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靶向干扰谷氨酰胺转运体asct2抑制HNSCC细胞生长的体外研究

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靶向干扰谷氨酰胺转运体ASCT2抑制HNSCC细胞生长的体外研究

口腔上皮细胞条件性asct2基因敲除小鼠模型的建立

2018年中华口腔医学会第十次全国口腔黏膜病学术大会暨...

作者：凌子航骆怡君李围程斌陶小安中山大学光华口腔医学院附属口腔医院黏膜病科广东省口腔医学生物重点实验室

目的:在明确头颈部鳞癌细胞(head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)对谷氨酰胺的依赖性基础上,靶向干扰UMSCC1、HN5、MDA1986细胞谷氨酰胺转运体asct2的表达后,检测细胞增殖、凋亡及迁移能力的改变,为后续体内实验奠定基础。方... 详细信息

目的:在明确头颈部鳞癌细胞(head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)对谷氨酰胺的依赖性基础上,靶向干扰UMSCC1、HN5、MDA1986细胞谷氨酰胺转运体asct2的表达后,检测细胞增殖、凋亡及迁移能力的改变,为后续体内实验奠定基础。方法:比较UMSCC1、HN5、MDA1986细胞在乏谷氨酰胺条件下培养,细胞增殖与迁移能力的改变;应用美国Sigma公司asct2siRNA试剂靶向干扰UMSCC1、HN5、MDA1986细胞asct2的表达,MTT法检测细胞的增殖,Westernblot检测细胞PAPR表达,创伤修复实验检测细胞迁移能力,美国Enzo公司ROS染色试剂盒检测细胞内氧自由基的水平,美国Cayman glutathione assay kit检测细胞内谷胱甘肽的水平。结果:谷氨酰胺缺乏可显著减低HN5、UMSCC1、MDA1986头颈部鳞癌细胞的增殖与迁移;asct2 siRNA试剂靶向干扰UMSCC1、HN5、MDA1986细胞后,asct2表达水平显著下降,细胞增殖能力、迁移能力显著下降;细胞谷氨酰胺摄入的减少,导致细胞内GSH合成受阻,GSH水平出现显著降低,而细胞内ROS水平显著升高,诱导了细胞凋亡的增加(PARP cleavage表达上升(Pasct2的表达,可抑制肿瘤细胞的增殖与迁移,并诱导细胞凋亡。

关键词：谷氨酰胺 asct2 头颈部鳞癌

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口腔上皮细胞条件性ASCT2基因敲除小鼠模型的建立

谷氨酰胺转运体asct2在白斑癌变过程中的动态变化

中华口腔医学会第十三次全国口腔粘膜病学暨第十一次全国口...

作者：李围凌子航陆景怡程斌陶小安中山大学光华口腔医学院中山大学附属口腔医院

目的:建立口腔上皮细胞条件性asct2基因敲除小鼠模型,为后续探究asct2在白斑发病中的作用及癌变机制奠定基础。方法:设计基因敲除策略,获得对照野生型和纯合基因敲除小鼠。提取鼠趾或鼠尾组织DNA,经聚合酶链式反应(PCR)扩增后鉴定其基... 详细信息

