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黑曲霉1504产葡萄糖氧化酶的ARTP诱变、产酶条件优化及改良面粉品质研究

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中国食品学报 2019年第2期19卷 90-97页

作者：朱运平褚文丹黎芳郦金龙许丽亚李秀婷北京食品营养与人类健康高精尖创新中心(北京工商大学) 北京100048 北京市食品添加剂工程技术研究中心(北京工商大学) 北京100048 北京工商大学食品学院北京100048 食品质量与安全北京实验室(北京工商大学) 北京100048

用新型诱变方法——常温、常压等离子体诱变(artp)对产葡萄糖氧化酶(GOD)菌株黑曲霉1504进行诱变育种,并通过响应面分析法优化产酶条件,将所得GOD用于面粉品质改良。通过ARTP诱变,获得酶活力提高较大的正突变菌株12株,其中2株菌株A117、... 详细信息

用新型诱变方法——常温、常压等离子体诱变(artp)对产葡萄糖氧化酶(GOD)菌株黑曲霉1504进行诱变育种,并通过响应面分析法优化产酶条件,将所得GOD用于面粉品质改良。通过ARTP诱变,获得酶活力提高较大的正突变菌株12株,其中2株菌株A117、A158的产酶活力提至原始菌株的3.17倍和3.31倍,分别达到172.72 U/mL和180.74 U/mL。通过响应面分析得到优化的发酵条件:葡萄糖110.28 g/L、牛肉蛋白胨5 g/L、硝酸钠5 g/L、碳酸钙37.89 g/L、KCl 0.5 g/L、KH2PO42 g/L、MgSO4·7H2O 0.7 g/L, pH值自然。接种量为0.05(V/V,3×106个孢子/mL),30℃下培养4 d,产酶活力达到373.24 U/mL,是优化前的2.02倍,属国内较高的胞外葡萄糖氧化酶生产水平。GOD对面粉品质改良的研究表明,适量添加GOD的面粉吸水率、形成时间、稳定时间及粉质指数都有所增加,面团拉伸阻力明显增大,延伸度有所下降,说明面粉性质得到改良。

关键词：葡萄糖氧化酶 ARTP诱变产酶条件优化面粉品质

产蛋白酶菌株的ARTP诱变及其降解蛋白质代谢通路分析

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产蛋白酶菌株的ARTP诱变及其降解蛋白质代谢通路分析

作者：张雯姝辽宁师范大学

学位级别：硕士

本文首先从辽宁省大连市中佳食品有限公司附近的土壤中筛选得到一株产蛋白酶活性较高的菌株,然后对其进行常压室温等离子体诱变技术(Atmospheric and Room Temperature Plasma,artp),使其产蛋白酶的活性显著提高。在对该菌株最佳产酶条... 详细信息

