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东北农业大学学报 2021年第1期52卷 46-53页

作者：高学军王璐璐祁昊王哲甄贞东北农业大学生命科学学院哈尔滨150030

肌肉细胞蛋白质合成能力与畜禽产肉量性状有关,试验旨在探究转录因子AT富集区4b(AT-rich interaction domain 4b,arid4b)对牛磺酸(Taurine,Tau)调节成肌细胞C2C12蛋白质合成的影响。向体外培养C2C12细胞培养液中分别添加0、60、120、180... 详细信息

肌肉细胞蛋白质合成能力与畜禽产肉量性状有关,试验旨在探究转录因子AT富集区4b(AT-rich interaction domain 4b,arid4b)对牛磺酸(Taurine,Tau)调节成肌细胞C2C12蛋白质合成的影响。向体外培养C2C12细胞培养液中分别添加0、60、120、180和240μmol·L^(-1) Tau,采用bCA(bicinchoniic acid)蛋白定量试剂盒和SUnSET法分别检测细胞总蛋白质含量和蛋白质合成速率,采用Western blot检测细胞中蛋白质合成相关信号通路分子mTOR磷酸化变化。进一步检测添加最适浓度Tau同时转染siRNA敲低arid4b对mTOR磷酸化和mTOR mRNA水平的影响。结果表明,Tau以剂量依赖性方式促进C2C12细胞蛋白质合成。当Tau浓度为120μmol·L^(-1)时,蛋白质合成总量、蛋白质合成速率和mTOR磷酸化水平达到峰值,后逐渐下降。Tau显著促进arid4b蛋白表达,敲低arid4b后,细胞蛋白质合成以及mTOR磷酸化水平显著降低,敲低arid4b也显著抑制Tau对蛋白质合成、mTOR磷酸化以及mTOR mRNA表达促进作用。综上,arid4b通过正向调节mTOR mRNA表达促进mTOR磷酸化,调节C2C12细胞中蛋白质合成。

关键词： C2C12 牛磺酸 mTOR 蛋白质合成 arid4b

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Effects of Different siRNA Transfection Methods on Expression of arid4b in HepG2 Cells

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Medicinal Plant 2020年第2期11卷 44-46页

作者： Xiaohui WANG Mingyu GONG Chengde Medical University Chengde 067000 China

[Objectives]This study aimed to optimize the siRNA transfection method for arid4b gene and lay a foundation for further study on the effect of arid4b low expression on the biological function of liver cancer cells HepG2.[Methods]HepG2 cells were cultured for 0,4 and 24 h,respectively and then transfected with arid4b targeting *** mRNA expression of arid4b gene was detected by RT-qPCR,and the protein expression was detected by Western blot.[Results]When HepG2 cells were transfected at 0 h after seeding,the expression of arid4b was the lowest in both mRNA and protein levels,that is,the inhibition effect was the best.[Conclusions]Transfection at different time points after seeding of HepG2 cells had different inhibition effect on the expression of *** at 0 h after seeding showed the best inhibition effect.

关键词： siRNA HepG2 cell arid4b Transfection method

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arid4b介导牛磺酸促进成肌细胞C2C12蛋白质合成和细胞增殖的分子机理

ARID4B介导牛磺酸促进成肌细胞C2C12蛋白质合成和细胞增殖的分子...

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作者：王璐璐东北农业大学

学位级别：硕士

氨基酸作为一种外源信号分子,可以通过激活磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol3-kinase,PI3K)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,m TOR)等信号途径,调控细胞增殖和蛋白质合成。牛磺酸(Taurine,Tau)是一种β-... 详细信息

