLD动物模型,通过油酸棕榈酸刺激构建MASLD体外细胞系模型。运用免疫组化、Western Blot等方式检测MASLD体外细胞系模型、MASLD动物模型肝组织、人脂变性肝组织中YTHDF1蛋白表达情况。运用实时荧光定量PCR检测YTHDF1 m RNA的表达情况。2.构建Ythdf1肝细胞特异性敲除小鼠和YTHDF1干扰细胞系,利用HE、油红O染色及生化指标检测等方式比较MASLD表型。3.利用转录组学及蛋白质组学分析等方法靶定Ythdf1的敲除促进MASLD病程进展的分子通路,利用组织免疫荧光及透射电镜验证该通路。4.利用蛋白质谱、RNA免疫共沉淀、RNA原位杂交等方法探究YTHDF1影响过氧化物酶体功能的作用机制。*** Blot验证YTHDF1蛋白甲基化修饰,并通过转染YTHDF1甲基化位点突变型质粒验证甲基化修饰对YTHDF1蛋白稳定性的影响。研究结果:***1蛋白在MASLD体外细胞系模型、MASLD动物模型肝组织、人脂变性肝组织中上调,而YTHDF1 m RNA并没有明显变化。***1敲除或干扰后,MASLD表型指标如小鼠体重增长、肝脏脂肪变性、肝脏损伤、以及细胞氧化应激水平等较为严重。3.转录组学及蛋白质组学分析提示小鼠肝细胞Ythdf1特异性敲除可能通过激活过氧化物酶体功能促进饮食诱导的MASLD病程进展。4.过氧化物酶体关键功能基因acox1蛋白在高脂饲料喂养的基因敲除小鼠肝脏组织及油酸棕榈酸刺激的YTHDF1干扰细胞系中上调表达,而未经高脂饲料或油酸棕榈酸等应激条件刺激,YTHDF1低表达不影响acox1表达。5.蛋白质谱分析发现YTHDF1可能与29个应激颗粒成分蛋白存在相互作用,且RNA原位杂交结果发现,在干扰YTHDF1之后,acox1 m RNA在应激颗粒中扣押减少。6.蛋白质谱结果显示YTHDF1肽段上K191位点存在甲基化修饰,在甲基化位点突变后,YTHDF1蛋白稳定性增强。研究结论:YTHDF1蛋白在MASLD肝组织中上调,但m RNA没有明显差异。蛋白水平上调的YTHDF1通过抑制过氧化物酶体功能延缓MASLD病程进展,另外,YTHDF1上调表达促进应激颗粒的形成扣押acox1 m RNA减少acox1翻译,从而抑制过氧化物酶体功能。本研究还发现YTHDF1蛋白的甲基化修饰将影响自身的稳定性。总之,本研究在一定程度上阐明了YTHDF1在MASLD病程进展过程中的作用机制,为靶向YTHDF1及其相关信号途径研发治疗药物及优化MASLD临床治疗决策提供了一定的理论支撑。

关键词：代谢功能障碍相关脂肪性肝病 YTHDF1 过氧化物酶体 acox1 应激颗粒

P53通过VDR促进过氧化物酶体脂肪酸β氧化而抑制结直肠癌发生的分子机制研究

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P53通过VDR促进过氧化物酶体脂肪酸β氧化而抑制结直肠癌发生的分...

作者：李旭武汉大学

学位级别：硕士

结直肠癌(Colorectal Cancer,CRC)是一种世界上发病率和死亡率在各种癌症排名都非常靠前的恶性消化道肿瘤,严重威胁当今人类生命健康、影响病人生活质量。然而,目前尚没有完全有效的治疗方法能完全治愈结直肠癌。因此,将结直肠癌发病机... 详细信息

