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急性髓系白血病患者的基因突变和自噬基因表达研究及其临床意义

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急性髓系白血病患者的基因突变和自噬基因表达研究及其临床意义

作者：连芸南京医科大学

学位级别：硕士

目的:急性髓系白血病(AML)是老年急性白血病的常见类型,但老年患者化疗耐受性差,治疗效果亦差,合并基础疾病等影响其疗效及长期生存。本文探讨老年AML患者基因突变发生率和其临床意义。方法:采用二代测序方法检测111例初诊老年AML患者2... 详细信息

目的:急性髓系白血病(AML)是老年急性白血病的常见类型,但老年患者化疗耐受性差,治疗效果亦差,合并基础疾病等影响其疗效及长期生存。本文探讨老年AML患者基因突变发生率和其临床意义。方法:采用二代测序方法检测111例初诊老年AML患者21种基因突变情况,包括TET2,DNMT3A,NPM1,CEBPα,EZH2,JAK2,U2AF1,RUNX1,NRAS,TP53,IDH2,C-KIT,SRSF2,SF3B1,ASXL1,FLT3-ITD,ETV6,PHF6,CBL,SETBP1,ZRSR2。所有患者均接受地西他滨联合减低剂量CAG方案(DCAG)诱导治疗,结合患者临床信息,分析突变发生率及临床意义。结果:老年AML患者中位年龄67岁,男女比1.4:1,WHO白血病分型以AML伴骨髓增生异常相关改变类型和非特殊类型居多,中危核型、危险度中高危居多。老年AML患者基因总突变率高达99.1%(110/111例)。其中NRAS突变易出现在小于70岁组间(P=0.03)。DNMT3A突变(P=0.037),RUNX1突变(P=0.014),TP53突变(P5),FLT3-ITD突变(P=0.014)易出现在初诊时白细胞数超过100×10/L群体。TP53突变与高危染色体核型高度相关(P53突变,ETV6突变,FLT3-ITD突变,染色体高危核型,合并症数>1,基因突变数5-7个与短OS和DFS相关;而SRSF2突变与长OS和DFS相关;DCAG首次诱导CR与长OS相关(均P5)。ETV6突变(P=0.020),SRSF2突变(P=0.017),DCAG首次诱导CR(Patg5是巨自噬信号通路上游重要的调控因子。因此,我们检测初诊AML患者中BECLIN1和atg5基因表达水平,研究其预后价值。方法:在101例初诊AML患者中用实时定量PCR方法检测BECLIN1和atg5的m RNA表达水平。结果:CEBPα和C-KIT突变患者较野生型相比,BECLIN1表达量较低(P=0.044和P=0.036),且C-KIT突变患者atg5表达量也较低(P=0.040)。高表达BECLIN1和atg5患者总体生存时间较短(P=0.02和P=0.035),但无疾病生存时间无意义。多因素分析中,FLT3-ITD突变阳性(P=0.001)和年龄(P=0.032)是影响总体生存时间的独立危险因素。结论:BECLIN1和atg5高表达与疾病不良预后有关,但它们并不是AML的独立危险因素,需要后续研究探讨其潜在机制。

关键词：急性髓系白血病基因突变二代测序自噬 BECLIN1 atg5 实时定量聚合酶链式反应 mRNA水平

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自噬流在创伤性颅脑损伤中的变化及意义

自噬流在创伤性颅脑损伤中的变化及意义

作者：郎佳东河北医科大学

学位级别：硕士

目的:与创伤性颅脑损伤（traumatic brain injury,TBI）相关的神经损伤可分为原发性损伤和继发性损伤。原发性脑损伤发生时间极短,无干预时间窗口,而主要为急性细胞死亡,具有不可逆转性,而继发性脑损伤包括一系列迟发的细胞和神经组织... 详细信息