氨基酸作为一种外源信号分子,可以通过激活磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol3-kinase,PI3K)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,m TOR)等信号途径,调控细胞增殖和蛋白质合成。牛磺酸(Taurine,Tau)是一种β-氨基磺酸,是机体内含量最丰富的自由氨基酸,在肌肉细胞中的浓度很高。已有研究表明Tau具有调节钙离子水平、维持渗透压平衡、提高机体抗氧化能力等生理功能。Tau已作为饲料添加剂应用于畜禽生产,但尚不清楚Tau对肌肉细胞蛋白质合成、增殖等的影响和作用机理。富含AT结合域蛋白4b(AT-rich interaction domain 4b,arid4b)是一个新发现的转录因子,在细胞生长和分化过程中发挥重要作用,但尚未报道arid4b在细胞增殖和蛋白质合成中的功能及其分子机理。因此,本研究拟揭示arid4b在Tau调节肌肉细胞增殖和蛋白质合成过程中的介导作用及其分子机理。本实验以小鼠成肌细胞C2C12为研究对象。分别添加0、60、120、180、240μM的Tau至C2C12细胞培养液中,利用CCK-8试剂盒检测细胞数量变化,结果表明,随着Tau浓度的增加,细胞数量逐渐增加,在120μM处达到最高,随后逐渐下降;应用SUn SET非放射法检测蛋白质合成速率和bCA蛋白定量试剂盒检测细胞总蛋白质含量,结果表明,随着Tau浓度的增加,细胞蛋白质合成速率和总蛋白质含量逐渐增加,并在120μM处达到峰值,随后逐渐下降。Western blotting和q RT-PCR检测发现,120μM的Tau能显著上调m TOR磷酸化和arid4b蛋白及m RNA水平。以上结果证明,Tau能够剂量依赖性地调节C2C12细胞增殖和蛋白质合成,并且过量的Tau具有抑制作用。实验进一步探究了arid4b对C2C12细胞增殖和蛋白质合成的影响。添加最适浓度Tau(120μM)后,AKT磷酸化和arid4b蛋白水平显著增加,而PI3K抑制剂LY 294002完全阻断了Tau对AKT磷酸化和arid4b表达的促进作用。q RT-PCR检测结果表明PI3K抑制完全阻断了Tau对arid4b的m RNA表达的促进作用。这些结果提示,PI3K是Tau调节arid4b表达水平的关键信号分子。向体外培养的C2C12细胞中添加最适浓度Tau同时敲低arid4b,结果表明arid4b敲低阻断了Tau对细胞数量、蛋白质合成速率和总蛋白质含量的刺激作用,也阻断了Tau对m TOR磷酸化和m TOR的m RNA水平的促进作用。应用CRISPR-d Cas9方法激活arid4b基因表达,实验结果表明,arid4b基因激活提高了C2C12细胞数量、蛋白质合成速率和总蛋白质含量,以及m TOR磷酸化水平和m TOR的m RNA水平。以上数据证明,arid4b是Tau促进C2C12细胞增殖、蛋白质合成以及m TOR的m RNA表达的关键介导分子。应用染色质免疫共沉淀(Ch IP)方法鉴定arid4b与m TOR基因启动子(-1～-5000 bp)的可能结合位点。Ch IP-PCR检测结果发现,arid4b、H3K27ac和H3K27me3均与m TOR基因启动子中的-4591～-4368 bp位点结合;Ch IP-q PCR进一步检测发现Tau刺激arid4b结合m TOR基因启动子的量。Western blotting检测表明,arid4b敲低和基因激活不影响H3K27ac和H3K27me3的蛋白水平。Ch IP-q PCR检测发现,arid4b的敲低或基因激活不影响H3K27me3与m TOR基因启动子的结合,但分别降低或增加H3K27ac与m TOR基因启动子的结合。以上数据证明,Tau促进arid4b结合m TOR基因启动子的量,从而促进H3K27ac与m TOR启动子的结合和激活m TOR基因转录。综上所述,Tau以剂量依赖性的方式调节C2C12细胞增殖和蛋白质合成;arid4b是Tau促进C2C12细胞增殖、蛋白质合成以及m TOR的m RNA表达的关键介导分子。本研究揭示了arid4b介导Tau调节m TOR基因转录从而促进肌肉细胞蛋白质合成和增殖的分子机理,为Tau应用于畜禽肌肉生长发育和蛋白质的产量的提升提供了深入的理论依据。

关键词： arid4b 细胞增殖 C2C12 mTOR 蛋白质合成牛磺酸

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arid4b基因沉默对人肝癌细胞HepG2增殖与凋亡的影响

ARID4B基因沉默对人肝癌细胞HepG2增殖与凋亡的影响

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作者：王晓辉承德医学院

学位级别：硕士

肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)(简称肝癌)是世界范围内最常见且恶性程度最高的恶性肿瘤之一。由于肝癌早期诊断率低,晚期失去手术机会,所以,尽管目前以手术为主的多学科的联合治疗使肝癌的5年生存率得到了较大提高,但肝癌的... 详细信息

肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)(简称肝癌)是世界范围内最常见且恶性程度最高的恶性肿瘤之一。由于肝癌早期诊断率低,晚期失去手术机会,所以,尽管目前以手术为主的多学科的联合治疗使肝癌的5年生存率得到了较大提高,但肝癌的高发病率与致死率仍是目前亟待解决的难题。导致肝癌患者预后差的非常重要原因就是人们对肝癌病因及发生、发展的具体分子机制仍知之甚少。因此,研究探索与HCC发生发展密切相关的分子生物学机制对于提高诊断及治疗水平,改善预后具有十分重大的意义。AT富集区域4b(AT-rich interaction domain 4b,arid4b)基因是arid(AT-rich interaction domain)家族的一员。近年来,越来越多的研究表明,arid4b基因在乳腺癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌等多种组织中呈高表达,可能扮演癌基因的角色。已有研究发现arid4b在肝癌组织中呈高表达,并发现其高表达与肿瘤数目、血管浸润、Edmondson-Steiner分级以及肿瘤淋巴结转移分期密切相关,但arid4b在肝癌发生及发展过程中的作用尚不明了。本研究拟应用siRNA干扰技术在肝癌细胞中沉默arid4b基因的表达,探讨其对肝癌细胞增殖及凋亡的影响及其可能的分子机制,以期为肝细胞癌的早期诊断、治疗提供新的潜在分子靶点。第一部分arid4b基因在人肝癌细胞中的表达目的:从细胞水平检测arid4b在不同肝癌细胞株中的表达情况。方法:利用RT-qPCR技术和Western blot分别检测arid4b基因在人正常肝细胞株LO2、人肝癌细胞株HCCLM3、Hep3b、Hep G2、以及Huh-7中的mRNA和蛋白表达水平;结果:结果显示,与人正常肝细胞株LO2相比,人肝癌细胞株Hep3b、Huh-7中arid4b基因mRNA和蛋白表达水平相对较低(P0.05)。结论:与人正常肝细胞株LO2相比,arid4b基因在不同人肝癌细胞株中表达水平不同,其中在Hep G2中具有较高表达。第二部分特异性干扰序列siRNA对arid4b干扰效果的鉴定及筛选目的:鉴定siRNA的干扰效果,筛选最佳干扰序列并确定其最佳作用时间与浓度。方法:将设计合成的两条针对arid4b基因的靶向siRNA序列siRNA-1、siRNA-2以及二者等比例混合序列siRNA-1+2通过脂质体LipofectamineTM2000转染至Hep G2细胞后,用RT-qPCR技术及Western blot检测干扰效率,筛选出最佳干扰序列并确定其最佳作用时间与浓度用于下一步实验。结果:***最佳干扰序列相比于空白对照组,人肝癌细胞株Hep G2转染阴性对照序列后,arid4b的mRNA与蛋白表达量变化无明显差异(P>0.05);转染干扰序列siRNA-1、siRNA-2、siRNA-1+2后,均不同程度上抑制了人肝癌细胞株Hep G2中arid4b mRNA与蛋白的表达(P4、48和72小时后采用RT-qPCR技术与Western blot法检测干扰效果,与阴性对照组相比,转染48小时后arid4b mRNA与蛋白相对表达量最低(P48小时后利用上述方法检测不同浓度的siRNA-1+2干扰效果。结果显示,与阴性对照组相比,siRNA-1+2(60nmol/L)能够明显的下调人肝癌细胞Hep G2中arid4b基因的mRNA与蛋白表达(Parid4b mRNA的抑制率达到(70.54±0.53)%,蛋白抑制率为(60.00±9.17)%。结论:应用siRNA干扰技术,将arid4b基因特异性靶向siRNA序列转染人肝癌细胞株Hep G2,能够成功介导arid4b基因沉默,达到靶向下调arid4b基因表达的目的。第三部分arid4b基因沉默对人肝癌细胞Hep G2增殖与凋亡的影响目的:探讨arid4b基因对人肝癌细胞株的增殖与凋亡的影响及其可能的分子机制。方法:1.转染siRNA靶向沉默arid4b基因后,CCK-8法检测细胞的生长情况;2.采用流式细胞术检测沉默arid4b后对肝癌细胞细胞周期及凋亡的影响;3.采用

关键词：肝细胞癌 arid4b RNA干扰细胞增殖细胞凋亡

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肝组织中arid4b和DSN1蛋白表达水平在肝细胞癌患者预后评估中的价值