本文首先从辽宁省大连市中佳食品有限公司附近的土壤中筛选得到一株产蛋白酶活性较高的菌株,然后对其进行常压室温等离子体诱变技术(Atmospheric and Room Temperature Plasma,artp),使其产蛋白酶的活性显著提高。在对该菌株最佳产酶条件进行优化的基础上,本文运用基因组学联合转录组学技术,通过分析比较ARTP诱变育种前后该菌株与蛋白质降解相关的基因、主要代谢通路及关键酶的差异,探讨了该菌株降解蛋白质的代谢通路。具体研究成果如下:1.从蛋白质含量高的土壤中分离得到10株产蛋白酶的菌株,利用透明圈法和福林酚法通过测定该菌株产蛋白酶的活性,筛选得到一株产蛋白酶活性较高的菌株Y-6。对该菌株进行ARTP诱变后,得到一株高产蛋白酶的菌株Y-6-NEW。实验结果显示,菌株Y-6-NEW在酪蛋白培养基中培养72 h后,其产蛋白酶的活性由诱变前的252.16 U/mL提高到658.15 U/mL,产酶活性提高了161%。经鉴定,该菌株为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)。2.利用单因素试验与Box-Behnken响应面试验,对诱变后的菌株Y-6-NEW的产酶条件进行优化。结果显示,菌株Y-6-NEW的最佳产酶条件为:酪蛋白含量为2%、NaCl浓度为4%、装液量为2%、培养温度为28℃、接种量为4%、pH值为7、发酵时间为3d,在该条件下,菌株Y-6-NEW产蛋白酶活性最大可达到1288.27U/mL,较优化前的菌株提高了48.91%。3.采用高通量测序(Illumina)平台对菌株Y-6的全基因组进行测定分析。结果显示,菌株Y-6的基因组大小为5,694,983bp,GC含量为34.95%,包含5856个蛋白质编码基因。KEGG注释结果显示,菌株Y-6基因组与蛋白质降解相关的基因463个,这些基因主要编码与蛋白质降解有关的酶,如丝氨酸蛋白酶degP/htrA,锌离子蛋白酶ppqL,细胞间质锌离子蛋白酶2 ppqL2,ATP依赖的蛋白酶ClpB,碱性丝氨酸蛋白酶aprA等;肽酶(S54家族成员)aarA,氨基肽酶pepP,二肽酶D pepD,脯氨酸亚氨基肽酶pip,亮氨酰氨基肽酶CARP/pepA,锌羧肽酶样蛋白yjgH等,这些基因的存在表明菌株Y-6具有良好的蛋白质降解能力。4.通过ARTP诱变育种使得菌株Y-6蛋白质降解的能力大幅度提高,采用高通量测序(Illumina)平台对诱变前后的菌株Y-6进行转录组测序,分析诱变前后菌株Y-6基因表达水平的变化。结果显示,菌株Y-6在ARTP诱变前后共有1095个差异显著基因,其中上调基因692个,下调基因403个。参与蛋白质降解过程中的ppqL2基因(编码细胞间质锌离子蛋白酶2),ppqL基因(编码锌离子蛋白酶),aprA基因(编码碱性丝氨酸蛋白酶),aarA基因(肽酶,S54家族成员),pepP基因(编码氨基肽酶),pepD(编码二肽酶D)上调倍数明显,上调倍数分别为4.15,1.59,1.78,2.61,1.59,1.52倍,诱变后的菌株Y-6-NEW可能通过增强蛋白酶、肽酶基因的表达水平,增强菌株降解蛋白质的能力。随后,我们将差异基因进行GO功能富集分析和KEGG功能富集分析。GO注释差异基因结果显示,菌株Y-6在生物过程中富集到279个差异显著基因,其中有41个与蛋白质代谢相关。KEGG分析结果显示,差异基因主要富集在苯丙氨酸,谷氨酸,组氨酸代谢通路等代谢通路。其中,苯丙氨酸代谢通路中编码D-氨基酸脱氢酶的基因dadA上调了2.41倍,编码2-乙酰辅酶A异构酶基因paa G上调了2.73倍;丙氨酸、天冬氨酸谷氨酸代谢通路中编码1-吡咯啉-5-羧酸脱氢酶基因putA上调了2.7倍;组氨酸代谢通路中编码咪唑啉酮丙酸酶的基因hut I上调了3.93倍,编码组氨酸脱氨酶的基因hutH上调了3.87倍。综上所述,菌株Y-6-NEW可能通过上调锌离子蛋白酶ppqL,碱性丝氨酸蛋白酶aprA,ATP依赖的蛋白酶ClpB等蛋白酶的表达量,首先将蛋白质水解形成多肽;随后被肽酶进一步水解生成苯丙氨酸、丙氨酸、组氨酸等不同种类的氨基酸;不同种类的氨基酸进入氨基酸分解代谢通路进行进一步降解,通过上述途径完成蛋白质的降解过程。

关键词：高效蛋白降解菌 ARTP诱变产酶条件基因组学转录组学

基于ARTP诱变育种制备优质曲种及其生产富含GABA红曲米粉的研究

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基于ARTP诱变育种制备优质曲种及其生产富含GABA红曲米粉的研究