目的:与创伤性颅脑损伤（traumatic brain injury,TBI）相关的神经损伤可分为原发性损伤和继发性损伤。原发性脑损伤发生时间极短,无干预时间窗口,而主要为急性细胞死亡,具有不可逆转性,而继发性脑损伤包括一系列迟发的细胞和神经组织损伤性级联改变,可持续数天甚至数年,成为临床治疗的干预重点。近年来,越来越多的颅脑损伤动物实验模型表明自噬流在TBI的病理生理演变中发挥着重要作用。本研究着眼于临床,通过观察TBI后损伤脑组织中自噬流标志性蛋白的变化,探讨自噬流在人TBI中的变化及意义。方法:1.本研究纳入28例TBI患者作为损伤组,留取因手术需要而清除的挫伤脑组织作为标本,并依据患者受伤的时间分为三个亚组:A亚组（≦6小时,6例）,B亚组（6小时—24小时,11例）,C亚组（＞24小时,11例）。取得的标本立即置于液氮中,随后置于-80度冰箱保存,用于生物化学分析。对照组（Control组）为5例行侧脑室三角区小脑膜瘤切除手术的患者,留取的标本为行侧脑室三角区小脑膜瘤切除手术时皮层造瘘所切除的正常脑组织,标本处理方法同损伤组。2.干湿重法测定脑水含量,评估水肿程度。*** Blot检测自噬流标志性蛋白Beclin1、atg5、LC3-II、P62的表达。4.应用SPSS21.0统计学软件进行统计学分析,并分析自噬相关蛋白与脑组织水含量的相关性。结果:1.脑组织水含量:与Control组相比,损伤组脑组织水含量显著增多（P＜0.05）,且随着创伤后时间的延长,A、B、C三亚组脑组织水含量呈递增趋势（P＜0.05）。*** Blot结果:与对照组相比,损伤组Beclin1、atg5、LC3-II、P62蛋白表达明显增多（P＜0.05）。其中损伤组Beclin1和atg5蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）,LC3-II和P62在A、B、C三亚组中的蛋白表达水平随着受伤时间的延长呈递增趋势,且具有统计学意义（P＜0.05）。3.相关性分析显示:Beclin1表达与脑水含量无相关性（r=0.137,P＞0.05）;atg5表达与脑水含量无相关性（r=0.347,P＞0.05）;LC3-II表达与脑水含量呈正相关（r=0.427,P＜0.05）;P62表达与脑水含量呈正相关（r=0.667,P＜0.05）。结论:1.人TBI后,自噬相关蛋白Beclin1和atg5表达均明显升高,并维持在较高水平,表明TBI诱发自噬流明显增强。LC3-II和P62蛋白表达也显著升高,并且随TBI后的时间延长而呈递增趋势,表明TBI后自噬流下游被阻断,自噬小体堆积,且随受伤时间的延长而逐渐加重。***后随着受伤时间延长,脑组织水肿逐渐加重。LC3-II和P62与脑水含量呈正相关,表明自噬流下游阻断,导致自噬小体堆积,加剧了脑水肿。3.基于上述结果,有效调控自噬流,可能有助于减轻继发性颅脑损伤,有望成为一个有效的治疗靶点。

关键词：继发性颅脑损伤自噬流 Beclin1 atg5 LC3 P62

鱼藤酮诱导自噬抑制介导神经细胞凋亡分子机理研究

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鱼藤酮诱导自噬抑制介导神经细胞凋亡分子机理研究

作者：朱翠兰南京师范大学

学位级别：硕士

本研究采用细胞培养、DAPI和MDC染色、RNA干扰、荧光蛋白标记、Western blotting等细胞分子生物学方法和技术,以PC12细胞和小鼠原代神经元为实验对象,综合研究了鱼藤酮对神经细胞自噬水平的影响,并深入探讨了鱼藤酮诱导神经细胞凋亡与... 详细信息

本研究采用细胞培养、DAPI和MDC染色、RNA干扰、荧光蛋白标记、Western blotting等细胞分子生物学方法和技术,以PC12细胞和小鼠原代神经元为实验对象,综合研究了鱼藤酮对神经细胞自噬水平的影响,并深入探讨了鱼藤酮诱导神经细胞凋亡与自噬抑制的关系。结果如下:1鱼藤酮诱导神经细胞自噬抑制PC12细胞和小鼠原代神经元、或感染Ad-GFP-LC3的PC12细胞和小鼠原代神经元,以不同浓度鱼藤酮(0-1 μM)处理24 h,或用鱼藤酮(1 μM)处理(0-24 h),观察细胞 GFP-LC3puncta 变化;Western blot 分析 atg5、P62、LC3 蛋白表达。结果显示:鱼藤酮以浓度和时间依赖地方式诱导细胞GFP-LC3 puncta数量减少,以及LC3-Ⅱ减少和p62表达增加。提示:鱼藤酮引起神经细胞PD模型中自噬抑制。2鱼藤酮诱导自噬抑制导致神经细胞凋亡PC12细胞和小鼠原代神经元、或感染shRNA LC3-Ⅰ/Ⅱ、shRNA atg5、shRNA GFP、Ad-GFP-LC3的PC12细胞,用不同浓度鱼藤酮(0-1 μM)处理24h、或用雷帕霉素(0.2 μg/ml)预处理2 h后鱼藤酮(1 μM)处理24 h,MDC染色和GFP-LC3荧光拍照评估细胞自噬体变化,DAPI染色分析细胞凋亡,Western blot检测 atg5、P62、LC3、Cleaved-caspase-3、Cleaved-PARP 表达。结果显示:雷帕霉素逆转鱼藤酮诱导神经细胞MDC荧光强度降低和凋亡增加;下调LC3-Ⅰ/Ⅱ或atg5强化鱼藤酮诱导神经细胞MDC荧光强度或GFP-LC3 puncta数量降低以及调亡增加。提示:鱼藤酮诱导自噬抑制导致神经细胞凋亡。