目的:建立口腔上皮细胞条件性asct2基因敲除小鼠模型,为后续探究asct2在白斑发病中的作用及癌变机制奠定基础。方法:设计基因敲除策略,获得对照野生型和纯合基因敲除小鼠。提取鼠趾或鼠尾组织DNA,经聚合酶链式反应(PCR)扩增后鉴定其基因型。Slc1a5 fl/fl Cre+/-基因背景小鼠于4周以75 mg/kg连续腹腔注射他莫昔芬(20 mg/ml)5天,分别于完成注射后1,3,7,14,21天处死Slc1a5 fl/fl Cre+/-及Slc1a5 fl/fl小鼠,提取小鼠舌上皮DNA和蛋白质,利用PCR技术检验asct2基因的敲除情况,通过Western blot与免疫组织化学(IHC)验证舌组织中的asct2表达水平。结果:基因型鉴定结果表明已培养出Slc1a5 fl/fl Cre+/-纯合子小鼠;基因敲除鉴定显示相对于Slc1a5 fl/fl小鼠,Slc1a5 fl/fl Cre+/-小鼠在他莫昔芬诱导后舌上皮出现470bp大小的条带,提示舌上皮Slc1a5基因已被敲除;Western blot与IHC结果显示他莫昔芬诱导后Slc1a5 fl/fl Cre+/-小鼠舌上皮asct2表达明显下调。结论:成功建立了口腔上皮细胞条件性asct2基因敲除小鼠模型。

关键词： asct2 条件性基因敲除口腔白斑

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谷氨酰胺转运体ASCT2在白斑癌变过程中的动态变化

转录因子YinYang1在食管鳞状细胞癌中的表达及作用机制研究

2018年中华口腔医学会第十次全国口腔黏膜病学术大会暨...

作者：骆怡君凌子航胡钦朝李围程斌陶小安中山大学光华口腔医学院附属口腔医院黏膜病科广东省口腔医学生物重点实验室

目的:明确谷氨酰胺转运体asct2在口腔正常黏膜、口腔白斑(oral leukoplakia, OLK)、口腔鳞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)组织中的表达水平,比较口腔癌前病变演进过程中asct2的动态变化,分析asct2表达水平与OLK异常增生程度、O... 详细信息

目的:明确谷氨酰胺转运体asct2在口腔正常黏膜、口腔白斑(oral leukoplakia, OLK)、口腔鳞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)组织中的表达水平,比较口腔癌前病变演进过程中asct2的动态变化,分析asct2表达水平与OLK异常增生程度、OSCC预后的相关性。方法:收集临床样本(正常口腔黏膜6例,口腔白斑24例,口腔鳞癌93例),免疫组化检测正常口腔黏膜、口腔白斑、口腔鳞癌组织上皮asct2表达水平,另外对其中44例口腔鳞癌患者临床资料进行生存分析。Kaplan-Meier法评估不同asct2表达水平的口腔鳞癌患者生存率,Log-rank检验比较asct2表达水平与口腔鳞癌患者生存率有无显著性差异。结果:正常口腔黏膜asct2表达为阴性或低表达,37.5%口腔白斑组织asct2高表达,69.4%口腔鳞癌组织asct2高表达,白斑组与鳞癌组显著高于正常对照组。进一步将白斑分为单纯上皮增生/轻度异常增生组(16例)与白斑中/重度异常增生组(8例)并进行比较,白斑中/重度异常增生组asct2表达水平显著高于单纯上皮增生/轻度异常增生组(P=0.046);将白斑组与口腔鳞癌组进行比较,口腔鳞癌组asct2表达水平显著高于白斑组(P=0.012);Log-rank检验显示asct2高表达的口腔鳞癌患者生存率较低(P=0.037)。结论:asct2表达水平在口腔癌前病变演进过程中逐渐升高,asct2可能在OLK癌变过程中起重要作用,同时asct2可作为预测OSCC病人预后不佳的重要因素。

关键词：谷氨酰胺 asct2 口腔白斑口腔鳞癌

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转录因子YinYang1在食管鳞状细胞癌中的表达及作用机制研究