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国际消化病杂志 2020年第6期40卷 423-430页

作者：闫春伟田立蕊张璐秦皇岛市第三医院病理科 066000 延安大学附属医院肿瘤科 716000

目的探索arid家族富含AT的相互作用域4b(arid4b)以及Nnf1的剂量抑制因子(DSN1)蛋白表达水平在肝细胞癌(HCC)患者预后评估中的作用。方法使用癌症基因组图谱(TCGA)和基因表达数据库(GEO)中的数据来分析HCC中arid4b和DSN1的表达。所有组... 详细信息

目的探索arid家族富含AT的相互作用域4b(arid4b)以及Nnf1的剂量抑制因子(DSN1)蛋白表达水平在肝细胞癌(HCC)患者预后评估中的作用。方法使用癌症基因组图谱(TCGA)和基因表达数据库(GEO)中的数据来分析HCC中arid4b和DSN1的表达。所有组织样本均取自2016年6月至2017年6月在秦皇岛市第三医院外科接受肝切除手术且术前未行化学治疗或放射治疗的HCC患者。取新鲜冷冻的130对HCC组织和邻近非癌肝组织(ANLT)样品,采用实时定量聚合酶链反应(real-time qPCR)检测arid4b mRNA和DSN1 mRNA的表达水平。对130例经37%甲醛溶液固定、石蜡包埋的HCC组织样品进行免疫组织化学分析,以检测arid4b和DSN1在HCC组织中的表达水平并确定其临床意义。结果生物信息学分析、RT-PCR结果表明,与ANLT相比,arid4b和DSN1在HCC组织中高表达(Parid4b高表达与肿瘤结节数(P=0.042)、TNM分期(P=0.001)密切相关。DSN1高表达与性别(P=0.035)、甲胎蛋白(AFP)(P=0.005)、肿瘤结节数(P=0.023)密切相关。此外,Kaplan-Meier和Cox比例风险分析表明,arid4b和DSN1高表达与HCC患者的不良生存率显著相关,并且arid4b和DSN1是HCC患者整体生存和无病生存的独立预后因素。结论arid4b和DSN1可作为预测HCC患者预后的生物学标志物。

关键词：肝细胞癌 arid4b DSN1 总体生存率无病生存率

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miR-519b-3p表达与局部晚期直肠癌患者术前放化疗应答的相关性及机制研究

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肿瘤学杂志 2019年第7期25卷 627-633页

作者：罗加林刘鲁迎沈金闻张娜孙权权刘鹏卢珂朱远中国科学院肿瘤与基础医学研究所中国科学院大学附属肿瘤医院浙江省肿瘤医院

[目的]研究miR-519b-3p表达与局部晚期直肠癌术前放化疗应答的相关性,并探讨miR-519b-3p是否通过靶向作用arid4b提高局部晚期直肠癌患者术前放化疗的反应性。[方法 ]实时定量PCR检测局部晚期直肠癌患者miR-519b-3p的表达水平,用miR-519b... 详细信息

[目的]研究miR-519b-3p表达与局部晚期直肠癌术前放化疗应答的相关性,并探讨miR-519b-3p是否通过靶向作用arid4b提高局部晚期直肠癌患者术前放化疗的反应性。[方法 ]实时定量PCR检测局部晚期直肠癌患者miR-519b-3p的表达水平,用miR-519b-3p模拟物或抑制剂转染HCT116或SW480细胞,体外验证其表达水平与放化疗反应的相关性;双荧光素酶报告实验用于检测miR-519b-3p与arid4b之间的相互作用;通过重组质粒构建及细胞转染调节相关基因在细胞内的表达,通过建立裸鼠异位移植瘤模型,在体验证miR-519b-3p对arid4b的调节作用。[结果]实验发现miR-519b-3p表达与局部晚期直肠癌患者对pCRT的反应性相关,miR-519b-3p在局部晚期直肠癌应答患者中呈现为高表达。miR-519b-3p的过表达增强了体外放化疗的反应性。在机理上,我们发现miR-519b-3p直接与arid4b mRNA的3′UTR结合,其表达与miR-519b-3p表达呈负相关。功能实验显示miR-519b-3p以arid4b依赖方式直接与直肠癌患者对术前放化疗的反应密切相关。[结论] miR-519b-3p通过靶向作用arid4b提高局部晚期直肠癌患者术前放化疗的反应性。