关键词：鱼藤酮神经细胞自噬 atg5 LC3 p62 雷帕霉素凋亡

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小胶质细胞自噬功能障碍在帕金森病中的作用

小胶质细胞自噬功能障碍在帕金森病中的作用

作者：秦越山东大学

学位级别：硕士

[研究背景]帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是一种常见的中老年人神经系统退行性疾病,临床表现为静止性震颤、进行性强直、运动迟缓和姿势异常等,其病理特征主要是PD患者黑质内多巴胺能神经元的丢失和纹状体中多巴胺含量的显著减少... 详细信息

[研究背景]帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是一种常见的中老年人神经系统退行性疾病,临床表现为静止性震颤、进行性强直、运动迟缓和姿势异常等,其病理特征主要是PD患者黑质内多巴胺能神经元的丢失和纹状体中多巴胺含量的显著减少。PD发病机制复杂,其发展是衰老、遗传因素、自噬障碍、炎症、自身免疫机制及氧化应激等多种因素综合作用的结果。近年来对PD发病机制的研究越来越关注于免疫平衡和细胞稳态的调控,而小胶质细胞作为脑内主要的免疫细胞,其功能和活化状态是影响PD进展的一个决定性因素。最近的研究发现,自噬可通过调节小胶质细胞介导的神经炎症参与神经退行性疾病的发生发展。自噬是一种分解代谢过程,它将细胞质中异常的细胞器和蛋白质隔离,并将其输送到溶酶体中进行降解,最终使所产生的大分子再循环。atg5（自噬相关基因5）是自噬体形成过程中必须的分子,atg5缺失会导致自噬障碍。自噬与免疫炎症之间的相互作用及其在中枢神经系统中所扮演的角色是近年来的研究热点,自噬异常与众多神经退行性疾病的病理过程密切相关。已有文献表明小胶质细胞介导的自噬反应在缺血性脑卒中、阿尔茨海默病中发挥一定作用,但有关小胶质细胞自噬在PD进程的影响在国内外少见报道。鉴于自噬和炎症均与PD的病理生理机制密切相关,深入探讨PD病理过程中小胶质细胞自噬的作用及与神经炎症反应之间的关系具有重要的意义。在巨噬细胞中,自噬可通过负性调节免疫信号途径及NLRP3炎性小体活性发挥抗炎作用。NLRP3炎性小体是当前免疫学研究的热点之一,与多种免疫性疾病及神经退行性疾病的发病密切相关。在涉及PD发病机制的多种炎性介质中,NLRP3发挥重要作用。NLRP3是NOD样受体家族中的一员,与凋亡相关斑点样蛋白（caspase-activating-recruitment-domain,ASC）和 caspase-1 结合形成炎性体,导致caspase-1的募集和活化,然后caspase-1诱导IL-1β和IL-18的成熟和分泌。大量研究证明,巨噬细胞中自噬的丧失或损伤可导致和IL-18、IL-1α和IL-1β的过度分泌。因此,小胶质细胞中的自噬是否和NLRP3炎症反应有关值得进一步研究。基于以上研究背景,本实验通过干扰atg5表达抑制小胶质细胞自噬,观察小胶质细胞自噬在PD中的作用以及对PD神经炎症的影响,进而研究自噬对NLRP3的激活以及下游caspase-1和IL-1β成熟和分泌的影响。[研究目的]通过利用atg5小干扰RNA和构建小胶质细胞特异性atg5基因敲除小鼠,在体内和体外实验中观察小胶质细胞自噬功能障碍对PD的作用,进一步研究小胶质细胞自噬是否通过NLRP3通路调控PD神经炎症。[研究方法]体内实验:1.根据Cre-loxP原理,将atg5基因flox杂合子小鼠（atg5flox+/-）和表达CX3CR1-Cre酶的小鼠交配,得到小胶质细胞条件性atg5基因敲除小鼠（atg5flox/flox;CX3CRl-Cre）,进行基因型鉴定并使用流式分选出原代小胶质细胞检测敲除效率。2.取野生（Wild-type,WT）、atg5flox/flox和 atg5flox/flox;CX3CR1-Cre 三组小鼠黑质和纹状体部位的冰冻切片进行酪氨酸羟化酶（Tyrosine hydroxylase,TH）免疫组化染色,取三组小鼠黑质的组织切片进行尼氏染色,观察未造模情况下小胶质细胞特异性敲除atg5对多巴胺神经元的影响。3.小鼠腹腔注射MPTP构建PD急性模型,7 d后通过转棒实验,悬挂实验和爬杆实验观察不同组小鼠的行为学改变。4.小鼠腹腔注射MPTP构建PD急性模型,7d后免疫组化实验观察四组小鼠黑质和纹状切片TH的表达,取四组小鼠黑质的组织切片进行尼氏染色,以及取纹状体使用HPLC-MS联用法检测DA及其代谢产物DOPAC和HVA的含量,观察小胶质细胞特异性敲除atg5对MPTP诱导的急性PD小鼠模型中脑多巴胺神经元变性的影响。5.小鼠腹腔注射MPTP构建PD急性模型,7 d后取四组小鼠黑质的组织切片对Iba1和GFAP进行免疫荧光染色,观察小胶质细胞特异性敲除atg5对急性PD小鼠模型星形胶质细胞及小胶质细胞的活化及表达变化的影响。6.小鼠腹腔注射MPTP构建PD急性模型,选择造模后1 d、3 d、5 d、7 d四个时间点处死小鼠,取小鼠黑质部位组织,western blot检测各个时间点NLRP3的表达变化,选择7 d后取四组小鼠黑质部位组织和冰冻切片,western blot及免疫荧光检测NLRP3和TH的表达,并用western blot检测NLRP3下游caspase-1和IL-1β的活化情况。7.小鼠腹腔注射MPTP构建PD亚急性模型,21 d后进行行为学实验,免疫组化