作者：罗灿川北医学院

学位级别：硕士

研究背景:食管癌(Esophageal carcinoma,ESCA)是全球最为最常见的癌症之一,主要分为食管鳞状细胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)和食管腺癌(Esophageal adenocarcinoma,EAC)两种病理类型,其发病率和死亡率在所有癌症中高居前列。每年约有50余万人死于ESCA,占全球所有癌症死亡人数的5.5%,并呈现出显著的地理差异,我国是世界上ESCA发病率和死亡率最高的国家,且其发病率呈逐年上升趋势。本研究基于TCGA数据库分析转录因子阴阳1(YinYang 1,YY1)在ESCA中的表达及预后情况,及其与患者临床病理参数的关系。从基因突变、免疫细胞浸润以及功能注释分析等方面探讨了 YY1在ESCA中可能的分子机制。最后,通过体外细胞实验,分析YY1对ESCC细胞株ECA109和TE-1细胞行为学和谷氨酰胺代谢的影响,并初步探讨其潜在的分子机制,为ESCA开发新的临床治疗策略提供理论依据。研究目的:1.基于TCGA数据库分析YY1在ESCA中的表达及预后情况,及其与患者临床病理参数的关系。2.探究YY1在ESCA中的表达情况,并分析YY1与患者病理信息的相关性;3.在ESCC细胞中敲减和过表达YY1,探究YY1在促进ESCC发生、发展中可能存在的作用及分子机制。为ESCC开发新的临床治疗策略提供理论依据。研究方法:1.利用UCSC(www.***.ucsc.edu)、NCBI(https://www.***.nl m.***.gov)和SMART(http://smart.***.de/)分析不同物种中YY1蛋白的保守功能域。2.利用UALCAN数据库分析YY1 mRNA在ESCA组织中的表达与其临床病理参数之间的关系;用Kaplan-Meier绘图仪分析YY1 mRNA在ESCA中的表达对预后的价值;用CbioPortal网站探索、可视化和分析ESCA中YY1的基因改变分析和TCGA数据集。3.利用TIMER探究YY1基因表达水平与免疫细胞浸润程度的相关性,以及YY1基因体细胞拷贝数改变(SCNAs)对免疫细胞浸润的影响;通过GEPIA2分析YY1在ESCA肿瘤、ESCA正常和GTEx中的表达与免疫细胞基因标志物的关系;用TISIDB(http://cis.***.hk/TISIDB/)研究YY1的表达与免疫亚型和ESCA相关趋化因子的关系。4.利用 LinkedOmics(http://***/)网站在TCGA-ESCA数据集对YY1相关表达基因进行分析。并利用DAVID分析工具(https://david.***.gov/)对YY1相关表达基因的生物学功能进行分类。选择生物学过程(BP)、分子功能(MF)、细胞成分(CC)和KEGG途径作为分析项目。5.利用GSCALite(http://***/web/GSCALite/)肿瘤基因组分析平台对TCGA-ESCA数据集进行肿瘤通路活性、GDSC和CTRP药物敏感性分析。6.于2015年7月至2016年3月在川北医学院附属医院心胸外科收集经病理证实的ESCC组织及配对的癌旁组织3 1对。采用免疫组织化学染色法、Western Blot、RT-qPCR检测YY1在ESCC癌组织及配对的癌旁正常食管上皮组织中YY1的表达定位情况。7.于体外培养正常食管上皮细胞株HET-1A以及ESCC细胞株ECA109和TE-1,采用逆转录聚合酶链式反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测YY1 的表达情况。8.通过siRNA在两个位点(YY1 siRNA1,YY1 siRNA2)敲减YY1 的表达,并另构建含靶向YY1的慢病毒介导YY1过表达质粒GV492-PCMV-PURO-YY1-OE(简称YY1-OE)感染ESCC细胞株ECA109和TE-1,应用 Western Blot及RT-qPCR检测siRNA和shYY1 对ESCC细胞株ECA109和TE-1中YY1的蛋白及mRNA表达的抑制作用和过表达作用。9.通过CCK-8试验、平板克隆形成试验、划痕试验检测敲减及过表达YY1后对ECA109和TE-1增殖、克隆、迁移等细胞学行为的影响。10.通过谷氨酰胺测试盒和谷氨酸测试盒检测代谢物,分析YY1敲低与过表达对ECA109和TE-1中谷氨酰胺和谷氨酸含量的影响,明确YY1对谷氨酰胺摄取及分解的调节作用。11.通过Western Blot及RT-qPCR检测YY1敲低及过表达细胞系中谷氨酰胺代谢相关蛋白谷氨酰胺转运子(asct2)、谷氨酰胺酶(GLS)、谷氨酸脱氢酶(GLUD1)的表达情况。研究结果:1.利用多种生物信息学数据库对ESCA患者的YY1基因进行系统分析。结果表明,YY

