糖尿病合并梅毒兔肾组织脂肪沉积机制初步探讨

作     者：曾丹 

作者单位：南华大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘双全

授予年度：2017年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100210[医学-外科学(含：普外、骨外、泌尿外、胸心外、神外、整形、烧伤、野战外)] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 100206[医学-皮肤病与性病学] 10[医学] 

主      题：糖尿病合并梅毒 脂肪沉积 ACADM SCP2 ACOX1 

摘      要：目的:通过基因芯片筛选糖尿病合并梅毒兔肾组织脂肪代谢异常基因,检测候选异常基因在肾组织中表达情况及病理病变,初步探讨糖尿病合并梅毒兔肾组织脂肪沉积机制。方法:1、动物分组及建模:随机分组,小剂量四氧嘧啶诱导糖尿病兔模型,梅毒螺旋体睾丸接种构建梅毒兔模型,四氧嘧啶构建糖尿病模型后接种梅毒螺旋体构建糖尿病合并梅毒兔模型。建模之后每周通过抽取耳缘静脉检测尿素氮(urea nitrogen,BUN)与肌酐(creatinine,Cr)的变化了解各组兔之间是否有肾功能的损伤及区别。2、HE染色:常规取材固定,脱水透明,浸蜡包埋,切片烤片,脱蜡水化,苏木精浸染,盐酸酒精分化,弱氨水返蓝,乙醇及二甲苯脱水,中性树胶封片,了解各组实验兔的肾组织的病理病变情况。3、油红O染色:兔肾组织置于福尔马林中固定冰冻切片,异丙醇30秒,浸入油红O稀释液染色后蒸馏水速洗,苏木素染色后,普通水洗,甘油明胶封片。4、基因芯片:对各组兔的肾组织进行基因芯片筛选,了解脂肪代谢基因在各组兔之间的表达状况,选出脂肪代谢有显著差异的基因。5、实时定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-PCR):每只兔肾组织进行RNA抽提、两相分离、RNA沉淀,使用样品的RNA进行cDNA合成,利用合成的cDNA再进行RT-PCR,计算出候选基因在各组兔肾组织中表达的相对含量。6、WB检测:提取总蛋白,测定浓度,上样跑胶,蛋白转印至PVDF膜,脱脂牛奶封闭,孵一抗过夜,TBST溶液漂洗后孵二抗,再次TBST溶液漂洗后曝光显影。了解肾组织细胞中候选基因的蛋白水平的表达情况。7、免疫组化:切片、烤片后脱蜡及水化,3%HO去离子水孵育后PBS冲洗,滴加一抗过夜后PBS冲洗,滴加聚合物增强剂孵育后PBS冲洗,滴加二抗孵育后PBS冲洗,显色后用水洗、然后复染、脱水、透明、最后封片。免疫组化可直观了解在各组兔之间组织中筛选基因表达部位及区别。结果:1、糖尿病组(DM组)兔模型成功6只;梅毒组(TP组)兔模型成功7只,梅毒合并梅毒组(H组)兔模型成功5只,正常对照组(C组)存活5只。随着疾病的发展,各实验组均发生肾功能损害且呈越来越重的趋势,而H组与其它组同期相比肾损害则更明显。2、HE染色显示:C组兔未见明显异常改变,和实验组兔肾小球均可见明显肾小球毛细血管扩张,近曲小管肿胀,DM组兔肾髓质区、集合管内见蛋白管型、间质粘液样变、水泡样变。H组肾小球毛细血管扩张,近曲小管肿胀更为严重,肾组织内还出现了明显的钙盐沉积。3、油红O染色显示:H、DM组肾组织可见明显脂滴沉积,H组相对DM组更密集,TP组肾组织可见少量脂滴沉积,C组偶见脂滴存在。4、基因芯片结果显示:ACOX1基因、ACADM基因、SCP2基因在各组实验兔具有显著差异,与正常组相比,这3个基因在TP、DM、H组表达均下调,在TP组少量下调,DM组下调明显,H组下调最低。5、ACOX1、ACADM、SCP2基因RT-PCR结果显示:这3个基因表达趋势在各组兔之间的表达变化趋势一致,与正常组相比,这3个基因在TP、DM、H组表达均下调,在DM、H组比TP组表达量低,DM组则更低,H组表达最低(3个基因在各组实验兔之间任意两组比较其差异均具有统计学意义),其结果趋势与基因芯片结果相符。6、WB检测:ACOX1、ACADM、SCP2条带趋势与RT-PCR结果相符。7、免疫组化结果显示:与C组相比,TP组、DM组、H组的阳性细胞有明显减少的现象;TP组比C组阳性细胞少,却比DM组、H组的阳性细胞多;其次为DM组的阳性细胞更少;H组则只有少量的表达,阳性细胞与其他组相比表达量最少。结论:1、糖尿病合并梅毒组与单纯疾病组相比,其肾损伤明显更严重。2、糖尿病合并梅毒组与单纯疾病组相比,脂肪沉积更加严重,肾损伤可能与脂肪沉积有关。3、糖尿病合并梅毒组脂肪沉积可能与ACOX1、ACADM、SCP2表达下调有关。