关键词： atg5 NLRP3 自噬炎症反应帕金森病

二甲双胍改善镉诱导神经细胞自噬体积累依赖的凋亡分子机理研究

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二甲双胍改善镉诱导神经细胞自噬体积累依赖的凋亡分子机理研究

作者：吴文南京师范大学

学位级别：硕士

本研究采用细胞培养、RNA干扰、GFP-LC3/m Cherry-GFP-LC3荧光标记、MDC染色、TUNEL和/或DAPI染色、细胞活性检测和Western blot分析等细胞生物学和分子生物学技术和方法,以PC12细胞和小鼠原代神经元为实验对象,通过建立的镉暴露细胞模... 详细信息

本研究采用细胞培养、RNA干扰、GFP-LC3/m Cherry-GFP-LC3荧光标记、MDC染色、TUNEL和/或DAPI染色、细胞活性检测和Western blot分析等细胞生物学和分子生物学技术和方法,以PC12细胞和小鼠原代神经元为实验对象,通过建立的镉暴露细胞模型,较为系统地研究了二甲双胍改善镉诱导神经细胞自噬体积累依赖的凋亡分子机理。结果如下:1二甲双胍干预镉诱导神经细胞自噬体积累抗凋亡研究以PC12细胞和小鼠原代神经元为实验对象,用不同浓度的二甲双胍(0-1.5m M)预处理24 h后暴露镉(10μM)4 h、12 h或24 h。采用Western blot分析atg5、LC3、p62、Cleaved-caspase-3和Cleaved-PARP蛋白表达,细胞感染Ad-GFP-LC3荧光标记自噬体,MDC染色自噬体荧光强度,MTS实验和TUNEL/DAPI染色评估细胞活性和凋亡。结果显示,二甲双胍抵抗镉诱导的神经细胞活性下降和凋亡,抑制镉引起的细胞Cleaved-caspase-3、Cleaved-PARP、atg5、LC3-II和p62表达增加,削弱镉诱导的细胞自噬体积累。提示:二甲双胍干预镉诱导神经细胞自噬体积累抗凋亡。2二甲双胍通过调控atg5和自噬流改善镉诱导神经细胞自噬体积累依赖的凋亡机理研究以PC12细胞和小鼠原代神经元、或用慢病毒sh RNA atg5或sh RNA GFP感染的PC12细胞为实验对象,用二甲双胍(1 m M)预处理24 h和/或氯喹(CQ)(25μM)预处理1 h后暴露镉(10μM)4 h、12 h或24 h。采用Western blot分析atg5、LC3、p62和Cleaved-caspase-3蛋白表达,细胞感染Ad-GFP-LC3荧光标记自噬体,TUNEL染色评估细胞凋亡。结果显示,下调atg5显著强化二甲双胍抑制基础的和镉诱导的神经细胞LC3-II和Cleaved-caspase-3表达,提高二甲双胍改善镉诱导的神经细胞自噬体积累和凋亡;由CQ损伤自噬流加强镉诱导神经细胞LC-II、p62和Cleaved-caspase-3表达以及自噬体积累和凋亡,且抵抗二甲双胍对镉诱导细胞这些事件的抑制作用。提示:二甲双胍通过调控atg5和自噬流改善镉诱导神经细胞自噬体积累依赖的凋亡。3二甲双胍通过激活AMPK阻滞自噬流损伤改善镉诱导神经细胞自噬体积累依赖的凋亡机理研究以PC12细胞和小鼠原代神经元、或用腺病毒Ad-AMPK-ca或Ad-Lac Z感染的PC12细胞为实验对象,用二甲双胍(0-1.5 m M或1 m M)预处理24 h和/或AICAR(2 m M)预处理1 h后暴露镉(10μM)4 h、12 h或24 h。采用Western blot分析AMPK、p-AMPK、ACC、p-ACC、atg5、LC3、p62和Cleaved-caspase-3蛋白表达,细胞感染Ad-GFP-LC3荧光标记自噬体、感染Ad-m Cherry-GFP-LC3双荧光标记分析自噬流表现,TUNEL染色评估细胞凋亡。结果显示,二甲双胍激活AMPK,并抵抗镉诱导的神经细胞AMPK失活;由AICAR激活AMPK或AMPK持续激活(AMPK-ca)表达强化二甲双胍抑制镉诱导神经细胞atg5、LC3-II、p62和Cleaved-caspase-3表达,增强二甲双胍改善镉诱导神经细胞自噬体积累和凋亡;AMPK-ca表达强化二甲双胍抵抗镉诱导的神经细胞自噬流损伤。提示:二甲双胍通过激活AMPK阻滞自噬流损伤改善镉诱导神经细胞自噬体积累依赖的凋亡。