关键词：食管癌转录因子YY1 增殖 asct2 GLS GLUD1

丙氨酸-丝氨酸-半胱氨酸转运体2对肝细胞肝癌增殖和侵袭的影响

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中国科学技术大学学报 2021年第2期51卷 129-139页

作者：于淑琦张诗童王德政孙漪程美玲阚晨倪芳安徽医科大学基础医学院病理生理学教研室安徽合肥230032 中国科学技术大学附属第一医院(安徽省立医院)血液科安徽合肥230001 中国科学技术大学生命科学与医学部基础医学院安徽合肥230027

代谢重编程是肿瘤的主要特征,肿瘤细胞通过上调丙氨酸-丝氨酸-半胱氨酸转运体2(asct2)来适应其对谷氨酰胺的需求.本研究发现肝细胞肝癌(HCC)组织中asct2的表达明显高于正常肝组织,并且,高表达asct2的患者长期生存率较低.在体外实验中,敲... 详细信息

代谢重编程是肿瘤的主要特征,肿瘤细胞通过上调丙氨酸-丝氨酸-半胱氨酸转运体2(asct2)来适应其对谷氨酰胺的需求.本研究发现肝细胞肝癌(HCC)组织中asct2的表达明显高于正常肝组织,并且,高表达asct2的患者长期生存率较低.在体外实验中,敲低asct2能显著抑制HCC细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭.细胞周期分析表明,敲低asct2抑制了HCC细胞S期的比例.裸鼠成瘤实验证实敲低HCC细胞中的asct2能显著抑制肿瘤的生长.进一步的研究显示,敲低asct2可显著抑制HCC细胞线粒体氧化磷酸化(OXPHOS)、ATP生成以及AKT/S6通路的磷酸化水平.本研究结果表明,敲低asct2可抑制HCC细胞的恶性行为.此外,asct2下调后的HCC细胞线粒体代谢以及AKT/S6通路的磷酸化水平也受到抑制,提示线粒体代谢失调以及AKT/S6通路的异常活化与HCC的进展密切相关.

关键词： asct2 肝细胞肝癌增殖侵袭代谢

正常妊娠和子痫前期胎盘Syncytin表达差异探讨

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中山大学学报（医学科学版） 2009年第2期30卷 211-214页

作者：赵杨韩凤珍刘益芬陈敦金广东省人民医院妇产科∥广东省医学科学院广东广州510080 广州医学院附属第三医院妇产科广东广州510150

【目的】探讨syncytin及其受体asct2在子痫前期(PE)和正常妊娠胎盘组织中的表达改变。【方法】纳入研究病人共37例,分为2组,PE组21例,正常对照组16例,采用定量RT-PCR方法检测syncytin及asct2 mRNA的转录水平,Western blot法测定syncyti... 详细信息

【目的】探讨syncytin及其受体asct2在子痫前期(PE)和正常妊娠胎盘组织中的表达改变。【方法】纳入研究病人共37例,分为2组,PE组21例,正常对照组16例,采用定量RT-PCR方法检测syncytin及asct2 mRNA的转录水平,Western blot法测定syncytin蛋白表达强度,比较两组较检测结果。【结果】两组均检测到syncytin mRNA、syncytin蛋白及asct2 mRNA,PE组胎盘syncytin mRNA水平(1.5±1.4)和蛋白表达强度(55.7±26.1)明显低于正常对照组(6.2±3.0,92.2±36.4,Pasct2 mRNA水平无明显差异(P>0.05)。【结论】胎盘组织syncytin表达下调与PE发病密切相关,其受体asct2与PE发生无相关性。