作者：吴安琪中南林业科技大学

学位级别：硕士

红曲米富含天然色素及莫纳可林K等物质,是一种安全的、天然的药食同源物,已被广泛的应用于食品、药品、化工等行业。在当今这个重视健康的社会,人们不再满足于基本营养需求,而是更多关注对健康有利的功能食品。功能红曲米产品的研发促... 详细信息

红曲米富含天然色素及莫纳可林K等物质,是一种安全的、天然的药食同源物,已被广泛的应用于食品、药品、化工等行业。在当今这个重视健康的社会,人们不再满足于基本营养需求,而是更多关注对健康有利的功能食品。功能红曲米产品的研发促进了我国功能保健食品的发展,红曲米不仅可以代替化学添加剂,而且还具有促进健康的功能性物质。γ-氨基丁酸（GABA）具有降血压、镇定、神经传递等生物活性,在功能食品研发的相关研究中备受关注。因此,本课题针对红曲米中GABA含量低、生产过程强度大、生产效率低等实际生产问题,进行了高产GABA的菌株诱变育种、优质曲种的制备、优质红曲米粉产品的研发等相关研究,具体如下:1.高产GABA红曲霉菌的育种。对于红曲霉产GABA不稳定及产量低等问题,本研究通过室温常压等离子体（artp）物理诱变红曲霉,筛选出了一株突变红曲菌株M162,并对其进行了传代稳定性考察、初步高产GABA的分子机制探讨及分子生物学鉴定。最佳诱变条件为:诱变功率120 W,诱变气流量10 SLM,载片距离2 mm,在此条件下探讨了红曲霉孢子存活率和诱变时间的关系,最终确定了存活率在10%的时间——120 s作为最佳处理时间。以紫色红曲霉菌M-1为出发菌株,经ARTP诱变,得到一株高产GABA的突变菌命名为M162,能利用大米培养基发酵产生15.10 mg/g的GABA,相比于亲本菌株提高了 155.93%,经5代传代培养平均GABA产量为14.9 mg/g,证明突变株M162具有良好的遗传稳定性;进一步,采用真菌通用引物ITS4/5对其进行分子生物学鉴定,确定突变株M162为紫色红曲（Monascus purpureus）,且通过实时荧光定量PCR探讨了 9个与产GABA相关基因中有8个上调,其中GAD基因显著上调2.44倍,因此突变株M162高产GABA的原因是由于其相关基因的相对表达量上调。2.基于响应面优化制备优质曲种。我们通过单因素实验和Box-Behnken响应面设计实验,优化了红曲曲种培养基及培养工艺,制备出生产富含GABA红曲米的优质母曲。考察了原料选择对曲种活孢子数的影响。结果显示,单因素试验中糙米粉为原料时,曲种活孢子数最多,为2.7×105个/g;当再添加燕麦、麸皮、黄豆粉与糙米按1:9复配时,活孢子数分别达到1.5×106个/g、1.7×106个/g、1.75×106个/g,糖化力分别为2625 U/g、2800 U/g、2450 U/g。综合考虑,确定了以糙米:麸皮质量比为9:1作为曲种原料配比。进一步,单因素实验考察了种子液接种量、翻曲时间及培养时间三个因素,当添加20%的种子液时,活孢子数提高到1.2×107个/g;当翻曲时间为12h时,活孢子数提高到了 3.6×106个/g;当培养时间为7d时,活孢子数提高到了 4.0×106个/g。根据上述结果,再利用响应面设计对制曲工艺进行优化,得到最佳优质曲种培养基及条件为:糙米:麸皮质量比=9:1、接种量为21.5%、翻曲时间为9.06 h、培养时间为7.19 d,为了方便实际操作,将条件修改为糙米:麸皮质量比=9:1、接种量为21.5%、翻曲时间为9 h、培养时间为7.20d,在修改后的最佳条件下,验证曲种的活孢子数为4.15×107个/g,为预测值的94.75%。3.富含GABA红曲米粉产品的研发。将亲本菌株红曲霉M-1和突变菌株红曲霉M162优化后的糙米麸皮曲种分别接种到大米粉中,发酵制备了一款符合各项标准的功能性红曲米粉。M162红曲米粉质量分别为GABA 15.93mg/g、色价170 U/g、桔霉素和莫纳可林K未检出、生产时间为8天,相比与M162大米曲接种的红曲米粉,GABA含量提高了 14.6%、色价提高了 21.4%、桔霉素和莫纳可林K含量无变化、生产效率提高了 11.1%;M-1红曲米粉质量分别为GABA 5.9 mg/g、色价239 U/g、桔霉素44 ug/g、莫纳可林K含量2 ug/g,相比与M-1大米曲接种的红曲米粉,GABA含量提高了 18%、色价提高了 19.5%、莫纳可林K含量提高了 50%、桔霉素含量减少了 26.2%、生产效率提高了 11.1%。