关键词：二甲双胍镉神经细胞自噬 AMPK atg5 LC3 p62 自噬流自噬体凋亡

STMN1参与调控胶质瘤细胞对TMZ化疗敏感性的机理研究

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STMN1参与调控胶质瘤细胞对TMZ化疗敏感性的机理研究

作者：刘飞利第二军医大学

学位级别：硕士

脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，约占颅内原发肿瘤的45～55%。尽管目前包括影响学、手术、放射治疗和化学治疗等综合诊疗水平不断提高，但脑胶质瘤患者的预后并未得到显著改善，GBM患者的平均生存时间不到1年。胶质瘤的病理... 详细信息

脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，约占颅内原发肿瘤的45～55%。尽管目前包括影响学、手术、放射治疗和化学治疗等综合诊疗水平不断提高，但脑胶质瘤患者的预后并未得到显著改善，GBM患者的平均生存时间不到1年。胶质瘤的病理级别、手术切除程度和对放化疗敏感程度是影响脑胶质瘤患者预后的主要因素，但临床上常可见同一病理级别、同样手术全切除并行相同放化疗方案的患者出现截然不同的预后，有的短期内复发，有的可获得长期生存。这种生存时间的差异很有可能与个体对放化疗敏感程度不同密切相关。胶质瘤化疗敏感相关的分子病理机制极为复杂，涉及多个基因、多个因素共同参与，并通过多个分子事件、多种途径共同完成。因此有必要深入探讨胶质瘤化疗敏感性分子调控机制，为提高胶质瘤患者化疗疗效提供新的研究思路和理论依据。 STMN1(Stathmin1)由Sobel A等在1983年首先报道，是近年研究较多的一种微管解聚磷蛋白，通过磷酸化水平的自身调节影响微管动力系统平衡，参与许多信号通路的调控。STMN1在许多肿瘤组织中表达上调，因此又被称为oncoprotein18(OP18)。在正常细胞中，STMN1主要参与细胞周期、凋亡和细胞运动的调控，而在一些恶性肿瘤中，STMN1高表达与肿瘤的恶性程度、侵袭和远处转移有关，并与肿瘤患者对一些化疗药物的反应和不良预后相关。课题组前期通过基因芯片技术结合生物信息学分析发现STMN1为胶质瘤化疗敏感相关基因之一，不但与胶质瘤本身的生物特性如增殖、凋亡、侵袭、细胞周期等改变有关，体外敲减后还可明显改变胶质瘤细胞对化疗药物的敏感性，但其机理尚不清楚。本研究拟通过体外在四个GBM细胞株中筛选STMN1表达差异，构建STMN1慢病毒干扰及过表达载体并转染GBM细胞株，建立STMN1表达水平不同的胶质瘤细胞株，测定其对TMZ的敏感性。进一步在STMN1敲除的胶质瘤细胞株中观察自噬和凋亡水平，最后通过抑制自噬和凋亡后检测其对TMZ敏感性的改变，从而研究自噬和凋亡在STMN1调控胶质瘤化疗敏感性中的作用。实验分为三部分：第一部分，STMN1与胶质瘤细胞对TMZ化疗敏感性的关系;第二部分，研究凋亡在STMN1调控胶质瘤细胞对TMZ敏感性中的作用;第三部分，探讨自噬在STMN1调控胶质瘤细胞对TMZ 敏感性中的作用。第一部分STMN1与胶质瘤细胞对TMZ化疗敏感性的关系目的：研究STMN1与胶质瘤化疗敏感性之间的关系，验证STMN1敲除及过表达后GBMs细胞株对TMZ化疗敏感性变化。方法：分别应用Real-time PCR（实时荧光定量PCR）和Western-blot方法检测四个GBM细胞株的STMN1mRNA和蛋白表达水平，并应用CCK-8法测定此四株细胞株经TMZ处理后的细胞活力变化。构建STMN1干扰和过表达载体并转染GBM细胞株，采用Real-time PCR和Western-blot鉴定转染效率，并用CCK-8法测定其对TMZ敏感性。结果：STMN1mRNA表达水平依次为U251-MG>A172>U87-MG>T98G，但两两之间均未达到统计学显著性差异（P>0.05）。STMN1蛋白表达水平与STMN1mRNA表达水平趋势一致，T98表达量最低，与A172组存在统计学显著差异（P5），与U251组存在极显著统计学差异（P>0.01）;U251与A172组间未存在统计学差异;A172与U87组间存在显著差异（P5）。U251、A172、U87和T98经TMZ处理后细胞活力依次降低，但两两之间未达到统计学差异（P>0.05）。U251和T98干扰STMN1组的干扰效率均约为60%，两株细胞的过表达组的STMN1表达量均约为空白对照组的2倍。U251+STMN1干扰+TMZ组在TMZ处理72h后极显著低于U251组（P0.05）。结论：STMN1表达水平与其对TMZ的敏感性呈负相关，STMN1敲除后U251对TMZ的敏感性增加，STMN1过表达后T98对TMZ的敏感性变化不显著。第二部分凋亡在STMN1调控胶质瘤细胞对TMZ敏感性中的作用目的：研究STMN1靶向敲除后U251对TMZ化疗敏感性增加与凋亡的关系。方法：选择STMN1干扰的U251细胞株，利用流式细胞仪检测其经TMZ和顺铂（Cisplatin）作用后的凋亡率;用Z-VAD(OMe)-FMK抑制凋亡，CCK8法测定其对TMZ的敏感性。结果: U251+干扰+TMZ组较U251+干扰细胞凋亡率显著增加，达到统计学差异（P5），但U251+干扰+TMZ组的凋亡率低于U251+干扰+Cisplatin组，达到统计学极显著差异（P<0.01）。（