关键词：子痫前期 syncytin asct2

肿瘤坏死因子对谷氨酰胺促大鼠小肠蛋白质合成的影响及途径

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医学研究生学报 2013年第12期26卷 1244-1249页

作者：周济宏李幼生洪志坚胡心宝解伟光黎介寿南京军区南京总医院烧伤整形科南京医学博士210002 解放军普通外科研究所

目的谷氨酰胺(glutamine,Gln)需经过载体转运至细胞内才能被利用,感染状态下Gln疗效不佳。肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF-α)是感染中重要的调节因子,故研究TNF-α与Gln促蛋白质合成及其与Gln载体之间的关系对揭示感染状态下... 详细信息

目的谷氨酰胺(glutamine,Gln)需经过载体转运至细胞内才能被利用,感染状态下Gln疗效不佳。肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF-α)是感染中重要的调节因子,故研究TNF-α与Gln促蛋白质合成及其与Gln载体之间的关系对揭示感染状态下Gln代谢途径、提高疗效具有重要意义。文章研究TNF-α对Gln促大鼠小肠蛋白质合成及其对细胞膜Gln载体asct2mRNA、蛋白表达的影响,揭示TNF-α影响Gln促蛋白质合成的途径。方法 30只雄性SD大鼠按单纯随机法分3组:对照组、Gln组和TNF-α组。所有大鼠均行3 d全肠外静脉营养。对照组仅给予普通全肠外营养;Gln组给予添加丙氨酰谷氨酰胺二肽的肠外营养,Gln剂量为0.3 g/(kg·d),计72 h;TNF-α组给予添加丙氨酰谷氨酰胺二肽的肠外营养,并在第3天持续24h静脉滴注TNF-α,速度5μg/(kg·h)。所有大鼠均在取材前0.5h一次性静脉注射[L-15N]亮氨酸,剂量1.0 mmol/kg。实验结束时分别测定血浆TNF-α、Gln浓度、小肠Gln浓度、蛋白质合成率、asct2载体mRNA及蛋白表达水平。结果 TNF-α组血浆TNF-α浓度显著高于其他2组;TNF-α组血浆及小肠中Gln浓度最高;Gln组和TNF-α组小肠中蛋白质合成率均高于对照组,且Gln组最高;以上各组之间差异有统计学意义(Pasct2的mRNA及蛋白表达均显著低于其他2组(Pasct2的蛋白显著高于其他2组(P<0.01)。结论 TNF-α能够升高大鼠血浆及小肠中Gln的浓度,抑制Gln的促蛋白质合成作用,其途径是TNF-α抑制氨基酸载体的转运功能,Gln不能顺利进入细胞,导致组织蛋白质合成下降,这种抑制发生在翻译及以后水平。

关键词：肿瘤坏死因子-α Gln 全肠外营养蛋白质合成率 Gln载体 asct2

肠三叶因子减轻烧伤内质网应激促进肠上皮细胞谷氨酰胺转运的机制

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肠三叶因子减轻烧伤内质网应激促进肠上皮细胞谷氨酰胺转运的机制

作者：胡建红第三军医大学

学位级别：硕士

研究背景及目的大面积严重烧伤除了引起皮肤损毁之外还可导致多种内脏功能严重受损,其中胃肠道是烧伤后受损最为严重的器官之一。烧伤后缺血缺氧性损害是导致胃肠道受损的首要原因,缺血缺氧不仅直接导致胃肠道组织结构受损,还可因缺氧... 详细信息