关键词：红曲 ARTP诱变 GABA 曲种响应面优化功能性红曲米粉

ARTP诱变法分析深海微杆菌Microbacterium sediminis YLB-01的耐压耐冷机理

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应用海洋学学报 2021年

作者：邱旭许薷方魏士平汤熙翔中国地质大学(北京)海洋学院自然资源部第三海洋研究所

深海微生物由于长期生活在高压、低温、黑暗、寡营养的极端环境中, 必然会发展出与之相应的分子基础。近年来, 对深海微生物极端环境适应性机理的研究是深海微生物研究的前沿课题。通过对一株耐冷、耐压的深海沉积微杆菌Microbacterium ... 详细信息

深海微生物由于长期生活在高压、低温、黑暗、寡营养的极端环境中, 必然会发展出与之相应的分子基础。近年来, 对深海微生物极端环境适应性机理的研究是深海微生物研究的前沿课题。通过对一株耐冷、耐压的深海沉积微杆菌Microbacterium sediminis YLB-01进行ARTP诱变, 成功获得了对低温和高压敏感的突变子9-3E5, 突变子9-3E5与野生型菌株的基因组比较分析结果表明, SNP和InDel在突变子9-3E5全基因组上分布均匀, 838个SNP位点位于编码区且为非同义突变, 占总SNP数量的77.45%；27个InDel中11个位于编码区且发生了移码突变；突变子9-3E5共有11条SV序列, 长度300～400 bp的序列占比为81.82%。以OR值＞2、p<0.05 为标准对突变基因进行富集, 共富集到三个相关的功能集。与细胞分裂相关的蛋白中发现了11个SNP突变位点, 主要涉及细胞分裂蛋白FtsI、FtsW、FtsX和细胞分裂起始蛋白；与DNA修复、合成相关的6个基因中发现了10个SNP突变位点；与胞内运输和能量合成调控相关的2个基因中发现了3个SNP突变位点。我们推测细胞分裂、DNA损伤修复及合成、胞内运输对能量合成的影响这三类功能基因发生改变可能是突变子9-3E5相对于野生株YLB-01低温、高压耐受性改变的原因, M. sediminis YLB-01通过调节这些胞内的生理生化过程来应对外界低温和高压环境。

关键词：海洋生物学 ARTP诱变适应性机制低温高压

ARTP诱变法分析深海沉积微杆菌Microbacterium sediminis YLB-01的耐压耐冷机理

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应用海洋学学报 2021年第3期40卷 437-446页

作者：邱旭许薷方魏士平汤熙翔中国地质大学(北京)海洋学院北京100083 自然资源部第三海洋研究所福建厦门361005

深海微生物由于长期生活在高压、低温、黑暗、寡营养的极端环境中,必然会发展出与之相应的分子基础。近年来,对深海微生物极端环境适应性机理的研究是深海微生物研究的前沿课题。通过对一株耐冷、耐压的深海沉积微杆菌Microbacterium se... 详细信息