关键词：胶质瘤 U251-MG A172 U87-MG T98G 替莫唑胺凋亡 Z-VAD(OMe)-FMK 顺铂自噬 LC3 Beclin1 atg5

miR-30d抑制缺血缺氧心肌细胞损伤的机制研究

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miR-30d抑制缺血缺氧心肌细胞损伤的机制研究

作者：唐史林中南大学

学位级别：硕士

目的:本课题拟在H9C2心肌细胞缺血缺氧损伤模型上,研究miR-30d对体外模拟心肌缺血缺氧后心肌损伤的调控作用。通过探讨心肌缺血缺氧后自噬和铁死亡之间的关系,分析心肌缺血缺氧后自噬的作用,揭示自噬影响心肌细胞的铁代谢,最终导致心肌... 详细信息

目的:本课题拟在H9C2心肌细胞缺血缺氧损伤模型上,研究miR-30d对体外模拟心肌缺血缺氧后心肌损伤的调控作用。通过探讨心肌缺血缺氧后自噬和铁死亡之间的关系,分析心肌缺血缺氧后自噬的作用,揭示自噬影响心肌细胞的铁代谢,最终导致心肌细胞的死亡的特定机制,也为临床治疗提供新的思路和靶点。方法∶为了模拟心肌缺血缺氧模型,我们培养了H9C2心肌细胞,细胞缺血缺氧处理为更换H9c2心肌细胞的就培养基,在无糖含双抗的混合DMEM培养基培养,将重新更换好的无糖培养基的放置于含95%N2,5%CO和中培养,使用CCK-8检测细胞活性,分组如下,设置正常对照组,第一组:缺血缺氧条件下0h,第二组:缺血缺氧条件下1h,第三组:缺血缺氧条件下2h第四组:缺血缺氧条件下6h,第五组:缺血缺氧条件下12h,第六组:缺血缺氧条件下24h。接下来用RT-PCR检测miR-30d、PTGS2的表达,蛋白免疫印迹测量GPX4、FTH1、Beclin-1等表达,Ferro Orange荧光探针检测亚铁离子水平,Liperfluo探针检测细胞膜脂质过氧化水平。GSH试剂盒检测GSH含量,GPX4活性试剂盒检测GPX4活性,透射电镜检测自噬小体。荧光素酶基因实验确定miR-30d的下游靶基因,通过miR-30d过表达,atg5过表达及低表达干预,检测相关的铁死亡指标,明确影响铁死亡的机制。结果:1.心肌缺血缺氧模型中miR-30d表达时间依赖性下调,铁死亡标志物PTGS2增加,ROS及脂质过氧化程度增加,GPX4表达降低,其活性也降低。自噬基因atg5增加、启动蛋白Beclin-1增加、自噬小体增加。铁蛋白表达降低,亚铁离子水平增加。使用铁死亡抑制剂能增加心肌细胞存活率。***-30d过表达降低启动蛋白Beclin-1表达,减少自噬小体,降低ROS及脂质过氧化水平。增加GPX4的表达,上调铁蛋白水平,降低亚铁离子。生化分析和荧光素酶基因实验证实atg5是miR-30d下游靶基因。3.慢病毒atg5(LV-SHatg5)抑制atg5的表达,上调FTH1、Gpx4表达,降低MDA、铁离子含量,增加GSH含量,增强GPX4活性。同样,atg5过表达下调FTH1、Gpx4表达,增加MDA、铁离子含量,减少GSH含量,降低GPX4活性。结论:在心肌缺血缺氧的模型上,miR-30d能通过与atg5结合抑制自噬,减少FTH1降解,抑制铁离子的过度增加,降低心肌细胞铁死亡的发生。图10幅、表5个,参考文献51篇