研究背景及目的大面积严重烧伤除了引起皮肤损毁之外还可导致多种内脏功能严重受损,其中胃肠道是烧伤后受损最为严重的器官之一。烧伤后缺血缺氧性损害是导致胃肠道受损的首要原因,缺血缺氧不仅直接导致胃肠道组织结构受损,还可因缺氧造成的能量代谢障碍加重黏膜受损,抑制黏膜修复。相关研究表明,小肠所需的主要能源物质是谷氨酰胺(glutamine,Gln)而非葡萄糖。Gln能够促进肠黏膜修复,改善肠道功能。系列研究已证实,烧伤动物和患者给予Gln后能明显改善肠道能量代谢,促进ATP合成,进而减轻肠黏膜受损程度,促进黏膜修复,改善肠道功能。已有研究表明,严重创伤、感染及脓毒症等情况下,肠道对Gln的转运能力降低。烧伤属于严重创伤,有理由相信烧伤与创伤具有类似的病理生理变化。肠三叶因子(Intestinal trefoil factor,ITF)是杯状细胞分泌的肠道特异的生长因子,能减轻烧伤后肠黏膜损伤,但是否能改善烧伤后肠道对Gln的转运目前尚不清楚。本研究将着重探讨严重烧伤后肠上皮细胞对谷氨酰胺转运能力的变化规律以及ITF对其的影响,并探讨其分子机制。研究方法1.动物实验:将120只Sprague-dawley大鼠随机分为正常对照组(Control),烧伤对照组(Burn),烧伤+ITF治疗组(Burn+ITF)。所有大鼠均给予腹腔注射苯巴比妥钠(40mg/kg.weight)麻醉,然后皮下注射镇痛剂丁丙诺啡(0.05 mg/kg body weight),使用推毛机剃除背部和两侧体毛,露出30%体表面积以供烫伤。Control组大鼠置于37℃水浴中18秒模拟烫伤模型,其余各组大鼠置于97℃水浴中18秒制作30%体表面积Ⅲ°烧伤大鼠模型。伤后各组均立即腹腔注射乳酸林格液(40m L/kg.weight)复苏,烫伤大鼠置于烤温架待其苏醒,各组均给予正常饮食及饮水。Burn+ITF组于烫伤后6小时灌胃给予ITF(1mg/kg.d),其余各组灌胃等体积生理盐水。各组大鼠分别于烫伤后(post burn day,PBD)1、3、5、7天处死大鼠,取出小肠,提取大鼠小肠上皮细胞及其纹状缘囊泡。采用钙离子螯合法提取大鼠小肠上皮细胞(intestinal epithelial cells,IECs),采用Mg2+低温差速离心法制备大鼠小肠纹状缘囊泡(brush-border membrane viscles,BBMVs),同位素计数法检测通过IECs和BBMVs的[3H]-glutamine的放射性强度,计算出IECs和BBMVs对[3H]-Gln的转运率。采用透射电子显微镜观察BBMVs的形态学变化,western blot检测大鼠IECs中Gln转运载体asct2,BAT1及其相关调控蛋白表达量的变化。2.细胞实验:体外培养大鼠小肠上皮细胞株IEC-6,采用10%烧伤大鼠血清培养IEC-6模拟细胞烧伤模型。实验分为正常对照组(Control),烧伤对照组(Burn),烧伤大鼠血清与ITF(10μg/m L)共培养组(Burn+ITF),烧伤大鼠血清+ITF(10μg/m L)+Compound C(10μmol/L)共培养组(Burn+ITF+Cp C),烧伤大鼠血清+ITF(10μg/m L)+3-MA(5mmol/L)共培养组(Burn+ITF+3-MA),烧伤大鼠血清+ITF(10μg/m L)+16F16(10μmol/L)共培养组(Burn+ITF+16F16)。采用同位素计数法检测通过IEC-6的[3H]-glutamine的放射性强度,计算出IEC-6对Gln的转运率,western blot检测IEC-6中Gln转运载体asct2,BAT1及其相关调控蛋白表达量的变化。实验结果1.严重烧伤后大鼠IECs和BBMVs对Gln的转运能力均明显降低,其中Na+依赖性转运载体介导的Gln转运降低的幅度更为明显,非Na+依赖性载体转运Gln的变化趋势除伤后1-3天外,其他时相点均明显高于伤前。2.正常大鼠肠上皮细胞转运Gln的部位主要位于纹状缘,大约占总量的65%。严重烧伤后该比例大幅下降。肠上皮细胞以及BBMVs对Gln的转运主要依靠Na+依赖性载体,该载体在肠上皮细胞以及BBMVs中介导的Gln转运量分别占总转运量的75%和85%,烧伤后该比例降至55%和60%,降幅均达25%左右。3.给予ITF能够明显促进烧伤后大鼠IECs及BBMVs对Gln的转运。在两型转运载体中,ITF主要影响Na+依赖型转运载体的活性,对非Na+依赖型载体的影响则不明显。ITF提高了Na+依赖型Gln转运载体的活性,进而提高了肠上皮细胞和BBMVs中该型载体转运Gln所占的比例。4.严重烧伤后,BBMVs空间结构严重受损,表现为形态极不规则,囊泡破损,泡壁塌陷,边缘毛糙,镜下可见诸多囊泡破损碎片;给予ITF 5天能够明显改善BBMVs形态,直至给药7天,其形态已