关键词：局部晚期直肠癌术前同步放化疗 miR-519b-3p arid4b

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MicroRNA-486在造血细胞红系分化中的表达及机制研究

MicroRNA-486在造血细胞红系分化中的表达及机制研究

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作者：孙燕安徽医科大学

学位级别：硕士

MicroRNA (miRNA)是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子。miRNA主要在转录和转录后发挥对基因的调控作用，包括造血干细胞的自我更新和分化过程，但其在造血细胞分化的表达及其对分化的调控作用并不清楚。 Micr... 详细信息

MicroRNA (miRNA)是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子。miRNA主要在转录和转录后发挥对基因的调控作用，包括造血干细胞的自我更新和分化过程，但其在造血细胞分化的表达及其对分化的调控作用并不清楚。 MicroRNA‐486（miR‐486）首先在人胎肝组织中被鉴定，因为人胎肝组织是造血增殖分化最旺盛的组织之一，利用经典方法从胎肝组织中鉴定的miRNA无疑是高丰度并可能参与造血生成过程调节的重要miRNA。miR‐486基因组学分析表明该基因（Gene ID：619554）位于8号染色体Ankyrin‐1（Ank‐1）基因的第40个内含子（8p11.21位点）。Ank‐1在肌肉组织、红细胞及脑组织等组织中广泛存在，但与造血干细胞调控的关系仍然不清楚。本论文将对miR‐486在造血干细胞分化中的表达变化及调控机制进行阐述。本课题首先利用实时定量PCR（real‐time PCR）方法检测了小鼠各脏器及血液中miR‐486的表达情况，结果发现miR‐486在血液、肌肉和心肌中高表达,并且其在造血细胞中表达量最高。我们课题组前期研究工作基础：在比较慢性粒细胞白血病（CML）和正常CD34+细胞MicroRNA表达谱时发现miR‐486在CML CD34+细胞高表达，进一步证明miR‐486与CML bCR‐AbL融合基因的促红系分化相关。第二，分离人脐带血CD34+细胞，并在含有不同造血生长因子组合的培养体系中进行分化诱导并利用流式细胞仪检测造血细胞分化效率，同步利用RT‐QPCR方法检测miR‐486的表达。结果发现随着造血干细胞向红系分化，miR‐486表达水平随之增高;第三，文献调研显示：GATA1是第一个被识别也是最重要的GATA家族因子，在红系细胞中大量表达，同时也是在红系分化和成熟过程中起关键作用的中心转录因子，许多具有红系特异功能的基因均受GATA1的调控。我们通过慢病毒介导的GATA1沉默策略，沉默脐带血CD34+细胞GATA1的表达，并同步检测miR‐486的表达水平。结果发现GATA1的沉默效率可以达到82%，可以有效阻断CD34+细胞向红系分化，同时miR‐486的表达水平也明显降低。克隆形成实验,第10天时计数红系集落，对照组红系集落数为54±4.89，GATA1沉默组红系集落数为16±5，P＜0.05，结果表明GATA1沉默抑制脐带血CD34+细胞的红系分化，与分化实验结果相符。以上结果均证明了miR‐486在造血干细胞红系分化过程中起到重要的作用。 MicroRNA通过3’UTR调控靶基因表达并发挥其生物学效应。单一MicroRNA可以调控多个靶基因的表达，而单一靶基因也可受到多个MicroRNA的调控。通过靶基因的分析可以预测MicroRNA的生物学功能。我们利用Targetscan6.2检索发现miR‐486存在多个预测靶基因，其中FOXO1，PTEN，arid4b等与白血病发病密切相关。为此我们克隆了arid4b基因的3′UTR并构建了PGL‐3M荧光素酶报告载体,将报告载体和miR‐486表达载体共转染HEK293细胞，并测定荧光素酶报告活性。结果以对照组MCS的相对荧光强度为1，miR‐486组相对荧光强度为0.631±0.083，miR‐486组荧光强度降低了37%。以上结果表明miR‐486有可能通过抑制arid4b发挥生物学功能。综上，本研究结果可以得出以下结论：miR‐486参与造血干细胞分化的调节，是一种与红系造血分化密切相关的microRNA，并有可能通过其靶基因arid4b发挥生物学功能。

关键词： miR-486 造血干细胞分化 GATA1 arid4b

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