深海微生物由于长期生活在高压、低温、黑暗、寡营养的极端环境中,必然会发展出与之相应的分子基础。近年来,对深海微生物极端环境适应性机理的研究是深海微生物研究的前沿课题。通过对一株耐冷、耐压的深海沉积微杆菌Microbacterium sediminis YLB-01进行ARTP诱变,成功获得了对低温和高压敏感的突变子9-3E5,突变子9-3E5与野生型菌株的基因组比较分析结果表明,SNP和InDel在突变子9-3E5全基因组上分布均匀,838个SNP位点位于编码区且为非同义突变,占总SNP数量的77.45%;27个InDel中11个位于编码区且发生了移码突变;突变子9-3E5共有11条SV序列,长度为300~400 bp的序列占比为81.82%。以OR值>2、p<0.05为标准对突变基因进行富集,共富集到3个相关的功能集。在与细胞分裂相关的蛋白中发现了11个SNP突变位点,主要涉及细胞分裂蛋白FtsI、FtsW、FtsX和细胞分裂起始蛋白;在与DNA修复、合成相关的6个基因中发现了10个SNP突变位点;在与胞内运输和能量合成调控相关的2个基因中发现了3个SNP突变位点。我们推测细胞分裂、DNA损伤修复及合成、胞内运输对能量合成的影响这3类功能基因发生改变可能是突变子9-3E5相对于野生株YLB-01低温、高压耐受性改变的原因,M.sediminis YLB-01通过调节这些胞内的生理生化过程来应对外界低温和高压环境。

关键词：海洋生物学 ARTP诱变适应性机制低温高压

一株高产纳豆激酶菌株的ARTP诱变育种及培养基的优化

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中国农学通报 2023年第9期39卷 115-122页

作者：潘冬梅张心青杨传伦田杰伟王红霞杨丹丹郭南南于帅帅韩立霞马春峰部丽群蔡倩倩郭中瑞黄河三角洲京博化工研究院有限公司山东滨州256500 山东京博控股集团有限公司山东滨州256500

旨在提高纳豆激酶发酵水平,扩大其作为新型的纤溶药物的生产应用。利用常温室压等离子体(artp)技术对一株产纳豆激酶的野生菌株P进行诱变;筛选获得一株具有稳定遗传性能的纳豆激酶优势突变株P501,纳豆激酶活力比野生菌株提高了1.02倍,... 详细信息

旨在提高纳豆激酶发酵水平,扩大其作为新型的纤溶药物的生产应用。利用常温室压等离子体(artp)技术对一株产纳豆激酶的野生菌株P进行诱变;筛选获得一株具有稳定遗传性能的纳豆激酶优势突变株P501,纳豆激酶活力比野生菌株提高了1.02倍,通过单因素实验、响应面实验对P501产纳豆激酶的发酵培养基进行优化,得到最佳发酵培养基为:葡萄糖30 g/L、玉米粉40 g/L、豆粕粉30 g/L、Na_(2)HPO_(4)3 g/L、K2HPO40.3 g/L、MgSO40.6 g/L、CaCl_(2)0.63 g/L、丝氨酸0.07 g/L、豆油0.61 g/L,经过验证实验,纳豆激酶活力最高为9691 Fu/mL,较基础发酵培养基提高了6.68倍。

关键词：纳豆激酶 ARTP诱变单因素实验响应面实验培养基优化

γ-聚谷氨酸测定方法及其高产菌株ARTP诱变选育的研究

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γ-聚谷氨酸测定方法及其高产菌株ARTP诱变选育的研究

作者：王利安徽工程大学

学位级别：硕士

γ-聚谷氨酸（γ-polyglutamic acid,γ-PGA）是由谷氨酸单体聚合而成的阴离子型多聚物,具有可食性、吸水性、保水性、生物可降解性、可螯合金属离子、无毒和环境友好等特性,广泛用于医药、食品、农业、环境保护和护肤品等领域。目前,γ... 详细信息

