代谢工程改造大肠杆菌合成L-组氨酸

作     者：李梦莹 

作者单位：江南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：吴剑荣

授予年度：2021年

学科分类：081703[工学-生物化工] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 

主      题：L-组氨酸 大肠杆菌 ATP转磷酸核糖基酶 代谢工程 反馈抑制 

摘      要：L-组氨酸(L-histidine)是构成人体蛋白质的20种氨基酸之一,为婴幼儿必需氨基酸,具有抗氧化、免疫调节和抗炎等多种生理功能,被广泛应用于食品和医药等行业。传统的蛋白水解法、化学合成法存在着原料不易得、设备损失率高及产生外消旋混合物的问题,因此微生物发酵法成为现如今L-组氨酸生产的主流方法,然而现有的研究大都通过诱变等非理性设计的方法筛选菌种,存在着很大的随机性与盲目性,因此本研究建立了一种理性改造大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)生产L-组氨酸的方法。首先,为了解除L-组氨酸对His LGDBHAFI操纵子的调控,克隆人工的开放阅读框(his L’-latt B’-trp E),再利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将其整合至基因组,分别替换E.coli MG1655和E.coli BL21(DE3)L-组氨酸操纵子的前导区,获得重组菌M1、B1,在M1、B1中同时表达来源于E.coli的ATP转磷酸核糖基酶突变体基因his G后,获得重组菌M4、B4,通过摇瓶发酵筛选出产量最高菌株B4,L-组氨酸产量达到0.87g/L,确定E.coli BL21(DE3)为本研究的出发菌株,并选择菌株B1为主要研究对象。其次,将来自E.coli BL21(DE3)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens,S.marcescens)ZJZ626以及谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum,C.glutamicum)ATCC130132的11种his G使用p ET28a质粒表达后,得到11种ATP转磷酸核糖基酶(his G)的粗酶液。然后测量粗酶液在不同浓度抑制物存在时的酶活,并比较在B1中过表达11种his G基因时L-组氨酸的产量,从而筛选出本研究中最优his G基因。最后,利用CRISPR/Cas9技术将最优his G整合至菌株B1的基因组,L-组氨酸产量提高至0.91 g/L。最后,进一步比较E.coli BL21(DE3)、S.marcescens ZJZ626来源的前体合成基因Prs对菌株L-组氨酸产量的影响,筛选出S.marcescens ZJZ626来源的Prs进行基因组整合,结果显示,摇瓶发酵72 h,菌株L-组氨酸产量达到3.90 g/L,发酵96 h时产量提高至5.57 g/L。