关键词：烧伤谷氨酰胺肠三叶因子内质网应激自噬 AMPK asct2 B0AT1 PDI

异土木香内酯与靶向性化合物ZT-3抗肿瘤药效及其机制研究

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异土木香内酯与靶向性化合物ZT-3抗肿瘤药效及其机制研究

作者：杨晨广东药科大学

学位级别：硕士

第一部分,异土木香内脂具有一定的抗肿瘤作用,但是尚未见抗肺癌的研究报道,结合课题组之前对于筛选出来的抗肺癌靶标GSTA1的研究基础,对于异土木香内酯抗肺癌药效学及其与GSTA1相互作用的机制做深入的研究,旨在能够阐明异土木香内酯的... 详细信息

第一部分,异土木香内脂具有一定的抗肿瘤作用,但是尚未见抗肺癌的研究报道,结合课题组之前对于筛选出来的抗肺癌靶标GSTA1的研究基础,对于异土木香内酯抗肺癌药效学及其与GSTA1相互作用的机制做深入的研究,旨在能够阐明异土木香内酯的抗肿瘤作用机制,为开发出高效低毒抗肺癌药物提供理论依据。第二部分,选择在肿瘤部位富集分布、参与能量代谢、碳氮关键节点的非必需氨基酸谷氨酰胺作为靶向性载体,与三羧酸循环的第一个底物草酰乙酸偶联,达到调节肿瘤能量代谢进而产生广泛的抗瘤谱的靶向性化合物,设计合成出化合物ZT-3,并且对该化合物进行了抗肿瘤药效学评价以及从氨基酸转运体靶向性转运ZT-3到恶性肿瘤细胞的作用机制研究。第一部分实验异土木香内酯抗肺癌细胞株A549及其机制研究异土木香内酯是从土木香分离出来的中药单体,是一种常用的驱虫抗菌中药。许多报道表明,异土木香内酯具有抗肝癌等恶性肿瘤的药理活性。然而,其确切的作用机制尚不明确。研究目的:异土木香内酯对A549人肺腺癌细胞的抗癌作用及其作用机制材料和方法:1.用MTT法测定异土木香内酯对A549细胞以及人正常肺成纤维细胞MRC-5的细胞增殖的影响,检测异土木香内酯浓度为6.25μmol/L、12.5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L,并以顺铂20μmol/L为阳性对照组。2.采用H33258染色观察异土木香内酯对A549细胞形态学的影响,设定异土木香内酯浓度为6.25μmol/L、12.5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L,给药孵育48 h后观察凋亡细胞形态学变化。3.流式细胞术FITC-Annexin V/碘化丙啶PI双染检测异土木香内酯对A549细胞凋亡率和周期的影响,设定异土木香内酯浓度为6.25μmol/L、12.5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L。4.