γ-聚谷氨酸（γ-polyglutamic acid,γ-PGA）是由谷氨酸单体聚合而成的阴离子型多聚物,具有可食性、吸水性、保水性、生物可降解性、可螯合金属离子、无毒和环境友好等特性,广泛用于医药、食品、农业、环境保护和护肤品等领域。目前,γ-PGA研究主要存在的问题有检测效率低下或准确度不高,菌株生产效率不高等。这在一定程度上增加了γ-PGA的生产成本,限制了γ-PGA进一步开发应用。为此,本文旨在建立一种检测准确、步骤简单的γ-PGA含量检测方法,并通过ARTP诱变选育出一株高产γ-PGA的菌株,以达到提高γ-PGA的产量并降低生产成本的目的。另外,基于前期发现纳豆激酶（NK）等蛋白副产物对γ-PGA生产可能存在抑制的预研结果,本文进行了合成融合片段的研究,为基于基因敲除构建NK缺陷菌,进而为提高γ-PGA的产量奠定基础。主要研究内容如下:（1）基于Cu2+络合原理,建立了一种γ-PGA的高效检测方法。测定条件优化,结果显示在Cu2+浓度3mg/mL,反应时间30min,反应温度15℃,反应pH7.5的条件下,检测效果最佳,其平均回收率为95.82%,平均相对偏差为0.18。红外光谱分析表明Cu2+与γ-PGA的羧基氧发生了配位。对紫外分光光度法、称重法与Cu2+络合检测法比较分析发现,精确度及回收率从高到低依次为Cu2+络合检测法、紫外分光光度法和称重法,表明Cu2+络合检测法准确有效。（2）通过多种方法（固体平板、酪蛋白板、血纤维蛋白板、形态观察、16S rDNA序列分析、进化树分析及aprN基因筛选法）,鉴定筛选菌株MA1为B.subtilis natto（Bacillus subtilis natto）。通过酪蛋白板圈径比、孔板和摇瓶发酵筛选,确定最佳平板检测时间为24 h,24微孔板与摇瓶筛选的相关性较好（R2约0.98）,可代替摇瓶进行突变菌的发酵培养。经过5轮ARTP诱变选育出一株γ-PGA高产菌株B.subtilis natto mMA8,其γ-PGA产量达到9.22 g/L,较出发菌株提高了 22%,传代培养（5代）证明其遗传稳定性良好。经过对诱变菌圈径比和γ-PGA产量比较,发现圈径比与γ-PGA产量多数呈正比,样本量为24个,R2值为0.64,可认为两者之间存在线性关系。（3）aprN基因与敲除框的融合PCR研究。敲除框左臂、右臂和lox序列最佳PCR退火温度依次为66.7℃、66.7℃和56.9℃。方法一扩增融合片段,第一轮最佳退火温度为49℃,第二轮为58℃。方法二扩增融合片段,48.9℃作为左臂和lox序列、lox序列和右臂共同的退火温度,56.8℃作为敲除框片段的最佳退火温度。结果表明,方法二比方法一扩增融合片段效果好。本研究建立的新型Cu2+络合检测法为准确定量检测γ-PGA提供了工具,为后续γ-PGA高效生产菌株的筛选奠定了基础。筛选获得了一株较出发菌株高产的γ-PGA产生菌,有力促进了γ-PGA的高效生产。aprN基因及敲除框融合PCR的研究为敲除NK基因,解除其对γ-PGA生产的抑制奠定了基础。本研究对γ-PGA的生产具有重要的理论意义与参考价值。

关键词： γ-PGA 检测方法纳豆菌 ARTP诱变融合PCR

基于ARTP诱变与MMC结合选育L-组氨酸产生菌株

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基于ARTP诱变与MMC结合选育L-组氨酸产生菌株

作者：邓磊华南理工大学

学位级别：硕士

L-组氨酸是含有咪唑基团的重要功能性氨基酸,因其具有免疫调节、抗氧化和抗炎等多种生理功能,被广泛用于食品,饲料,医药等行业。但由于L-组氨酸的生物合成途径较长、调控机制复杂,仅通过系统性代谢工程从头改造菌株难度大且短时间内L-... 详细信息