结直肠癌(Colorectal Cancer,CRC)是一种世界上发病率和死亡率在各种癌症排名都非常靠前的恶性消化道肿瘤,严重威胁当今人类生命健康、影响病人生活质量。然而,目前尚没有完全有效的治疗方法能完全治愈结直肠癌。因此,将结直肠癌发病机制研究透彻,并针对其机制开发出有效的治疗方法是当前的重要任务,也是急需解决的问题。P53肿瘤抑制因子是细胞中一种重要的调节转录因子,也是细胞内重要应激感受器,能够调控诸如细胞周期、凋亡、新陈代谢以及机体免疫反应多种细胞生命活动,且其在肿瘤组织易发生突变。因为P53的重要性以及其易突变的特质,P53成为当今研究的热点。脂肪酸β氧化是细胞内脂肪酸代谢的重要过程,为细胞的必要的脂类物质,同时也能产生大量ATP供细胞生命活动所用。本研究首先将TCGA数据库结直肠癌病例数据分为P53野生型组以及P53突变型组,将细胞代谢过程中的114个代谢限速酶在两组中进行富集分析,并分析这些限速酶在结直肠癌中的表达差异倍数以及P值,找到5个在P53野生型组和P53突变型组中表达有显著差异的基因acox1、HK2、UGDH、HMGCS2和MYLK。通过泛癌分析找到在多种癌症中显著低表达,且影响癌症病人生存风险的过氧化物酶体脂肪酸β氧化通路限速酶acox1。另外,在GEO数据库和HPA以及CTPAC蛋白质数据库,分析了acox1在结直肠癌组织中的表达量以及蛋白含量,同时分析了TCGA数据库结直肠癌病例的生存率,结果显示acox1在肿瘤组织中表达量以及蛋白质水平都显著降低。我们的研究还发现,除了acox1之外,过氧化物酶体脂肪酸β氧化代谢通路相关酶ABCD3、ABCD4、EHHADH的表达也受到P53的调控。通过相关性分析发现P53与这四个基因并无显著相关性。因此我们对已知的转录因子与acox1、ABCD3、ABCD4和EHHADH进行相关性分析,通过重叠比对,找到与这四个基因启动子区域都能结合的转录因子VDR。通过Co-IP实验,结果证明VDR通过P53的CTD结构域招募P53,共同调控过氧化物酶体脂肪酸β氧化代谢通路相关酶基因的表达。此外,MTT实验表明,在肠癌细胞系(HCT116和RKO)过表达过氧化物酶体脂肪酸β氧化基因(acox1、ABCD3、ABCD4和EHHADH)显著抑制了肿瘤的生长。总之,我们的研究表明VDR能够招募P53促进过氧化物酶体脂肪酸β氧化基因(acox1、ABCD3、ABCD4和EHHADH)的表达,促进脂肪酸β氧化,抑制结直肠癌发生。生物信息学分析也发现,在结直肠癌发生过程中这些基因表达显著低表达,暗示了氧化物酶体脂肪酸β氧化对结直肠癌发生的抑制作用。这些研究可能为结直肠癌提供潜在的治疗靶点。

关键词： P53 VDR acox1 结直肠癌过氧化物酶体脂肪酸β氧化

糖尿病合并梅毒兔肾组织脂肪沉积机制初步探讨

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糖尿病合并梅毒兔肾组织脂肪沉积机制初步探讨

作者：曾丹南华大学

学位级别：硕士

目的:通过基因芯片筛选糖尿病合并梅毒兔肾组织脂肪代谢异常基因,检测候选异常基因在肾组织中表达情况及病理病变,初步探讨糖尿病合并梅毒兔肾组织脂肪沉积机制。方法:1、动物分组及建模:随机分组,小剂量四氧嘧啶诱导糖尿病兔模型,梅毒... 详细信息