关键词： miR-30d atg5 自噬铁死亡心肌缺血缺氧

三甲基氯化锡致小鼠海马线粒体损伤和神经元细胞凋亡的影响机制

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三甲基氯化锡致小鼠海马线粒体损伤和神经元细胞凋亡的影响机制

miR-216b对顺铂耐药胃癌细胞生物学行为的影响

中国毒理学会第十次全国毒理学大会

作者：王莉王月吴思雅凡钦刘振中川北医学院公共卫生学院川北医学院药学院

目的探讨三甲基氯化锡(TMT)对小鼠海马线粒体损伤及神经元细胞凋亡的影响及潜在作用机制。方法将昆明种雄性小鼠随机分组后染毒,建立不同剂量和不同染毒时间的动物模型。对剂量组小鼠进行水迷宫实验观察TMT致小鼠学习记忆功能障碍情况;... 详细信息

目的探讨三甲基氯化锡(TMT)对小鼠海马线粒体损伤及神经元细胞凋亡的影响及潜在作用机制。方法将昆明种雄性小鼠随机分组后染毒,建立不同剂量和不同染毒时间的动物模型。对剂量组小鼠进行水迷宫实验观察TMT致小鼠学习记忆功能障碍情况;提取受试小鼠海马组织,对其进行蛋白质组学分析筛选差异蛋白,选取与线粒体密切相关的SUCLG1、ND5、NDUFA4L2及COA7进行重点研究,采用PCR及Western blot检测其mRNA及蛋白表达的变化;并用透射电镜观察海马组织线粒体形态;根据蛋白组学结果对atg5及Bax进行了检测,并通过TUNEL染色观察染毒小鼠海马神经元的凋亡情况。结果与对照组相比,各染毒组小鼠在水迷宫中显示的逃避潜伏期延长,1.00 mg/kg、4.64 mg/kg TMT组逃避潜伏期有显著差异(P5mg/kg TMT组其逃避潜伏期也有所延长,但无显著差异(P>0.05);根据蛋白组学分析SUCLG1、ND5、NDUFA4L2、COA7、atg5、Bax表达有明显差异;PCR结果显示,小鼠海马SUCLG1、COA7 mRNA水平显著上调(P5 mRNA水平显著下调(Patg5 mRNA表达水平随TMT染毒剂量的增加及染毒时间的延长而逐渐降低(P5 or P5蛋白表达水平降低(Patg5蛋白表达量均显著降低(P5与小鼠海马神经元线粒体损伤有密切关系以及atg5和Bax与神经元凋亡紧密相连,本研究也进一步证明了其线粒体损伤和神经元凋亡与TMT染毒剂量和时间有显著的关系。因此TMT的神经毒性机制可能与海马神经元线粒体损伤以及神经元凋亡有一定的关系。

关键词： TMT 海马神经元线粒体损伤细胞凋亡 SUCLG1 ND5 NDUFA4L2 COA7 atg5 Bax

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中华实用诊断与治疗杂志 2021年第8期35卷 789-795页

作者：周京涛刘佳李亮李建刚努尔买买提·阿米都拉闫军寇旭东艾孜买提·艾海提马博新疆医科大学第二附属医院普外科新疆维吾尔自治区乌鲁木齐830000 新疆维吾尔自治区第八人民医院急诊科新疆维吾尔自治区乌鲁木齐830000 新疆医科大学第七附属医院普外科新疆维吾尔自治区乌鲁木齐830000