由于课题组之前研究确认肺癌相关靶标GSTA1,通过实时定量PCR和Western blot从基因表达和蛋白表达水平研究异土木香内酯抗肿瘤作用机制和GSTA1之间的关系,探索异土木香内酯是否通过GSTA1产生抗肿瘤作用。结果:1.发现异土木香内酯对A549细胞具有抗增殖作用,MTT测量IC50值为18.7μM,抗增殖作用具有时间和浓度依赖性,并且对于正常细胞MRC-5没有明显的抑制作用。2.H33258染色后在倒置荧光显微镜下观察可见A549细胞中凋亡小体占总细胞比例随着异土木香内酯浓度升高而增加,相反,不同浓度异土木香内酯并没有对MRC-5细胞显示出形态学变化。3.经流式细胞术分析,异土木香内酯使细胞周期S期的分布比例增加,凋亡率随着异土木香内酯浓度增加而增加。4.Western blot和实时定量PCR结果显示随着异土木香内酯浓度的增加,GSTA1的表达被下调,提示异土木香内酯药理作用机制可能是通过下调GSTA1的表达而发挥抗肿瘤效应。结论和创新点:这些结果表明,异土木香内酯的抗增殖作用特异性作用于癌细胞。异土木香内酯可以诱导A549细胞凋亡,细胞周期阻滞于S期。结合抗癌靶点GSTA1,异土木香内酯诱导A549细胞凋亡可能是通过下调GSTA1表达的手段。第二部分实验新型靶向性抗肿瘤化合物ZT-3的设计合成及药效学和机制研究抗肿瘤靶向化合物ZT-3从干扰恶性肿瘤肿瘤的能量代谢角度设计,选择谷氨酰胺为靶标,偶联关键底物草酰乙酸的化合物,达到靶向性地阻断恶性肿瘤的能力产生和利用而发挥抗肿瘤作用。研究目的:设计合成开发广谱的高效低毒的小分子靶向化合物ZT-3,评价其抗肿瘤药效学及作用机制。材料和方法:1.课题前期根据分子影像技术,确认谷氨酰胺在肿瘤部位会富集的基础之上,设计合成靶向性化合物ZT-3,HPLC监测合成反应打通合成路线,用LC-MS以及核磁共振进行ZT-3的结构表征,确定其纯度及化学结构。2.用SPF级昆明种小鼠在IVC条件下测定化合物ZT-3的LD50等急性毒性资料。3.根据LD50,设计出高剂量灌胃组、低剂量灌胃组、高剂量注射组、低剂量注射以及模型组、阳性药灌胃对照组、阳性药注射对照组,将受试动物随机分为七组,采用裸鼠腋下移植肿瘤为模型,以肿瘤生长抑制率为指标,检测ZT-3对荷瘤裸鼠的肿瘤生长抑制作用进行药效学评价。4.在确认其药效显著后,对于ZT-3的药效学机制做了初步研究,以氨基酸的钠离子依赖性氨基酸转运体asct2作为研究对象,运用RT-PCR以及western blotting研究其asct2表达量是否与ZT-3的靶向性转运和抗肿瘤药效学机制有关。结果:结果表明,ZT-3对于肺癌细胞株荷瘤裸鼠具有非常良好的疗效,药效最好剂量组肿瘤质量抑制率达到70.03%。检测肿瘤组织asct2的表达量,实验结果表明,随着ZT-3浓度的增加,asct2的表达量增加,ZT-3可以促进转运体的表达并且具有剂量依赖性。结论和创新点:1.

关键词：异土木香内酯靶向性化合物ZT-3 抗肿瘤药效学 GSTA1 asct2