L-组氨酸是含有咪唑基团的重要功能性氨基酸,因其具有免疫调节、抗氧化和抗炎等多种生理功能,被广泛用于食品,饲料,医药等行业。但由于L-组氨酸的生物合成途径较长、调控机制复杂,仅通过系统性代谢工程从头改造菌株难度大且短时间内L-组氨酸产量提高并不明显。选育氨基酸结构类似物抗性突变株获得氨基酸产生菌株,仍然是目前氨基酸发酵常规育种的有效方法。然而筛选L-组氨酸产生菌株的工作量大,本研究旨在提高L-组氨酸产生突变菌株的筛选效率。具体研究内容及结果如下:(1)通过ARTP诱变处理野生型谷氨酸棒杆菌ATCC 14067,确定了菌株最佳处理时间为210 s,致死率为93.26%。然后通过全自动高通量微生物液滴培养系统(MMC)结合平板选育组氨酸结构类似物的抗性突变株。使用48孔板发酵初筛及摇瓶发酵复筛,最终从耐受两种组氨酸结构类似3-氨基-1,2,4-三氮唑10 g/L和D-组氨酸8 g/L的抗性突变株中筛选到菌株Cg-F4,该菌株L-组氨酸积累量可达0.561±0.016 g/L,并且传代7次之后,该菌株的L-组氨酸产量可稳定在0.55 g/L左右。(2)为进一步提高L-组氨酸产生菌株的筛选效率,建立了基于L-组氨酸稀有密码子标记与液滴微流控设备相结合的筛选方法。首先通过将两种荧光报告基因egfp和m Cherry序列中编码L-组氨酸的常用密码子CAC全部替换成稀有密码子CAT,发现替换之后的报告基因egfp-RC9和m Cherry-RC6表达水平都显著低于原始基因。并且由于egfp报告基因在L-组氨酸稀有密码子替换数量上的优势。选择egfp-RC9与egfp进行了L-组氨酸回补实验,发现随着L-组氨酸浓度的增加,携带egfp标记的细胞荧光强度没有显著变化,然而携带egfp-RC9标记的细胞荧光强度有显著提高,表明带有egfp-RC9的表达对L-组氨酸的浓度有依赖性,初步验证了egfp-RC9筛选标记的可行性。因此将egfp-RC9标记筛选物导入含有多重结构类似物抗性表型的突变株中,通过MMC将带有标记筛选物的突变菌株生成若干液滴,同时在线观察各个液滴间的荧光变化情况。随着培养时间的增加,各个液滴间的荧光增加速率差异逐渐显现。根据荧光增加速率差异提取液滴摇瓶发酵检测L-组氨酸含量。最后将对应液滴的荧光增加速率与所测得的L-组氨酸浓度进行拟合,确定了液滴的荧光增加速率与胞外L-组氨酸浓度的相关性(r=0.9101;R=0.7853),同时筛选到菌株Cg-DL,该菌株产L-组氨酸量为1.299±0.083 g/L。本论文通过将ARTP诱变与MMC结合选育结构类似物抗性突变株,并且建立了基于L-组氨酸稀有密码子标记与液滴微流控设备相结合的筛选方法,提高了抗性突变株的筛选效率,最终获得了具有稳定表现的L-组氨酸产生菌,可为其他氨基酸或者其他代谢产物的产生菌株筛选提供良好的借鉴。

关键词： L-组氨酸谷氨酸棒杆菌 ARTP诱变 MMC 稀有密码子标记

利用木糖产乙醇酵母菌的ARTP诱变选育及应用研究

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利用木糖产乙醇酵母菌的ARTP诱变选育及应用研究

作者：张立钊湖南农业大学

学位级别：硕士

植物纤维资源是最具潜力的乙醇生产原料,也是一种丰富的生物质资源,但是目前除少量用于纺织、造纸、建筑等行业,或用作薪柴(热效率仅为10%左右)、粗饲料,另外相当大一部分未能得到充分利用。植物纤维水解产物更多的以低聚木糖或木糖的... 详细信息