目的:通过基因芯片筛选糖尿病合并梅毒兔肾组织脂肪代谢异常基因,检测候选异常基因在肾组织中表达情况及病理病变,初步探讨糖尿病合并梅毒兔肾组织脂肪沉积机制。方法:1、动物分组及建模:随机分组,小剂量四氧嘧啶诱导糖尿病兔模型,梅毒螺旋体睾丸接种构建梅毒兔模型,四氧嘧啶构建糖尿病模型后接种梅毒螺旋体构建糖尿病合并梅毒兔模型。建模之后每周通过抽取耳缘静脉检测尿素氮(urea nitrogen,BUN)与肌酐(creatinine,Cr)的变化了解各组兔之间是否有肾功能的损伤及区别。2、HE染色:常规取材固定,脱水透明,浸蜡包埋,切片烤片,脱蜡水化,苏木精浸染,盐酸酒精分化,弱氨水返蓝,乙醇及二甲苯脱水,中性树胶封片,了解各组实验兔的肾组织的病理病变情况。3、油红O染色:兔肾组织置于福尔马林中固定冰冻切片,异丙醇30秒,浸入油红O稀释液染色后蒸馏水速洗,苏木素染色后,普通水洗,甘油明胶封片。4、基因芯片:对各组兔的肾组织进行基因芯片筛选,了解脂肪代谢基因在各组兔之间的表达状况,选出脂肪代谢有显著差异的基因。5、实时定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-PCR):每只兔肾组织进行RNA抽提、两相分离、RNA沉淀,使用样品的RNA进行cDNA合成,利用合成的cDNA再进行RT-PCR,计算出候选基因在各组兔肾组织中表达的相对含量。6、WB检测:提取总蛋白,测定浓度,上样跑胶,蛋白转印至PVDF膜,脱脂牛奶封闭,孵一抗过夜,TBST溶液漂洗后孵二抗,再次TBST溶液漂洗后曝光显影。了解肾组织细胞中候选基因的蛋白水平的表达情况。7、免疫组化:切片、烤片后脱蜡及水化,3%HO去离子水孵育后PBS冲洗,滴加一抗过夜后PBS冲洗,滴加聚合物增强剂孵育后PBS冲洗,滴加二抗孵育后PBS冲洗,显色后用水洗、然后复染、脱水、透明、最后封片。免疫组化可直观了解在各组兔之间组织中筛选基因表达部位及区别。结果:1、糖尿病组(DM组)兔模型成功6只;梅毒组(TP组)兔模型成功7只,梅毒合并梅毒组(H组)兔模型成功5只,正常对照组(C组)存活5只。随着疾病的发展,各实验组均发生肾功能损害且呈越来越重的趋势,而H组与其它组同期相比肾损害则更明显。2、HE染色显示:C组兔未见明显异常改变,和实验组兔肾小球均可见明显肾小球毛细血管扩张,近曲小管肿胀,DM组兔肾髓质区、集合管内见蛋白管型、间质粘液样变、水泡样变。H组肾小球毛细血管扩张,近曲小管肿胀更为严重,肾组织内还出现了明显的钙盐沉积。3、油红O染色显示:H、DM组肾组织可见明显脂滴沉积,H组相对DM组更密集,TP组肾组织可见少量脂滴沉积,C组偶见脂滴存在。4、基因芯片结果显示:acox1基因、ACADM基因、SCP2基因在各组实验兔具有显著差异,与正常组相比,这3个基因在TP、DM、H组表达均下调,在TP组少量下调,DM组下调明显,H组下调最低。5、acox1、ACADM、SCP2基因RT-PCR结果显示:这3个基因表达趋势在各组兔之间的表达变化趋势一致,与正常组相比,这3个基因在TP、DM、H组表达均下调,在DM、H组比TP组表达量低,DM组则更低,H组表达最低(3个基因在各组实验兔之间任意两组比较其差异均具有统计学意义),其结果趋势与基因芯片结果相符。6、WB检测:acox1、ACADM、SCP2条带趋势与RT-PCR结果相符。7、免疫组化结果显示:与C组相比,TP组、DM组、H组的阳性细胞有明显减少的现象;TP组比C组阳性细胞少,却比DM组、H组的阳性细胞多;其次为DM组的阳性细胞更少;H组则只有少量的表达,阳性细胞与其他组相比表达量最少。结论:1、糖尿病合并梅毒组与单纯疾病组相比,其肾损伤明显更严重。2、糖尿病合并梅毒组与单纯疾病组相比,脂肪沉积更加严重,肾损伤可能与脂肪沉积有关。3、糖尿病合并梅毒组脂肪沉积可能与acox1、ACADM、SCP2表达下调有关。

关键词：糖尿病合并梅毒脂肪沉积 ACADM SCP2 acox1