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食品与发酵工业 2021年第12期47卷 1-9,I0001-I0003页

作者：李梦莹吕雪芹刘延峰李江华堵国成吴剑荣刘龙江南大学未来食品科学中心江苏无锡214122 糖化学与生物技术教育部重点实验室(江南大学) 江苏无锡214122

该研究主要通过多种代谢工程策略对大肠杆菌进行改造从而增强菌株L-组氨酸的合成。首先,用人工的开放阅读框(hisL′-λattB′-trpE)替换大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)BL21(DE3)L-组氨酸操纵子的前导区,同时表达来源于E.coli的atp... 详细信息

该研究主要通过多种代谢工程策略对大肠杆菌进行改造从而增强菌株L-组氨酸的合成。首先,用人工的开放阅读框(hisL′-λattB′-trpE)替换大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)BL21(DE3)L-组氨酸操纵子的前导区,同时表达来源于E.coli的ATP转磷酸核糖基酶突变体基因hisGE271K后,菌株L-组氨酸产量达到872.50 mg/L;其次,通过比较来自谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum,C.glutamicum)ATCC130132、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens,S.marcescens)ZJZ626和E.coli BL21(DE3)的11种hisG在不同抑制物浓度下的酶活力以及过表达11种hisG基因时L-组氨酸的产量,筛选出最优hisG基因,L-组氨酸产量提高至1480.42 mg/L;然后,通过CRISPR/Cas9技术将最优hisG整合至基因组;进一步比较不同来源的Prs对菌株L-组氨酸产量的影响,从中筛选出较优Prs进行基因组整合,结果显示,摇瓶发酵72 h后,菌株L-组氨酸产量提高至3898.06 mg/L,96 h时产量提高至5574.63 mg/L。该研究为将来L-组氨酸的工业化生产奠定了良好的基础。

关键词： L-组氨酸大肠杆菌 ATP转磷酸核糖基酶代谢工程反馈抑制

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代谢工程改造大肠杆菌合成L-组氨酸

代谢工程改造大肠杆菌合成L-组氨酸

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作者：李梦莹江南大学

学位级别：硕士

L-组氨酸(L-histidine)是构成人体蛋白质的20种氨基酸之一,为婴幼儿必需氨基酸,具有抗氧化、免疫调节和抗炎等多种生理功能,被广泛应用于食品和医药等行业。传统的蛋白水解法、化学合成法存在着原料不易得、设备损失率高及产生外消旋混... 详细信息

L-组氨酸(L-histidine)是构成人体蛋白质的20种氨基酸之一,为婴幼儿必需氨基酸,具有抗氧化、免疫调节和抗炎等多种生理功能,被广泛应用于食品和医药等行业。传统的蛋白水解法、化学合成法存在着原料不易得、设备损失率高及产生外消旋混合物的问题,因此微生物发酵法成为现如今L-组氨酸生产的主流方法,然而现有的研究大都通过诱变等非理性设计的方法筛选菌种,存在着很大的随机性与盲目性,因此本研究建立了一种理性改造大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)生产L-组氨酸的方法。首先,为了解除L-组氨酸对His LGDBHAFI操纵子的调控,克隆人工的开放阅读框(his L’-latt B’-trp E),再利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将其整合至基因组,分别替换E.coli MG1655和E.coli BL21(DE3)L-组氨酸操纵子的前导区,获得重组菌M1、B1,在M1、B1中同时表达来源于E.coli的ATP转磷酸核糖基酶突变体基因his G后,获得重组菌M4、B4,通过摇瓶发酵筛选出产量最高菌株B4,L-组氨酸产量达到0.87g/L,确定E.coli BL21(DE3)为本研究的出发菌株,并选择菌株B1为主要研究对象。其次,将来自E.coli BL21(DE3)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens,S.marcescens)ZJZ626以及谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum,C.glutamicum)ATCC130132的11种his G使用p ET28a质粒表达后,得到11种ATP转磷酸核糖基酶(his G)的粗酶液。然后测量粗酶液在不同浓度抑制物存在时的酶活,并比较在B1中过表达11种his G基因时L-组氨酸的产量,从而筛选出本研究中最优his G基因。最后,利用CRISPR/Cas9技术将最优his G整合至菌株B1的基因组,L-组氨酸产量提高至0.91 g/L。最后,进一步比较E.coli BL21(DE3)、S.marcescens ZJZ626来源的前体合成基因Prs对菌株L-组氨酸产量的影响,筛选出S.marcescens ZJZ626来源的Prs进行基因组整合,结果显示,摇瓶发酵72 h,菌株L-组氨酸产量达到3.90 g/L,发酵96 h时产量提高至5.57 g/L。

关键词： L-组氨酸大肠杆菌 ATP转磷酸核糖基酶代谢工程反馈抑制

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