植物纤维资源是最具潜力的乙醇生产原料,也是一种丰富的生物质资源,但是目前除少量用于纺织、造纸、建筑等行业,或用作薪柴(热效率仅为10%左右)、粗饲料,另外相当大一部分未能得到充分利用。植物纤维水解产物更多的以低聚木糖或木糖的形式存在,易于被微生物利用,经微生物发酵产生代谢产物,并可将其转化为乙醇或其他高附加值、多元化的产品。研究报道自然界中有少数种类的酵母菌能够利用木糖产乙醇,然而野生酵母乙醇产率低。近年来发展的常压室温等离子体(artp)诱变育种技术,由于集合了电子、离子、光子、激发态中性粒子、自由基、紫外辐射等诸多可能的生物诱变因素,因而在生物育种方面显示出了较大的应用潜力。本研究在自然分离筛选酵母菌株的基础上,着力于应用新型ARTP诱变育种技术选育利用木糖且发酵高产乙醇的优良酵母菌菌株,并以此作为生产菌种,木糖提取液为原料进行乙醇发酵试验,对其应用效果加以验证。以期获得优良菌株高效利用木糖,提升农副产品的利用率以及附加值,进一步开发新产品。笔者为此开展了相关研究工作,主要结果如下:(1)利用木糖产乙醇酵母菌的分离、筛选及鉴定从多种样品中分离得到利用木糖产乙醇酵母菌126株,通过采用多种方式比较其发酵产乙醇能力,得到5株乙醇产量相对较高的野生酵母菌A25、A42、A64、A70、A95。其中乙醇产量最高的为A42,28℃,160 r/min条件下发酵60 h乙醇含量为13.93 g/L。对5株分离菌株进行形态学及分子生物学鉴定可知,它们分别为季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii,A25)、异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus,A42)、异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus,A64)、异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus,A70)和异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus,A95)。比较5个菌株的特性,选取A25、A42进行后续试验。(2)A25、A42菌株的ARTP诱变选育对季也蒙毕赤酵母A25、异常威克汉姆酵母A42进行驯化培养,驯化后的A25、A42酵母菌菌株发酵的乙醇含量分别提高了15.06%、17.58%。通过ARTP诱变处理条件的探究,确定菌悬液浓度数量级10个/m L、诱变处理时间120 s为最佳诱变条件,在该条件下对两株酵母菌菌株A25、A42进行诱变,此时致死率分别达到95.00%、97.53%。随后,对分离的1000个突变菌株,采用杜氏小管发酵法和TTC比色法进行两轮筛选,对保留的57个突变菌株进行液态发酵,采用气相色谱法测定代谢产物乙醇含量并进行比较,最后筛选得到乙醇产量最高的菌株A25-55和A42-338,其乙醇产量分别为16.58±0.38 g/L和20.65±0.15 g/L,较亲本菌株分别提高了50.27%、41.75%。最终以异常威克汉姆酵母A42-338(Wickerhamomyces anomalus,A42-338)为本研究筛选得到的目标菌株开展遗传稳定性试验,且传代8次各代乙醇产量变化率不超过2%,具有较好的遗传稳定性。(3)异常威克汉姆酵母A42-338的应用研究首先采用响应面法开展了酶法处理油茶籽壳制备木糖提取液工艺的优化,最终优化的酶解条件为木聚糖酶添加量5%、酶解时间10 h、酶解温度49℃、底物浓度20 g/L。此优化条件下,木糖浓度为11.63 g/L,葡萄糖浓度为3.32 g/L。通过油茶籽壳木糖提取液与葡萄糖配比优化试验,将木糖提取液用葡萄糖复配成木糖:葡萄糖为1:3 g/g的发酵培养基,接种异常威克汉姆酵母A42-338的种子液,28℃,160r/min发酵60h乙醇产量最高,其乙醇含量为19.88 g/L,还原糖残糖含量为9.06 g/L,其中木糖残糖含量为1.79 g/L,葡萄糖残糖含量为7.27 g/L,木糖利用率为84.61%,葡萄糖利用率为81.05%,糖转化率为0.3976 g乙醇/g糖。异常威克汉姆酵母A42-338能应用于油茶籽壳木糖提取液及葡萄糖的混合糖乙醇发酵生产。

关键词： ARTP诱变酵母菌油茶籽木糖乙醇