目的探讨miR-216b对顺铂耐药的胃癌细胞增殖和凋亡的作用及可能机制。方法采用实时荧光定量PCR法检测人胃黏膜细胞系GES-1、人胃癌细胞系SGC7901和胃癌顺铂耐药细胞系SGC7901/DDP的miR-216b相对表达量,采用Western blot法检测3种细胞atg... 详细信息

目的探讨miR-216b对顺铂耐药的胃癌细胞增殖和凋亡的作用及可能机制。方法采用实时荧光定量PCR法检测人胃黏膜细胞系GES-1、人胃癌细胞系SGC7901和胃癌顺铂耐药细胞系SGC7901/DDP的miR-216b相对表达量,采用Western blot法检测3种细胞atg5蛋白相对表达量。SGC7901/DDP细胞加入不同浓度顺铂,采用CCK-8实验检测顺铂对细胞的半数抑制浓度,确定顺铂在后续实验中浓度。对数生长期SGC7901/DDP细胞随机分为空白对照组(正常培养)、agomir-NC组(转染agomir-NC)、agomir-miR-216b组(转染agomic-miR-216b)、antagomir-NC组(转染antagomir-NC)和antagomir-miR-216b组(转染antagomir-miR-216b),采用实时荧光定量PCR法检测5组细胞miR-216b相对表达量,采用Western blot法检测5组细胞LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、atg5、P62蛋白相对表达量,采用CCK-8实验检测5组细胞活力,采用克隆形成实验检测5组细胞克隆细胞数,采用流式细胞术检测5组细胞凋亡率。采用荧光素酶报告实验检测miR-216b与atg5的靶向结合。对数生长期SGC7901/DDP细胞随机分为agomir-NC+oe-NC组(转染agomir-NC和oe-NC)、agomir-MiR-216b+oe-NC组(转染agomir-miR-216b和oe-NC)和agomir-miR-216b+oe-atg5组(转染agomir-miR-216b和oe-atg5),采用实时荧光定量PCR法检测miR-216b相对表达量,采用Western blot法检测细胞atg5蛋白相对表达量。结果SGC7901/DDP细胞miR-216b相对表达量(0.26±0.04)低于SGC7901细胞(0.49±0.06)和GES-1细胞(1.00±0.05)(P5),SGC7901细胞低于GES-1细胞(P5);SGC7901/DDP细胞atg5相对表达量(0.76±0.03)高于SGC7901细胞(0.47±0.03)和GES-1细胞(0.18±0.02)(P5),SGC7901细胞高于GES-1细胞(P5);顺铂对SGC7901/DDP细胞的半数抑制浓度为7.998μmol/L,顺铂在后续实验中使用浓度为8μmol/L;agomir-miR-216b组细胞miR-216b相对表达量(2.43±0.14)、细胞凋亡率[(28.37±1.61)%]和P62蛋白相对表达量(0.43±0.02)高于agomir-NC组[1.02±0.05、(14.34±0.97)%、0.23±0.03](P5),细胞活力[(25.20±2.75)%]、克隆细胞数[(49.33±5.51)个]、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ(0.22±0.02)和atg5蛋白相对表达量(0.17±0.01)低于agomir-NC组[(51.39±3.05)%、(119.33±4.51)个、0.38±0.02、0.33±0.02](P5);antagomir-miR-216b组细胞miR-216b相对表达量(0.33±0.02)、细胞凋亡率[(8.77±1.12)%]和P62蛋白相对表达量(0.12±0.02)低于antagomir-NC组[0.99±0.05、(14.40±1.06)%、0.22±0.01](P5),细胞活力[(77.34±3.97)%]、克隆细胞数[(166.67±6.51)个]、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ(1.84±0.07)和atg5蛋白相对表达量(0.83±0.04)高于antagomir-NC组[(49.25±4.00)%、(116.00±4.58)个、0.36±0.02、0.34±0.02](P5);空白对照组、agomir-NC组、antagomir-NC组组间两两比较差异均无统计学意义(P>0.05)。miR-216b靶向调控atg5。agomir-miR-216b+oe-NC组和agomir-miR-216b+oe-atg5组细胞miR-216b相对表达量高于agomir-NC+oe-NC组(P5),agomir-miR-216b+oe-NC组与agomir-miR-216b+oe-atg5组比较差异无统计学意义(P>0.05);agomir-miR-216b+oe-NC组细胞atg5蛋白相对表达量低于agomir-NC+oe-NC组和agomir-miR-216b+oe-atg5组(P5),agomir-miR-216b+oe-atg5组低于agomir-NC+oe-NC组(P5

关键词：胃癌顺铂耐药 miR-216b atg5 自噬